烙点琼脂糖封胶液，室溫保存;所述 10%十二烷基横酸钢按步骤(3)①所述的10%十二烷基横酸钢的制备方法制备的得到。
[0104]⑥在低烙点琼脂糖封胶液完全凝固后，将步骤(6)⑤封有低烙点琼脂糖封胶液的 大双层玻璃板移至电泳槽的槽内，向电泳槽槽内加入1 X电泳缓冲液，所述1 X电泳缓冲液 与步骤(3)①中所述的IX电泳缓冲液相同，接通电源，起始时用低电流IOmA电泳或用低电 压IOOV电泳，待大双层玻璃板之间的百合总蛋白质溶解液完全从大双层玻璃板之间的固定 化pH梯度胶条中走出，看到漠酪蓝指示剂呈一条直线后，再加大电流为20mA电泳或加大电 压为300V电泳，待漠酪蓝指示剂达到该大双层玻璃板底部边缘时即停止电泳；电泳结束后， 擦开大双层玻璃板，取出大双层玻璃板之间的聚丙締酷胺凝胶，并切角W作记号。
[01化](7)染色和脱色
[0106]预先将200ml固定液加入塑料盒中，再将步骤(6)⑥取出的聚丙締酷胺凝胶放入固 定液中，盒上做标记，将塑料盒放在摇床上W40rpm的转速摇动化;然后倒掉塑料盒内的固 定液，用超纯水清洗塑料盒内的聚丙締酷胺凝胶2次，加入附加 20 %甲醇的考马斯亮蓝G250 染液200ml，在摇床上W40rpm的转速摇动染色12h，弃去染色液，用超纯水漂洗至没有考马 斯亮蓝G250残渣;加入200ml脱色液，在摇床上W40巧m的转速摇动脱色2d，所述附加 20 %甲 醇的考马斯亮蓝G250染液与步骤(3)②中所述的附加 20%甲醇的考马斯亮蓝G250染液相 同，所述脱色液与步骤(3)②中所述的脱色液相同。
[0107] 所述固定液的制备:量取乙醇400ml、乙酸400ml，用超纯水定容至1L。
[010引（8)图像采集
[0109] 将步骤(7)经脱色的聚丙締酷胺凝胶置于校准型光密度仪上拍照并保存文件得到 百合总蛋白双向电泳差异蛋白质图，校准型光密度仪型号为GS900。本发明方法获得的百合 总蛋白双向电泳差异蛋白质图谱如图2所示。图2蛋白质点多，点分布均匀，背景清晰。
[0110] 对照
[0111] 对照除实施例1中步骤(5)②聚焦中等电聚焦程序中步骤Sl和S2的时间为0.化外， 其余各步骤均与实施例1相同，即对照步骤(5)②聚焦中等电聚焦程序如下： 歩骤 电压 梯度 时间 Sl除盐 250V 快速 0.5h S2除盐 JOOOV 快速 〇,5h
[0112] 掛升压 9000V 线性 4.谢 S4 巧化 9000V 快遽 65000 v/h %保持 500V 快速 化
[0113]对照获得的百合总蛋白双向电泳差异蛋白质图谱如图3所示，图3中蛋白质点少。
【主权项】
1.百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，其特征在于包括以下步 骤： (1) 百合总蛋白质的提取： ① 称取1~2g新鲜百合叶片或鳞茎于-20°c预冷的研钵中，加入10~20ml液氮，快速研 磨至粉状； ② 量取20ml附加1 %苯甲基磺酰氟和0.1 %二硫苏糖醇的10 %三氯乙酸-丙酮溶液，分2 ~3次清洗研钵，将研钵内粉状物清洗至50ml离心管中，迅速置于-20°C冰箱中保存过夜;取 过夜的离心管于离心机上20000印111，离心2()1]1；[11 ;弃上清； ③ 加入20ml附加1 %苯甲基磺酰氟和0.1 %二硫苏糖醇的80%的丙酮溶液，用枪头把离 心管内的沉淀弄碎，振荡，于_20°C冰箱中放置2h后，取出离心管于离心机上20000rpm，离心 15min，弃上清； ④ 重复步骤(1)③2次； ⑤ 在超净工作台上将得到的沉淀转移到经干燥灭菌的培养皿中，待沉淀吹干后，即为 提取的蛋白质干粉，将蛋白质干粉收集到离心管中，_80°C保存； (2) 百合总蛋白质的纯化和溶解 ① 称取步骤（1)⑤提取的蛋白质干粉40~50mg于底部连接有离心管的过滤柱中，按每 Img蛋白质干粉加7M水化液15μ1的比例，加入7M水化液，加入7M水化液后室温放置Ih; ② 将底部连接有离心管的过滤柱于离心机上12000rpm，离心15min，然后弃去过滤柱， 将过滤柱底部连接的离心管所收集到的滤液转移至另一离心管中； ③ 加入1600~2000μ1附加0.1 %二硫苏糖醇的无水丙酮，边加边摇匀，-20°C冰箱中放 置2h后，取出离心管于离心机上15000rpm，4°C离心30min，弃上清； ④ 加入1ml在4°C预冷的附加0.1%二硫苏糖醇的超纯水，在离心机上15000印111，4°〇离 心25min，弃上清； ⑤ 加入附加2yl/ml载体两性电解质和0.01%二硫苏糖醇的71水化液150~20(^1即为 百合总蛋白质溶解液； (3) 百合总蛋白质溶解液的质量检测 ①将双层玻璃板竖直夹在灌胶架上，且双层玻璃板的上方朝上并使双层玻璃板上方顶 端面为水平，在双层玻璃板之间灌入10%的分离胶，灌入的所述分离胶的上方顶面距离双 层玻璃板中的短玻璃板的上方顶端面2cm，在所述分离胶上方顶面用无水乙醇封面，待所述 分离胶聚合且所述分离胶与无水乙醇分层后，倒去无水乙醇，然后在所述分离胶上方顶面 灌入5 %的浓缩胶，灌入的所述浓缩胶的上方顶面距离双层玻璃板中的短玻璃板的上方顶 端面lcm，插入点样梳，待所述浓缩胶聚合凝固后，将此双层玻璃板转入蛋白质电泳槽中，并 在蛋白质电泳槽中加入IX电泳缓冲液，拔去点样梳，形成加样孔，用注射器针尖将加样孔 内壁凸起的浓缩胶去掉使加样孔内壁平滑;取步骤步(2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液4μ 1，加入2μ1的溴酚蓝指示剂混匀后加入加样孔中，加样完毕后，接通电源，起始时，用低电流 5mA电泳或用低电压50V电泳，待溴酚蓝指示剂成一条线后，再加大电流为IOmA电泳或加大 电压为150V电泳，待溴酚蓝指示剂达到该双层玻璃板底部边缘时停止电泳;所述双层玻璃 板为宽度相等长度不等的两块玻璃板重叠放在一起且长玻璃板和短玻璃板一端对齐，长玻 璃板和短玻璃板没有对齐的一边为双层玻璃板的上方，其长玻璃板和短玻璃板的宽度均为 IOcm，长玻璃板的长度为8cm，短玻璃板的长度为7cm; ②停止电泳后，撬开双层玻璃板，从双层玻璃板中取出凝胶置于附加20%甲醇的考马 斯亮蓝G250染液中染色，再用脱色液脱色后，置于校准型光密度仪上拍照并保存文件，如果 胶图条带清晰且无拖尾，表明所提取出来的蛋白质质量好;继续进行下一步百合总蛋白质 的浓度测定； (4) 百合总蛋白质的浓度测定 取步骤（2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液采用Bradford法测定其百合总蛋白质的浓 度，测定的百合总蛋白质浓度在3ygAU以上，将步骤步(2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液置 于-80°C保存； (5) 第一向等电聚焦 ① 上样水化 用与步骤(2)⑤中相同的附加2μ1 /ml载体两性电解质和0.01 %二硫苏糖醇的7M水化液 将步骤(4)中于-80°C保存的百合总蛋白质溶解液稀释至3ygAU，取所稀释的浓度为3ygAU 的百合总蛋白质溶解液300μ1放入聚焦盘的槽内，做好标记，把预先解冻的固定化pH梯度胶 条的保护膜去掉，然后将固定化PH梯度胶条沿聚焦盘的一端放入聚焦盘的槽内与聚焦盘槽 内的百合总蛋白质溶解液结合，让聚焦盘槽内的百合总蛋白质溶解液被固定化PH梯度胶条 吸收2_3min，再在固定化pH梯度胶条上加入2~3ml矿物油水化14~16h; ② 聚焦 将盐桥用ddH20润湿后置于聚焦盘两端;对好正、负极，盖上盖子，设置等电聚焦程序进 行聚焦，所述的等电聚焦程序如下：③ 第一次平衡； ④ 第二次平衡； (6) 第二向 SDS-PAGE电泳； (7) 染色、脱色； (8) 图像采集，获得百合总蛋白双向电泳差异蛋白质图谱。
【专利摘要】本发明公开一种百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法。该方法在百合总蛋白质的提取中设置转速为20000rpm，并反复沉淀离心至少3次，使得提取出来的百合总蛋白质颜色较白，质量好；增加了蛋白质的质量检测步骤，采取跑十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶的方式检测所提取出来蛋白质的质量，避免了后续第一向等电聚焦效果不好的问题。改进了第一向等电聚焦过程中聚焦程序，将聚焦程序中的步骤S1和S2两个除盐步骤的时间延长至2.5h，较好地去除了蛋白质的盐分，从而较好地完成了聚焦程序。本发明方法获得的百合总蛋白双向电泳差异蛋白质图谱背景清晰，蛋白质点多，蛋白质点分布均匀。
【IPC分类】G01N27/447
【公开号】CN105527332
【申请号】CN201610027384
【发明人】张艺萍, 王继华, 杨秀梅, 瞿素萍, 许凤, 王丽花, 苏艳, 张丽芳
【申请人】云南省农业科学院花卉研究所
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年1月18日