一种鉴别暗纹东方鲀和条纹东方鲀鱼苗的引物和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产养殖领域，涉及一种分子生物学技术鉴定同属鱼苗方法，更具体 地说，本发明涉及利用微卫星标记对暗纹东方飩和条纹东方飩鱼苗进行准确鉴别。
【背景技术】
[0002] 暗纹东方飩（Takifugu fasciatus)隶属于飩形目（Letrodontiforms)、飩科 (Tetraodontidae)、东方飩属（Fugu)，俗称河飩、气泡鱼，属于洄游性鱼类，分布于东海、黄 海、渤海以及长江中下游，是一种经济价值极高的水产品，名列长江"四大名鱼"之首，为传 统美食中的典范。
[0003] 条纹东方飩（Takifugu xanthopterus)隶属于飩形目（Letrodontiforms)、飩科 (Tetraodontidae)、东方飩属（Fugu)，俗称黄鳍东方飩、花艇巴等，亦属洄游性鱼类，其与暗 纹东方飩的栖息海区和繁殖季节相近，主要分布在东海、南海、黄海及渤海，亦进入江河口。
[0004] 暗纹东方飩和条纹东方飩各具特色，因生态习性差异，两者肉质迥然不同。条纹东 方飩分布范围广，产量较高；暗纹东方飩体型较大，生长速度较快，其口感风味和营养价值 远远高于条纹东方飩。随着两种东方飩的市场需求量逐日扩大，其苗种的需求量亦与日倶 增，因此鱼苗的来源和准确鉴别是两种东方飩养殖的关键。但在形态学上，暗纹东方飩和 条纹东方飩的鱼苗外观体型十分相似，若无专业分类学知识，仅凭肉眼去区分极易产生混 淆。因此即使是养殖经验丰富的渔民也不能准确的去区分这两种东方飩鱼苗，一旦混合养 殖，不仅加大了后期成鱼分类处理的工作量，还会出现种间杂交，进而导致种质混杂，品质 变劣。此外，市场上两种东方飩的幼鱼也是常常混淆不清，由于暗纹东方飩和条纹东方飩市 场售价差异明显，导致有些商家为谋取经济利益，误将条纹东方飩鱼苗充当暗纹东方飩鱼 苗出售，不仅侵犯了消费者的利益，也极大影响了渔民和河飩养殖企业的经济效益。因此， 市场上迫切需求一种鉴别和区分2种东方飩的准确方法。
[0005] 基因组中的微卫星DNA以孟德尔方式遗传，呈共显性表达，且同时具有分布广、遗 传信息含量高和便于PCR检测等优点，在鱼类遗传育种研究中应用微卫星标记进行物种群 体遗传结构和多样性分析、分子遗传图谱的构建、物种演化和亲缘关系等研究，能够对不同 物种进行精确的系统学的区分，精确确定物种的进化途径和分类学地位，进而对种质资源、 基因库进行有目的保护。研究表明微卫星侧翼序列在亲缘关系较近或种属间是相当保守 的，因此，鉴于目前东方飩属鱼苗形态学鉴定的不确定性，本发明使用微卫星分子标记对2 种东方飩鱼苗进行有效鉴别和区分。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种快速准确鉴别暗纹东方飩和条纹东方飩鱼苗的方法，以 克服现有从形态学上鉴定存在主观性强且不能有效地鉴定两种鱼苗的缺陷，并且本发明在 不处死鱼苗的基础上，只需剪去少量尾鳍或其它鱼体组织部分即可进行鉴别，具有稳定性 高、操作简单重复性好、实用性强并可快速准确鉴别等优点。
[0007] 本发明的技术方案是
[0008] -种暗纹东方飩和条纹东方飩幼鱼的鉴别引物，命名为F-FXF147,序列如下：
[0009] F :5' -AACAAGTGCATGGCTGAGTG-3，（SEQ ID No. 1)
[0010] R :5,-TTGACAGATGTGGAGCTGATG-3'（SEQ ID No. 2)
[0011] 本发明暗纹东方飩和条纹东方飩鱼苗的鉴别方法，包括下列步骤：
[0012] 1)提取2种东方飩鉴定样品DNA ;
[0013] 2)用上述引物对步骤1)提取的样本进行DNA扩增，获得PCR产物；
[0014] 3)用2. 2 %琼脂糖凝胶（EB染色）电泳对PCR产物进行检测，300bp左右大小的条 带为暗纹东方飩，600bp左右大小的条带为条纹东方飩。
[0015] 本发明的PCR扩增反应体系可采用由上海皆益生物科技有限公司提供的2XTaq Plus Mix，里面包含PCR反应体系必需成分，只需一次性加入即可，操作简单、减少实验误 差。
[0016] 本发明是首次基于分子生物学手段建立起对暗纹东方飩和条纹东方飩鱼苗进行 鉴别的方法，利用来自暗纹东方飩合成、筛选的特异微卫星引物F-FXF147,建立了一个普通 的PCR反应就可以实现鉴别2种东方飩鱼苗的新方法。本方法无需依赖专业的鱼类分类学 知识，也不需要具有长期从事鱼类鉴别的丰富经验，仅需取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳 检测得到稳定、清晰、差异明显的扩增条带，成本低，操作简单，实用性强，对东方飩养殖生 产具有一定的指导作用。
【附图说明】
[0017] 图I :F_FXF147引物在暗纹东方飩和条纹东方飩2个群体中的扩增结果。
[0018] M-Marker ; 1-12为条纹东方飩；13-24为暗纹东方飩。
【具体实施方式】
[0019] 以下结合附图实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0020] 实施例
[0021] 1.暗纹东方飩和条纹东方飩鱼苗基因组DNA的提取及定量
[0022] 采用上海捷瑞生物工程细胞/组织基因组DNA提取试剂盒快速提取2种东方飩鱼 苗尾鳍（10~30mg)的基因组DNA(暗纹东方飩和条纹东方飩均来自于江苏中洋集团股份 有限公司，经形态学综合鉴定，确定为暗纹东方飩和条纹东方飩各12尾），试剂盒提取样品 DNA较之传统方法提取样品DNA具有提取效率高、速度快、提取DAN质量高等特点。
[0023] 2.微卫星位点的筛选及引物的合成
[0024] 首先利用北京百泰克生物公司RNA提取试剂盒提取1中所鉴定的暗纹东方飩鱼苗 的RNA，并交给上海晶能生物公司进行Illmina Hiseq2000转录组高通量测序，采用Tophat 软件进行序列的组装和拼接，然后用SSRHunt软件预测序列中可能存在的微卫星位点，利 用Primer5. 0软件设计引物，并由上海捷瑞生物公司合成其引物。
[0025] 3.暗纹东方飩和条纹东方飩鱼苗鉴别引物的筛选
[0026] 利用1中两种东方飩尾鳍样品的DNA，采用PCR仪检验2中引物在暗纹东方飩和条 纹东方飩鱼苗中的扩增情况
[0027] I) PCR扩增体系
[0028] PCR 扩增反应体系（20 μ L)如下：灭菌水（7.4 μ L)，2XTaq Plus Mix(IOyL)由 上海皆益生物科技有限公司提供，IOuM正反引物（各0.8 μ L)由上海捷瑞生物工程有限公 司提供，东方飩幼鱼尾鳍模板DNA(1 μ L)。
[0029] 2) PCR扩增反应
[0030] 在PCR扩增仪上于95°C预变性5min ;30个循环：94°C变性30sec，52°C下退火 30sec，72°C延伸 30sec ;最后 72°C延伸 5min，4°C保存。
[0031] 3)琼脂糖凝胶电泳检测
[0032] 取PCR扩增反应产物5 μ L进行琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色并用紫外凝胶成像 系统拍照。
[0033] 4)鉴别引物的确定
[0034] 挑选出能在暗纹东方飩和条纹东方飩鱼苗中成功扩增且产物经3)检测可得出明 显差别条带的一对引物，所述的引物序列为：
[0035] F :5' -AACAAGTGCATGGCTGAGTG-3'（SEQ ID No. 1);
[0036] R :5,-TTGACAGATGTGGAGCTGATG-3'（SEQ ID No. 2)。
[0037] 此对引物所得产物的电泳图如图1所示，根据电泳条带与标准Marker比较：300bp 左右大小的条带为暗纹东方飩，600bp左右大小的条带为条纹东方飩。
【主权项】
1. 一种鉴别暗纹东方飩和条纹东方飩鱼苗的引物，其特征在于所述引物命名为 F-FXF147,其序列如下： F:5' -AACAAGTGCATGGCTGAGTG-3'； R:5' -TTGACAGATGTGGAGCTGATG-3'。2. -种暗纹东方飩和条纹东方飩鱼苗的鉴别方法，其特征在于，包括下列步骤： 1) 提取待鉴定的2种东方飩鱼苗DNA; 2) 用权利要求1所述引物对2种东方飩鉴定样本进行DNA扩增，获得PCR产物； 3) 用2. 2 %琼脂糖凝胶EB染色电泳对PCR产物进行检测，300bp左右大小的条带为暗 纹东方飩，600bp左右大小的条带为条纹东方飩。
【专利摘要】本发明涉及一种鉴别暗纹东方鲀和条纹东方鲀鱼苗的引物和方法，本发明所述一对引物命名为F-FXF147，其序列如SEQ？ID？No.1和2所示。鉴定时用普通DNA提取试剂盒提取2种东方鲀鱼苗基因组DNA并用该对引物对2种东方鲀DNA样品进行PCR扩增，再用2.2％琼脂糖凝胶(EB染色)电泳对PCR产物进行检测，300bp左右大小的条带为暗纹东方鲀，600bp左右大小的条带为条纹东方鲀。本发明仅需剪取少量尾鳍而不处死鱼苗的基础上即可进行鉴别，具有稳定性高、重复性好、实用性强、操作简单并可快速准确鉴别等优点。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105176989
【申请号】
【发明人】尹绍武, 李欣茹, 赵诚, 张宏叶, 王小鲁, 张国松
【申请人】南京师范大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月13日