利用黄粉虫蛹培养蝉花棒束孢的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用黄粉虫蛹培养蝉花棒束孢的方法。其操作步骤主要包括：（1）蝉花棒束孢分生孢子悬液制备；（2）无菌黄粉虫蛹制备；（3）蝉花棒束孢感染黄粉虫蛹；（4）蝉花孢梗束诱导培养；（5）培养后处理。使用本发明所提出的利用黄粉虫蛹培养蝉花棒束孢的方法，促进蝉花棒束孢感染黄粉虫蛹，培养出蝉花孢梗束。本发明操作简便，效果良好，可推广应用到蝉花棒束孢的大规模生产培养方面。
【专利说明】
利用黄粉虫蛹培养蝉花棒束孢的方法
技术领域
[0001]本发明属微生物生物技术领域，涉及一种利用黄粉虫蛹培养蝉花棒束孢的方法。
【背景技术】
[0002]蝴花Cordyceps cicadae X.Q.Shing 为蝴花棒束抱(Zsaria cicadae Miquel)真菌及其寄主山蝴(C/cai/a flammata Dist)若虫的复合体。《证类本草》记载蝴花在宋代以前即已入药，有退热、解毒、驱风、镇惊的功效，可治小儿惊癫、天吊、痰疚、夜啼、心悸。《本草纲目》记载蝉花甘、寒、无毒、功同蝉蜕。传统中医药学家认为蝉花具有疏散风热，透疹，驱风止痉，明目退翳之功效；现代医学研究表明其具有调节免疫力、镇静镇痛、改善肾功能、延缓衰老等作用。蝉花在民间使用的历史悠久，市场需求量大，野生蝉花资源短缺，未能满足需求。蝉花容易人工规模化培养，功效成分与冬虫夏草含量相似，具有非常高的应用价值。
[0003]黄粉虫(rMdr1 mo Ii tor L.)分类上属鞘翅目、拟步行甲科、拟步甲族、拟步甲属。它是一种大型仓贮害虫，同时又是一种极具开发潜力的资源昆虫。该虫主要用作禽类和其它一些特种经济动物(蝎子、蛤蚧、牛蛙、林蛙、鳖、蝎、蛇、蜈蚣、观赏鱼及鸟类等)的饲料，同时也用于开发保健食品或药品。
[0004]前期研究发现，用蝉花棒束孢感染黄粉虫的不同生活史阶段(幼虫、蛹、成虫)，感染效果差异较大，其中蝉花棒束孢对黄粉虫蛹期具有非常理想的感染效果。目前黄粉虫的规模化养殖技术非常成熟，容易大量获得黄粉虫蛹。本课题组已经申请了无菌培养黄粉虫的发明专利，专利申请号为:201110360999.7。本发明利用无菌黄粉虫蛹材料，作为蝉花寄主蝉若虫的替代寄主，开展蝉花棒束孢的室内培养，寻找一条仿生态大规模培养蝉花的新途径。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种利用黄粉虫蛹培养蝉花棒束孢的方法。
[0006]该方法的操作步骤如下:
(1)蝉花棒束孢分生孢子悬液制备:蝉花棒束孢菌株接种到PDA平皿培养基上，于28°C恒温培养10-15天，用无菌水洗下孢子，稀释调整使孢子终浓度达到5 X 17个/毫升；
(2)无菌黄粉虫蛹制备:选取30-40只生长健壮的无菌黄粉虫幼虫，培养在灭菌的麸皮培养瓶中，该培养瓶为在100 ml罐头瓶中装入麸皮60 g，常规灭菌30 min ;黄粉虫幼虫化蛹后，选择化蛹8小时内的黄粉虫蛹，用无菌镊子挑出，装入无菌空罐头瓶内备用；
(3)蝉花棒束孢感染黄粉虫蛹:用无菌镊子将化蛹8小时内的黄粉虫蛹在蝉花分生孢子悬液里蘸一下，控制黄粉虫蛹浸没在孢子悬液下的时间在3-5秒，避免黄粉虫蛹被淹死，并使部分分生孢子附着在黄粉虫蛹体表。迅速转移至无菌培养瓶里，该培养瓶为在100 ml空罐头瓶底部放一张无菌滤纸片，可以吸去黄粉虫蛹体表多余的水分，控制黄粉虫蛹数量在每瓶30-40只，避免滤纸片含水量过高影响黄粉虫蛹呼吸。静置培养，控制培养温度在28°C, 2-3天后，黄粉虫蛹受蝉花棒束孢感染致死； (4)蝉花孢梗束诱导培养:待黄粉虫蛹被蝉花棒束孢感染致死后，降低培养温度至15-200C，使黄粉虫蛹上长出蝉花孢梗束。调控培养温度至20-25°C，继续培养15-20天，蝉花孢梗束长至2-4 cm,终止培养；
(5)培养后处理:将终止培养的蝉花孢梗束取出，50°C恒温干燥至恒重，用自封袋分装或粉碎至80目粉末后再分装，置于4°C环境保存。
[0007]本发明的关键点在于:蝉花棒束孢对黄粉虫蛹期具有非常理想的感染效果；蝉花棒束孢和黄粉虫蛹为无菌培养，没有杂菌影响蝉花棒束孢感染黄粉虫蛹；另外，培养过程中控制好温度、湿度等培养条件，促进蝉花孢梗束的生长。以上关键点如能把握好，可以显著提高蝉花棒束孢的产量和质量。
[0008]本发明操作简便，效果良好，可应用到大规模蝉花棒束孢的实际生产过程中。
【具体实施方式】
[0009]以下实施例用于说明本发明，但不是对本发明的限制。
[0010]实施例1:
(1)蝉花棒束孢分生孢子悬液制备:蝉花棒束孢菌株接种到PDA平皿培养基上，于28°C恒温培养10天，用无菌水洗下孢子，稀释调整使孢子终浓度达到5 X 17个/毫升；
(2)无菌黄粉虫蛹制备:选取35只生长健壮的无菌黄粉虫幼虫，培养在灭菌的麸皮培养瓶中，该培养瓶为在100 ml罐头瓶中装入麸皮60 g，常规灭菌30 min ;黄粉虫幼虫化蛹后，选择化蛹8小时内的黄粉虫蛹，用无菌镊子挑出，装入无菌空罐头瓶内备用；
(3)蝉花棒束孢感染黄粉虫蛹:用无菌镊子将化蛹8小时内的黄粉虫蛹在蝉花分生孢子悬液里蘸一下，控制黄粉虫蛹浸没在孢子悬液下的时间在3秒，避免黄粉虫蛹被淹死，并使部分分生孢子附着在黄粉虫蛹体表。迅速转移至无菌培养瓶里，该培养瓶为在100 ml空罐头瓶底部放一张无菌滤纸片，可以吸去黄粉虫蛹体表多余的水分，控制黄粉虫蛹数量在每瓶30只，避免滤纸片含水量过高影响黄粉虫蛹呼吸。静置培养，控制培养温度在28°C，2-3天后，黄粉虫蛹受蝉花棒束孢感染致死；
(4)蝉花孢梗束诱导培养:待黄粉虫蛹被蝉花棒束孢感染致死后，降低培养温度至15°C，使黄粉虫蛹上长出蝉花孢梗束。调控培养温度至20°C，继续培养20天，蝉花孢梗束长至2 cm,终止培养；
(5)培养后处理:将终止培养的蝉花孢梗束取出，50°C恒温干燥至恒重，用自封袋分装或粉碎至80目粉末后再分装，置于4°C环境保存。
[0011]实施例2:
(1)蝉花棒束孢分生孢子悬液制备:蝉花棒束孢菌株接种到PDA平皿培养基上，于28°C恒温培养15天，用无菌水洗下孢子，稀释调整使孢子终浓度达到5 X 17个/毫升；
(2)无菌黄粉虫蛹制备:选取35只生长健壮的无菌黄粉虫幼虫，培养在灭菌的麸皮培养瓶中，该培养瓶为在100 ml罐头瓶中装入麸皮60 g，常规灭菌30 min ;黄粉虫幼虫化蛹后，选择化蛹8小时内的黄粉虫蛹，用无菌镊子挑出，装入无菌空罐头瓶内备用；
(3)蝉花棒束孢感染黄粉虫蛹:用无菌镊子将化蛹8小时内的黄粉虫蛹在蝉花分生孢子悬液里蘸一下，控制黄粉虫蛹浸没在孢子悬液下的时间在4秒，避免黄粉虫蛹被淹死，并使部分分生孢子附着在黄粉虫蛹体表。迅速转移至无菌培养瓶里，该培养瓶为在100 ml空罐头瓶底部放一张无菌滤纸片，可以吸去黄粉虫蛹体表多余的水分，控制黄粉虫蛹数量在每瓶35只，避免滤纸片含水量过高影响黄粉虫蛹呼吸。静置培养，控制培养温度在28°C，2-3天后，黄粉虫蛹受蝉花棒束孢感染致死；
(4)蝉花孢梗束诱导培养:待黄粉虫蛹被蝉花棒束孢感染致死后，降低培养温度至180C，使黄粉虫蛹上长出蝉花孢梗束。调控培养温度至23°C，继续培养18天，蝉花孢梗束长至3 cm,终止培养；
(5)培养后处理:将终止培养的蝉花孢梗束取出，50°C恒温干燥至恒重，用自封袋分装或粉碎至80目粉末后再分装，置于4°C环境保存。
[0012]实施例3:
(1)蝉花棒束孢分生孢子悬液制备:蝉花棒束孢菌株接种到PDA平皿培养基上，于28°C恒温培养13天，用无菌水洗下孢子，稀释调整使孢子终浓度达到5 X 17个/毫升；
(2)无菌黄粉虫蛹制备:选取35只生长健壮的无菌黄粉虫幼虫，培养在灭菌的麸皮培养瓶中，该培养瓶为在100 ml罐头瓶中装入麸皮60 g，常规灭菌30 min ;黄粉虫幼虫化蛹后，选择化蛹8小时内的黄粉虫蛹，用无菌镊子挑出，装入无菌空罐头瓶内备用；
(3)蝉花棒束孢感染黄粉虫蛹:用无菌镊子将化蛹8小时内的黄粉虫蛹在蝉花分生孢子悬液里蘸一下，控制黄粉虫蛹浸没在孢子悬液下的时间在5秒，避免黄粉虫蛹被淹死，并使部分分生孢子附着在黄粉虫蛹体表。迅速转移至无菌培养瓶里，该培养瓶为在100 ml空罐头瓶底部放一张无菌滤纸片，可以吸去黄粉虫蛹体表多余的水分，控制黄粉虫蛹数量在每瓶40只，避免滤纸片含水量过高影响黄粉虫蛹呼吸。静置培养，控制培养温度在28°C，2-3天后，黄粉虫蛹受蝉花棒束孢感染致死；
(4)蝉花孢梗束诱导培养:待黄粉虫蛹被蝉花棒束孢感染致死后，降低培养温度至200C，使黄粉虫蛹上长出蝉花孢梗束。调控培养温度至25°C，继续培养15天，蝉花孢梗束长至4 cm,终止培养；
(5)培养后处理:将终止培养的蝉花孢梗束取出，50°C恒温干燥至恒重，用自封袋分装或粉碎至80目粉末后再分装，置于4°C环境保存。
【主权项】
1.一种利用黄粉虫蛹培养蝉花棒束孢的方法，其特征在于该方法的操作步骤包括: (1)蝉花棒束孢分生孢子悬液制备:蝉花棒束孢菌株接种到PDA平皿培养基上，于28°C恒温培养10-15天，用无菌水洗下孢子，稀释调整使孢子终浓度达到5 X 17个/毫升； (2)无菌黄粉虫蛹制备:选取30-40只生长健壮的无菌黄粉虫幼虫，培养在灭菌的麸皮培养瓶中，该培养瓶为在100 ml罐头瓶中装入麸皮60 g，常规灭菌30 min ;黄粉虫幼虫化蛹后，选择化蛹8小时内的黄粉虫蛹，用无菌镊子挑出，装入无菌空罐头瓶内备用； (3)蝉花棒束孢感染黄粉虫蛹:用无菌镊子将化蛹8小时内的黄粉虫蛹在蝉花分生孢子悬液里蘸一下，控制黄粉虫蛹浸没在孢子悬液下的时间在3-5秒，避免黄粉虫蛹被淹死，并使部分分生孢子附着在黄粉虫蛹体表；迅速转移至无菌培养瓶里，该培养瓶为在100 ml空罐头瓶底部放一张无菌滤纸片，可以吸去黄粉虫蛹体表多余的水分，控制黄粉虫蛹数量在每瓶30-40只，避免滤纸片含水量过高影响黄粉虫蛹呼吸；静置培养，控制培养温度在28°C, 2-3天后，黄粉虫蛹受蝉花棒束孢感染致死； (4)蝉花孢梗束诱导培养:待黄粉虫蛹被蝉花棒束孢感染致死后，降低培养温度至15-20°C，使黄粉虫蛹上长出蝉花孢梗束；调控培养温度至20-25°C，继续培养15-20天，蝉花孢梗束长至2-4 cm,终止培养； (5)培养后处理:将终止培养的蝉花孢梗束取出，50°C恒温干燥至恒重，用自封袋分装或粉碎至80目粉末后再分装，置于4°C环境保存。
【文档编号】C12N1/14GK105861314SQ201510034720
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月24日
【发明人】陈自宏, 徐玲, 王国强
【申请人】保山学院