专利名称:包括酶消化步骤的提取dna的方法
本发明涉及从植物材料开始(更特别地从藻类开始)提取DNA的方法，所获得的DNA准备通过PCR进行扩增或者被提取以便大量使用。
本发明可以应用于不同的工业领域，尤其是化妆品工业或生物技术工业(通过改进应用于从植物中和特别是从藻类中提取的DNA的聚合酶链式反应(PCR)方法)。
在提取DNA的技术领域：
中，为了分析或再生植物物种的目的，优选对原生质体进行操作。
这些原生质体的产生要求酶促水解细胞壁，从而使得能够更容易地抽提或标记在原生质体的细胞核中含有的DNA。
另外，在分析和/或再生植物物种的情况中，寻求在原生质体的产生过程中保持细胞的生存力，特别是当为了最终产生出完整植物时。
酶促水解细胞壁从而产生原生质体(特别是藻类)的操作条件通常如下(例如Araki等人，1998.Journal of Marine Biotechnology，6193-197)-在一般含有蛋白酶(例如木瓜蛋白酶)、渗透剂(甘露醇)和其中pH调节至7.5的缓冲液MES的介质中进行酶预处理；-由酶混合物(离析酶、纤维素酶...)、渗透剂和其中pH调节至6.5的缓冲液MES所构成的酶浸解(macération)(或细胞壁的酶促水解)；温育的最佳条件是2小时30分钟的持续时间和22℃的温度。
不过，这样的操作条件明显地用于实验性的应用和保持脱去细胞壁的细胞的生存力。
另一种提取技术采用研碎植物材料特别是藻类以提取DNA这样的操作。该提取技术受到壁中存在的多糖的限制，所述多糖减少所提取的DNA的溶解度和/或阻碍为了通过PCR技术来扩增DNA的TAQ聚合酶的正确结合。
因此，本发明的目标尤其是缓解现有技术的不便之处。
更准确地，本发明的目标是提出一种提取DNA的方法，其使得能够提供适合于工业规模的数量。
本发明的目标还在于提供概念简单和实施容易的这样的方法。
这些目标以及后来出现的其他目标由于本发明而达到，本发明的目标是提取植物材料的DNA的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤-在大约5至大约7的pH以及大约35℃至40℃的温度下用酶浸解所述植物材料；-离心经浸解的所述植物材料的提取物，以获得含有所述植物材料的DNA的沉淀；-提取在所述沉淀中含有的所述植物材料的所述DNA；-纯化所述DNA的步骤；-扩增所述DNA的步骤。
以这样的方式，酶浸解技术和特殊操作条件的组合使得能够想到以比现有技术方法的收率明显高的收率提取DNA。
因为，细胞壁的降解和由这些操作条件引起的细胞的破裂使得能够提取比用已知方法大得多的量的DNA。
当然，这样的方法属于基本上不同于现有技术的方法，因为其导致细胞的破坏，而同时原生质体的产生是以保持细胞的生存力为目标的。
而且，酶浸解步骤避免了DNA被多糖污染，所述多糖能够限制聚合酶的结合。
因此，扩增步骤能够以非常高的收率来进行。
有利地，所述提取步骤如此进行将所述沉淀溶解在pH为大约8的盐水缓冲液中，并用苯酚(phenol)/氯仿/异戊醇(isoamyl)(25∶24∶1v/v/v)处理。
优选地，所述纯化步骤通过用异丙醇沉淀来进行。
根据一个有利的应用，该方法用于提取藻类的DNA。
将会注意到，本发明的方法还可以应用于其他植物材料，例如也含有限制PCR(聚合酶链式反应)的多糖的陆生植物。
根据第一个特殊的应用，该方法用于提取掌形藻属(Palmaria)的红藻的DNA，所述酶浸解步骤借助于含有木聚糖酶和纤维素酶的混合物的溶液来进行。
根据第二个特殊的应用，该方法用于提取江蓠属(Gracilaria)的红藻的DNA，所述酶浸解步骤借助于含有葡聚糖酶和纤维素酶的混合物的溶液来进行。
当然，通过选择合适的酶，本发明还可以应用于所有属于红藻(例如紫球藻属物种(Porphyridium sp))、绿藻(例如石莼属物种(Ulvasp)、浒苔属物种(Enteromorpha sp))或褐藻(例如墨角藻属物种(Fucus sp)、囊叶藻属物种(Ascophyllum sp))这些类群的其他藻类(大型藻类和显微藻类)。
根据一个有利的解决方案，所述纤维素酶为纤维二糖酶(celluclast)。
在前述第一种应用的情况下，所述木聚糖酶优选为Shearzym。
在前述第二种应用的情况下，所述葡聚糖酶优选为Finizym。
根据一个优选的实施方案，所述酶浸解步骤以大约6小时至大约12小时的持续时间来进行。
这样的持续时间使得能够获得细胞的充分破裂以及多糖的完全或几乎完全的降解。
根据下文中关于两个作为示例性而非限制性实施例提供的本发明实施变化形式的描述，并参考唯一的附图，本发明的其他特征和优点将会更清楚地显现出来。
正如所已经描述的，本发明的原理在于将步骤和操作条件结合在一起，所述操作条件能够增加DNA提取的收率和DNA扩增的收率。
也就是说，本发明使得能够
-通过酶促水解藻类的细胞壁而改善DNA提取的收率；-通过酶促降解污染藻类DNA的多糖而改善该DNA的聚合反应(经PCR)。
使用作为藻类DNA的预处理的酶浸解这一过程(提取DNA、去除限制例如TAQ聚合酶的结合的多糖)，以及pH(5至7)和温度(35℃至40℃)条件对于获得该结果是特别具有决定性的。
希望的应用例如为使用该方法用于为了化妆品目的而获得藻类DNA(例如滋润性活性成分...)等。
在本发明方法的范围内，下文中描述将针对下述内容来进行使用降解属于掌形藻属和江蓠属的红藻(红藻类)的细胞壁的酶(木聚糖酶、纤维素酶或葡聚糖酶)，以改善DNA的提取和其经PCR(聚合酶链式反应)的扩增。
该技术方案如下。
将属于掌形藻属或江蓠属的藻类例如掌形藻(Palmaria palmata)(Dulse)或江蓠(Gracilaria verrucosa)(Ogonori)在酶溶液存在下进行浸解，对于每种藻类所述酶溶液中的组成如下-对于江蓠，葡聚糖酶(例如Finizym novo)和纤维素酶(例如Celluclast novo)的混合物；-对于掌形藻，木聚糖酶(例如Shearzyme novo)和纤维素酶(Celluclast novo)的混合物。
可应用于这两种藻类的浸解操作条件(最低和最佳)在下面描述，浸解进行的持续时间可以为6小时至12小时。所使用的酶的量取决于待处理的藻类的重量。其表示为单位/g藻类(U/g)。作为参考，一个单位U相当于能够在40℃的温度下于1分钟内释放出1mol糖的酶的量。
对于每种藻类的水解的最佳条件描述在下表中掌形藻
江蓠
还在相同条件下进行没有酶的温育，以作为用于评价酶浸解方法的相对效用的对照。
通过测量在260nm处的吸光度来测定DNA的量。其纯度通过该比例来评价Abs 260/Abs 280nm。
参考图1，在浸解步骤(步骤1)之后是离心步骤(步骤2)，其参数为10,000g至20,000g。
在离心步骤结束后，一方面得到其中含有寡糖的上清液，另一方面得到含有经浸解的植物材料的DNA的沉淀，对所述沉淀进行提取步骤(步骤3)，然后进行纯化步骤(步骤4)。
提取步骤通过如下方式进行溶解在pH 8的盐水缓冲液中，并用苯酚/氯仿混合物处理在离心步骤结束后获得的沉淀。纯化步骤通过用异丙醇沉淀来进行。
下表提供了关于掌形藻的DNA提取的比较，其比较了传统方法(在经缓冲的介质中研碎藻类)和本发明的方法(不研碎，而是在木聚糖酶(在该情况下为Shearzyme)和纤维素酶(在该情况下为Celluclast)存在下进行温育)。
掌形藻
因此注意到，对于掌形藻，相对于传统方法来说，本发明的方法使得能够获得DNA回收的41％的增益。
下表提供了关于江蓠的DNA提取的比较，其比较了传统方法(在经缓冲的介质中研碎藻类)和本发明的方法(不研碎，而是在葡聚糖酶(在该情况下为Finizym)和纤维素酶(在该情况下为Celluclast)存在下进行温育)。
江蓠
因此注意到，对于江蓠，相对于传统方法来说，本发明的方法使得能够获得DNA回收的20％的增益。
然后将如此提取的DNA进行扩增步骤(图1中的步骤5)。
正如所已经描述的，酶浸解步骤使得能够进行掌形藻和江蓠的DNA的扩增，这是由于酶促水解了污染DNA并阻碍用于扩增的聚合酶(例如TAQ聚合酶)结合至DNA上的多糖(木聚糖或葡聚糖，或者琼脂或纤维素)。
对于属于硅藻类群的显微藻类也可以观察到该结果，并且看来可以移用于所有这样的大型藻类和显微藻类，即对于这些藻类来说，通过PCR进行的DNA扩增受限于多糖在该DNA上的结合。
权利要求
1.提取植物材料的DNA的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤-在大约5至大约7的pH以及大约35℃至40℃的温度下用酶浸解所述植物材料；-离心经浸解的所述植物材料的提取物，以获得含有所述植物材料的DNA的沉淀；-提取在所述沉淀中含有的所述植物材料的所述DNA；-纯化步骤；-扩增所述DNA的步骤。
2.根据权利要求
1的方法，其特征在于，所述提取步骤通过将所述沉淀溶解在pH为大约8的盐水缓冲液中，并用氯仿/苯酚/异戊醇处理来进行。
3.根据权利要求
1和2中任一项的方法，其特征在于，所述纯化步骤通过用异丙醇沉淀来进行。
4.根据权利要求
1-3中任一项的方法，其特征在于，所述方法用于提取藻类DNA。
5.根据权利要求
4的方法，其特征在于，所述方法用于提取掌形藻属(Palmaria)的红藻的DNA，所述酶浸解步骤借助于含有木聚糖酶和纤维素酶的混合物的溶液来进行。
6.根据权利要求
4的方法，其特征在于，所述方法用于提取江蓠属(Gracilaria)的红藻的DNA，所述酶浸解步骤借助于含有葡聚糖酶和纤维素酶的混合物的溶液来进行。
7.根据权利要求
5和6中任一项的方法，其特征在于，所述纤维素酶为纤维二糖酶。
8.根据权利要求
5和7中任一项的方法，其特征在于，所述木聚糖酶为Shearzym。
9.根据权利要求
6和7中任一项的方法，其特征在于，所述葡聚糖酶为Finizym。
10.根据权利要求
1-9中任一项的方法，其特征在于，所述酶浸解步骤以大约6小时至大约12小时的持续时间来进行。
专利摘要
本发明涉及提取植物材料的DNA的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤在大约5至大约7的pH以及大约35℃至40℃的温度下用酶浸解所述植物材料；离心经浸解的所述植物材料的提取物，以获得含有所述植物材料的DNA的沉淀；提取在所述沉淀中含有的所述植物材料的所述DNA；纯化所述DNA的步骤；扩增所述DNA的步骤。
文档编号C12P19/34GK1993465SQ20058002476
公开日2007年7月4日 申请日期2005年6月16日
发明者J·弗勒朗斯, Y·茹贝尔 申请人:南特大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan