Amo-143在制备治疗长qt综合征药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及AM0-143在制备治疗长QT综合征药物中的应用,更具体地说,本发明 设及AM0-143在制备治疗长QT综合征中促进hERG表达的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 长QT综合征化QT巧是因编码屯、肌离子通道蛋白基因突变导致屯、肌细胞膜离子通 道功能障碍而引起的一组临床综合征,临床上WQT间期延长和室性屯、动过速、尖端扭转性 室性屯、动过速灯orsadedepoints,TdP)W及发作性晕厥、SCD为特征。LQTS因基因突变 导致的称之为先天性LQTS(congenitalLongQTSyn化ome,cLQTS),而后天获得产生的称 之为获得性LQTS(acquiredLongQTSyn化ome,aLQTS)。截止目前已发现有13个基因与 cLQTS有关,其中hERG化Uamnether-a-Go-Gorelatedgene,hERG)突变导致的 2 型先天 性长QT征化QT2)占总突变的45%,为第二常见突变基因。在临床工作中,发现院内SCD很 大一部分原因都是由aLQTS所引起的,由于其和尖端扭转型室速的发病密切相关具有较高 的死亡率。目前已知aLQT的发生与多种因素相关,运些因素包括药物、屯、动过缓/速、冠屯、 病、屯、肌肥厚、屯、力衰竭、电解质异常和遗传易感性,其中药物所致的aLQTS是常见原因。
[0003] 研究表明hERG基因编码的快速激活延迟整流钟电流(rapidlyactivating componentofdelayedrectifierpotassiumcurrent,IKr)在正常的动作电位复极过程 中起关键作用。hERG基因表达量降低或通道合成障碍、n控特性改变都会使Ikf功能下调, 复极化外相电流减少导致动作电位延长,最终导致LQT2和aLQTS。其同时还是多种药物产 生屯、脏不良反应的分子祀标,与QT间期延长和TdP最为紧密相关。
[0004] 目前LQTS的治疗方法主要采取药物治疗、左屯、交感神经去除术和植入屯、脏复律 除颤器,但运些方法均存在局限性,而且不能根治。因此寻找有效的治疗手段,具有重要的 临床意义。而于遗传性疾病采取基因治疗是根治的方法之一。
[0005] 微小RNA(miRNA)是一类长约21-25nt的内源性非编码小RNA,通过与mRNA互补 结合,形成RNA诱导沉默复合体(RNA-in化cedsilencingcomplex,RISC),在转录后水平 调节祀基因的表达,抑制蛋白质的翻译或促进mRNA分解,从而对祀基因的表达起着反向调 节作用。近年来,一系列研究证实,miRNA可祀向通道蛋白,致离子通道平衡失调,诱发屯、律 失常,是潜在的屯、律失常作用祀点。目前对miR-1和miR-133直接或间接影响离子通道表 达的研究较多,主要通过抑制直接编码离子通道的祀基因导致屯、律失常的发生。运用与相 应miRNA互补的寡核巧酸序列AMOs可抑制相应miRNA的功能。研究发现在数种病理条件 下屯、律失常的发生与miRNA-1表达上调有关,而目前研究发现AMO-I可逆转miRNA-1对屯、 脏的毒害作用,证明其可作为缺血性屯、律失常潜在的治疗手段。
【发明内容】
[0006] hERG基因是位于7号染色体上,在屯、脏中编码IKr通道的a亚单位,在动作电位 3期复极化过程中起重要作用。研究已证明hERG功能改变可导致LQT2的发生。在目前技 术中,尚无药物通过促进hERG表达而LQTS。本发明人利用生物信息学网站-RegRNA网站(http://re四~na.mbc.ncUi.edu.tw),输入确定的祀基因hERG,根据相应的比分值,预测出 若干个与hERG相关的miRNA,选定miR-143,并依据其核巧酸序列制成反义核巧酸AM0-143。 在进行干预实验时,发现AM0-143能够在促进hERG的表达,治疗屯、律失常,从而完成了本发 明。 阳007] 与屯、律失常相关的基因表达谱的改变会影响屯、脏病理和生理,直接或间接影响的 功能。很多分子可W改变hERG通道蛋白功能,但运些调控机制大多缺乏特异性,其同时可 改变其它离子通道的口控或者动力学特征。miRNAs可介导基因转录后的负调控,有研究 证实miRNA可祀向通道蛋白,致离子通道平衡失调,诱发屯、律失常,是潜在的屯、律失常作用 祀点。在之前的研究中,有报道miR-212可W下调Kir2. 1表达,明显改变IKr的密度,但 miRNAs是否在LQT2和aLQTS的发病过程中起作用尚不清楚。 阳00引我们的研究表明hERG基因受miR-143的负性调控。生物信息学预测hERG与miR-143在编码区有结合位点,双蛋光素酶报告基因显示miR-143可与hERG该位点结合。 在本实验中,过表达miR-143降低了hERG的mRNA和蛋白质表达水平。蛋白降解可能是因 为mRNA降解或者抑制其翻译所致,其又由miRNA与目的基因的结合程度而定。很多动物的 miRNA与其目的mRNA不能完全结合,通常抑制目的蛋白的合成,然而却并不降解其mRNA。 而miR-143对hERGmRNA抑制和蛋白质降解水平一致,可能与其匹配高度重合,W降解hERG mRNA为主有关。运用miR-143的特异性抑制剂AM0-143可纠正miR-143对hERGmRNA和蛋 白质表达的抑制作用。激光共聚焦的实验结果与qRT-PCR及Westernblot实验相符。综 上本实验验证miR-143可W祀向hERG,负向调控其表达,其AMOs可W抑制运种调控,恢复 hERG的表达。据此,我们拟WmiR-143为潜在的治疗祀点,通过干扰其水平,调控祀目标的 表达,从而治疗相应的屯、律失常。之前的研究表明SiRNA可W纠正E637K电流及恢复其动 力学特征。因此,运个新的AM0s(AM0-143)可W作为遗传性或者获得性长QT综合征的新的 特异性治疗方案。我们需要在动物或人屯、肌细胞中验证运些miRNA对hERG的调控作用。
【具体实施方式】
[0009] 材料与方法
[0010] 1.1实验仪器与试剂
[0011] 1.1.1主要实验仪器
[0012] 表1实验仪器名称和生产厂家
[0013]
締酷胺凝胶上,然后转移到硝酸纤维素膜上。膜封闭用5%的脱脂奶粉,接着用兔多克隆抗hERG的抗体在4°C下解育过夜。在TBST中将膜洗涂=次,然后在室溫下用山羊抗兔IgG解 育1小时。印迹处理用SuperSi即alWestPico化学发光底物(PierceBiotechnology公 司,美国),并使用GE公司的成像系统。
[0022] 实验表明,我们采用生物信息学预测,利用双巧光素酶报告基因法、qRT-PCR、 Westernblot、激光共聚焦验证了miR-143可W负性调控hERG表达,相应的AMOs可W沉默 其对hERG的抑制作用。我们的实验为进一步理解hERG蛋白的调控机制及从基因角度对长 QT综合征进行治疗提供了新的视角。然而,运些研究结果需要在动物模型、前期临床及临床 中进一步验证。
【主权项】
1. AMO-143在制备防治长QT综合征促进hERG表达的药物组合物中的应用。2. 如权利要求1所述的应用,其中所述AM0-143为miR-143的反义寡核苷酸序列。3. 如权利要求1或2所述的应用,其中所述长QT综合征选自2型先天性长QT征,获得 性长QT综合征中的一种或多种。4. 如权利要求1或2所述的应用,其中所述长QT综合征为心律失常的一种,可引起心 源性猝死。5. -种治疗长QT综合征的药物组合物,其特征在于含有AM0-143。6. 如权利要求5所述的药物组合物,其中所述AM0-143是miR-143的反义寡核苷酸序 列。7. 如权利要求5或6所述的药物组合物,其中所述所述长QT综合征选自2型先天性长 QT征,获得性长QT综合征中的一种或多种。8. 如权利要求5或6所述的药物组合物,其中所述所述长QT综合征为心律失常的一 种,可引起心源性猝死。
【专利摘要】本发明公开了AMO-143在制备防治长QT综合征促进hERG表达的药物组合物中的应用;以及一种治疗长QT综合征的药物组合物,其特征在于含有AMO-143。
【IPC分类】A61K48/00, A61P9/06, A61K31/7105
【公开号】CN105169414
【申请号】
【发明人】杨曦, 周建庆, 廉姜芳, 毛海燕, 黄晓燕
【申请人】宁波市医疗中心李惠利医院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月22日