一种利用基因组改造的重组大肠杆菌发酵生产l-脯氨酸的方法
【技术领域】
[0001] -种利用基因组改造的重组大肠杆菌发酵生产L-脯氨酸的方法，属于微生物基因 工程领域。
【背景技术】
[0002] L-脯氨酸(L-Proline)是一种亚氨基酸，L-脯氨酸是合成人体蛋白质的重要氨基 酸之一，它是一种非极性氨基酸，当它整合到蛋白质中时，形成叔酰胺从而破坏蛋白质中的 α螺旋和β折叠片结构，在医药、化工、食品、农业等领域具有广泛的用途。
[0003] 随着我国医药卫生水平的提高以及化学合成工业、农业的发展，对L-脯氨酸的需 求也日益增长，良好的应用前景使得L-脯氨酸生产技术的研究受到广泛的关注。L-脯氨酸 的生产方法主要有三种:化学法、水解提取法和微生物发酵法。其中，通过化学法以及水解 提取法生产L-脯氨酸过程复杂，效益低，成本高，微生物发酵法以其成本低，污染少，杂质 少，纯度高等优势在工业生产中日益占主导地位。
[0004] 在微生物体内，L-脯氨酸的生产过程是，由α-酮戊二酸形成的谷氨酸，经谷氨酸激 酶(proB编码)催化下由ΑΤΡ提供磷酸基团形成谷氨酰磷酸，又在谷氨酸脱氢酶(proA编码） 作用下将谷氨酸的γ -羧基还原成谷氨酸-γ -半醛，然后自发环化形成五元环化合物Λ '二 氢吡咯-5-羧酸，再由二氢吡咯还原酶(proC编码)催化形成脯氨酸。其中脯氨酸能够反馈抑 制谷氨酸激酶，而且proB与proA是作为一个操纵子proBA进行表达的，将proBA突变成 ?仰84后能够降低脯氨酸的反馈抑制，大量生产L-脯氨酸。将pr 〇B2500替换掉重组大肠杆菌 基因组中的pr〇B500,能够进一步的提高L-脯氨酸在微生物内的积累量，而且该性状能够随 着微生物的传代而稳定存在。
【发明内容】
[0005] 本发明通过构建合适的基因组改造的重组大肠杆菌，在大肠杆菌中过量表达该谷 氨酸激酶，并能在发酵培养基中以葡萄糖为碳源，来直接获得大量的L-脯氨酸，工业应用前 景广阔。
[0006] 本发明所述的通过构建合适的重组大肠杆菌基因改造菌发酵生产L-脯氨酸，其特 征在于，通过酶切获得具有点突变的γ -谷氨酸激酶基因 pr〇B2A与质粒pET28a相连，构建重 组质粒pET28a-proB2A，然后将PCR获得的proB2500替换掉重组大肠杆菌基因组中的 proB500，构建好的基因组改造的重组大肠杆菌能在合适的培养基中，与合适的培养条件下 发酵生产L-脯氨酸。
[0007] 本发明中的具有点突变的γ -谷氨酸激酶基因 pr〇B2A从实验室已有的载体上酶切 获得，片段proB2500是依pr 〇B2A为模板，设计合适的引物，通过PCR获得的。
[0008] 本发明所述大肠杆菌可以是E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3) AputA以及 E.coli JM109等。
[0009] 本发明中的表达载体，要能够在宿主细胞中独立复制，例如有pET-28a、pKYP10、 pUC19、pAMP、pBR322 等。
[0010] 本发明中为了使具有点突变的γ-谷氨酸激酶基因能够在重组菌中稳定存在表 达，用片段proB2500替换掉重组菌基因组上的proB500
[0011] 本发明可以应用于L-脯氨酸的生产中，培养重组菌的培养基要含有微生物可以利 用的碳源、氮源、无机盐等，可以是天然培养基，也可以是合成培养基。
[0012] 本发明中发酵培养基中的碳源，有葡萄糖、淀粉、蔗糖、甘油等。
[0013] 本发明中发酵培养基中的氮源，可以是氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐类或其他含 氮化合物，还可以有酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、豆柏等有机氮源。
[0014] 本发明中发酵培养基中的无机盐，有磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、氯化 f丐等。
[0015] 重组菌的培养需要震荡或搅拌以维持菌体生长所需的氧气量。培养温度在20-37 °C，培养时间12-72小时。
[0016] 本发明的方法是通过基因组改造的重组大肠杆菌发酵生产L-脯氨酸，具有广阔的 工业应用前景。
【附图说明】
[0017] 图1是重组载体pET28a-proB2A构建图。
[0018] 图2重组载体pET28a-proB2A的单双酶切电泳图；M:DL10000DNA ladder Maker;l: 质粒经Xho I单酶切，pET28a-proB2A大小为7723bp; 2:质粒经Xho I、Hindm双酶切，得到两 条条带pET28a大小为5348bp，proB2A大小为2375bp。
[0019] 图3是proB2500替换掉重组菌基因组上的proB500后的PCR验证图；M:DL5000DNA ladder Maker; 1:原菌对照，条带大小为612bp; 2:为片段Kan_proB2500替换proB500成功 菌，条带大小为2132bp。
【具体实施方式】
[0020] -般性说明：【具体实施方式】中所用到的酶全部从TaKaRa公司购买，sanprep柱式质 粒DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均购自上海生工，具体操作完全按照试剂盒的说 明。
[0021] LB培养基：Tryptone 10g/L，Yeast extract 5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0-7.2。
[0022] 发酵培养基：Glucose 20g/L，Peptone 8g/L，K2HP〇4lg/L，NaCl 2g/L，MgS〇4〇.2g/ L，FeS〇4lmM，CaCl2〇.015g/L，（NH4)2S〇4lOg/L。
[0023] Kan抗性平板：1 %Tryptone，0.5%Yeast extract，l%NaCl，Kanamycin sulfate 50yg/mL〇
[0024] 5XKCM缓冲液：0.5M KC1，0.15M CaCh，0.25M MgCh。
[0025] L-脯氨酸的测定方法:将发酵液离心后，取上清，适当稀释后取lmL于lOmL试管中， 加入lmL冰乙酸，摇匀后加入lmL酸性茚三酮(取冰乙酸60mL、2mol/L的磷酸溶液40mL，加入 2.5g茚三酮，70 °C水浴加热溶解，用棕色试剂瓶保存冷却后的试剂。其中2mo 1/L磷酸溶液的 配置为:称取9.22g 85%的H3P〇4,加水至40mL。）摇匀后沸水浴lh，接着加入冰乙酸2mL，摇匀 后冷水冷却，然后测定515nm波长处的吸光度值。
[0026]实施例1:具有点突变的γ -谷氨酸激酶基因(pr〇B2A)的获得 [0027] 将实验室冷冻保存的含有pET28a-Ptrp2-proB2A的菌株进行活化，于37°C，220rpm 培养12-16小时，取培养后的菌液按照sanprep柱式质粒DNA抽提试剂盒说明书提取质粒，用 Xhol和Hindm双酶切胶回收获得proB2A，然后用Xhol和Hindm处理质粒pET28a，将酶处理 后的片段proB 2A、质粒pET28a用T4DNA连接酶在16 °C的条件下过夜连接，将10yL的连接液转 入JM109感受态中，挑取转化后的单菌落培养提取质粒进行酶切验证，验证正确的重组质粒 即为 pET28a_proB2A。
[0028]实施例2:片段pr〇B2500的获得
[0029] 依实施例1中构建好的重组质粒pET28a-proB2A为模板，设计一对引物PI(SEQ ID N0:2)、P2(SEQ ID N0:3)，PCR扩增得到目的基因 proB2500。
[0030] 本实施方式中proB2500基因序列见SEQ ID N0:1 [0031 ] 实施例3:基因组proB2500替换改造菌的构建
[0032] 设计一对引物P3(SEQ ID N0:4)、P4(SEQ ID N0:5)，依pKD4质粒为模板，PCR扩增 获得待融合的Kan片段，将其与实施例2中获得的片段pr〇B 2500进行融合，利用Red重组系统 将片段proB2500与基因组上的proB500进行替换，验证正确的菌株即为基因组proB 2500替换 改造菌BL21(DE3) AputA-proB2500〇
[0033] 实施例4:含有proB2A重组大肠杆菌基因组proB2500替换改造菌的构建
[0034] 将实施例3所获得的基因组proB2500替换改造菌BL21(DE3) APutA-proB2500制成 化转感受态，将实施例1中所获得的重组质粒pET28a-proB2A转入到制作的BL21 (DE3) Δ pUtA-pr〇B2500感受态细胞中，挑取转化后的单菌落培养提取质粒进行酶切验证，验证正确 的菌株即为含有proB 2A重组大肠杆菌基因组proB2500替换改造菌BL21(DE3) AputA-proB2500/pET28a-proB2A 〇
[0035] 实施例5:重组大肠杆菌基因组改造菌的发酵试验
[0036] 种子液培养:将实施例4中获得BL21(DE3) Δ PutA-proB2500/pET28a-proB2A在Kan 平板上划线，挑单菌落接种到含有相应抗生素的LB培养基中，在37°C，220rpm的条件下培养 8h〇
[0037] 发酵培养:按6 %接种量接入250mL摇瓶中的脯氨酸发酵培养基，在旋转式摇床中 30°C、220rpm培养24h，然后取发酵液检测L-脯氨酸浓度。L-脯氨酸的测定方法详见实施例 一般性说明。发酵结果显示，重组大肠杆菌获得BL21 (DE3) Δ PutA-proB2500/pET28a-proB2A 的L-脯氨酸产量达到400 · 52mg/L。
【主权项】
1. 一株发酵生产L-脯氨酸的基因组改造的重组大肠杆菌构建方法是，将具有点突变的 γ_谷氨酸激酶基因（proB2A)连接到质粒pET28a上，构建重组质粒pET28a-pr〇B 2A，然后将 PCR获得的pr〇B2500替换掉重组大肠杆菌基因组中的pr〇B500，构建好的重组大肠杆菌基因 改造菌在合适的培养基中能够生产L-脯氨酸。2. 权利要求1所述的载体、多拷贝质粒包括但不局限于pET-28a、pUC 19、ρΚΥΡ 10等。3. 权利要求1所述的proB500并不是γ -谷氨酸激酶基因 proB的全部序列，而是proB起 始密码子开始往后的500bp片段。4. 权利要求1所述的pr〇B2500并不是具有点突变的γ -谷氨酸激酶基因 pr〇B2的全部序 列，而是proB2起始密码子开始往后的500bp片段。5. 权利要求1所述的方法，其中所用到的大肠杆菌是脯氨酸分解缺陷型菌株BL21(DE3) Δ putA〇6. 权利要求1所述的增强L-脯氨酸生物合成系统活性的方法，其特征在于通过导入受 脯氨酸反馈抑制显著减少的γ -谷氨酸激酶基因（proB2A)，增加重组微生物中的该γ -谷氨 酸激酶基因的拷贝数，以及用pr〇B2500替换掉基因组中的pr〇B500来实现。 7. L-脯氨酸的生产方法，其特征是将权利要求1、5所述的重组微生物在培养基上培养， 将得到的培养物、菌体或者它们的处理物作为酶源，在葡萄糖存在下，于水性介质中使葡萄 糖转化为L-脯氨酸，再从该水性介质中提取生成的L-脯氨酸。
【专利摘要】本发明公开了一种利用基因组改造的重组大肠杆菌发酵生产L-脯氨酸的方法，该重组大肠杆菌基因改造菌携带具有点突变的γ-谷氨酸激酶基因(proB2A)，基因组中proB500被替换成proB2500。其中具有点突变的γ-谷氨酸激酶基因(proB2A)是从本实验室保存的含有该基因的重组质粒上酶切获得，proB2500是依proB2A为模板，设计合适的引物，通过PCR获得的。本发明还公开了所述大肠杆菌在L-脯氨酸生产中的应用。
【IPC分类】C12P13/24, C12N15/70
【公开号】CN105602978
【申请号】CN201610034446
【发明人】张震宇, 姚动邦, 王晓姣, 魏照辉, 黄建华
【申请人】江南大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月19日