香樟涌金丛生芽增殖方法
【专利摘要】本发明公开了一种香樟涌金丛生芽增殖方法，包括以下步骤：取腋芽尚未萌发的香樟涌金新梢，无菌处理后接种于诱导培养基中形成丛生芽；将形成丛生芽的香樟涌金新梢转移到增殖培养基培养中培养25d，然后转移至第二培养基培养25d，最后再转移至增殖培养基培养25d，完成丛生芽增殖。本发明的方法通过对基本培养基、激素、附加物质、培养条件等因素的考察，有效改善了涌金继代培养室丛生芽长势衰弱、黄叶、褐化的问题，提高了增殖效率。
【专利说明】
香樟涌金丛生芽増殖方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物繁殖技术领域，具体地说，涉及一种香樟涌金丛生芽增殖方法。
【背景技术】
[0002] 樟树(Cinnamomum caphora)又名香樟，为樟科樟属的亚热带常绿阔叶乔木。其生 长迅速，枝繁叶茂，四季常绿，叶形秀丽而又散发浓香，既是珍贵的芳香油类树种又是城市 重要的景观和绿化树种。香樟'涌金'（Cinnamomum camphora'Yongjin'）系香樟种子变异品 种，枝干鲜红色，新叶、花呈金黄色，果皮呈黄色，并且枝干、叶、果皮色泽具有季相变化，作 为高大的彩叶乔木，具有非常高的园林观赏及推广应用潜力与价值。但'涌金'种子遗传物 质不稳定，育苗后代退化率高达99%以上，品种保存和繁殖难度较大。目前为获得优良无性 系，已经开展嫁接实验以期获得保持母本优良性状的子代，然而由于母树枝条数量有限，即 使扦插繁殖也很难满足现实的需求。
[0003]植物组织培养是快速繁殖优良种质的重要途径，组织培养技术既能保持母本的优 良遗传特性，又能在短期内提供整齐一致的良种苗木，而且还能为树种改良利用及遗传转 化打下基础，目前已经在许多植物育苗中获得应用。
[0004] 目前获得香樟'涌金'的组培再生技术虽然已经在国内外有所研究，然而植株随着 继代次数的增加，丛生芽繁殖系数降低，出现生长势衰弱、黄叶、褐化等现象，增殖效率大大 降低，无法稳定高效的获取丛生芽，进而难以实现快速繁殖的目的。为实现香樟'涌金'试管 苗的工厂化生产，系统研究丛生芽的增殖非常必要。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明所要解决现有香樟涌金的组培再生植株随着继代次数的增加， 增殖效率大大降低的问题，提供一种香樟涌金丛生芽增殖方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一种香樟涌金丛生芽增殖方法，包括以下 步骤:取腋芽尚未萌发的香樟涌金新梢，无菌处理后接种于诱导培养基中形成丛生芽;将形 成丛生芽的香樟涌金新梢转移到增殖培养基中培养25d，然后转移至第二培养基培养25d， 最后再转移至增殖培养基培养25d，完成丛生芽增殖。
[0007] 进一步的，所述增殖培养基包括MS培养基、磷酸二氢钾(KH2PO4)、6_苄氨基腺嘌呤 (6-BA)和吲哚乙酸（IAA)。
[0008] 进一步的，所述增殖培养基中KH2PO4浓度为50mg/L、6-BA浓度为3mg/L、IAA浓度为 0.02mg/L〇
[0009] 进一步的，所述增殖培养基还包括蔗糖，所述蔗糖浓度为20_25g/L。
[0010] 进一步的，所述增殖培养基pH值为5.8-6.0。
[0011] 进一步的，所述第二培养基包括MS培养基、KH2P〇4、6-BA和IAA。
[0012] 进一步的，所述第二培养基中KH2PO4浓度为50mg/L、6-BA浓度为lmg/L、IAA浓度为 0.02mg/L〇
[0013]进一步的，所述诱导培养基为包括MS培养基、6-BA和吲哚丁酸（IBA)。
[0014] 进一步的，所述诱导培养基中6-BA浓度为1 · Omg/L、IBA浓度为0 · 02mg/L。
[0015] 与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
[0016] 1)本发明的方法通过对基本培养基，激素、附加物质、培养条件等因素的考察，有 效改善了香樟涌金继代培养室丛生芽长势衰弱、黄叶、褐化的问题，提高了增殖效率。
[0017] 当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
【附图说明】
[0018] 此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申 请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
[0019] 图1为本申请实施例中培养基Al的丛生芽增殖图；
[0020] 图2为本申请实施例中培养基A2的丛生芽增殖图；
[0021] 图3为本申请实施例中培养基A3的丛生芽增殖图；
[0022] 图4为本申请实施例中培养基A4的丛生芽增殖图；
[0023]图5为本申请实施例中培养基A5的丛生芽增殖图；
[0024]图6为本申请实施例中培养基A6的丛生芽增殖图；
[0025] 图7为本申请实施例中培养基A7的丛生芽增殖图；
[0026] 图8为本申请实施例中培养基A8的丛生芽增殖图；
[0027]图9为本申请实施例中培养基A9的丛生芽增殖图；
[0028]图10为本申请实施例中培养基Bl的丛生芽增殖图；
[0029]图11为本申请实施例中培养基B2的丛生芽增殖图；
[0030]图12为本申请实施例中培养基B3的丛生芽增殖图；
[0031]图13为本申请实施例中培养基M的丛生芽增殖图；
[0032]图14为本申请实施例中培养基B5的丛生芽增殖图；
[0033]图15为本申请实施例中培养基B6的丛生芽增殖图。
【具体实施方式】
[0034]以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用 技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
[0035] 实施例
[0036] 一、材料
[0037] 香樟'涌金'带芽茎段采集于宁波市林业局种苗中心邱隘基地14年龄期香樟'涌 金'树上，剪取腋芽尚未萌发的新梢带回实验室，经过无菌处理后接种至诱导培养基(15+6_ BA 1.0mg/L+IBA 0.02mg/L)中形成丛生芽。
[0038] 二、数据处理
[0039]增殖倍数= 25d总芽数/接种芽数（高度为Icm以上为有效芽）；数据采用平均值± 标准误(SE)表示，采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计，均值比较采用单因子方差分析， 不同处理方式显著差异性采用Duncan's新复极差测验方法(SSR，P<0.05)。
[0040] 三、香樟'涌金'丛生芽的增殖
[0041 ] 3.1不同基本培养基、植物生长调节剂种类和浓度对丛生芽增殖的影响
[0042]为筛选出适合香樟'涌金'丛生芽不断增殖的培养基，研究选定三种不同的基本培 养基：MS、MS和50mg/L的KH2P〇4、I/2MS; 6-BA浓度设计为：0 · 5、I、3mg/L;生长素为IAA: 0、 0.02、0.0411^/1;643(赤霉素）：0、0.05、0.111^/1，采用正交实验设计方案进行优化实验，培 养基设计见表1。
[0043]表1香樟'涌金'丛生芽增殖培养基的设计
LUW3」 耿访守;t首乔趣ψ形肷丛王牙的含悍y闬筮纽_识，直上还Ai-AytfJ个|n」；117且;t首乔趣 中增殖培养，培养结果见图1 -图9和表2。
[0046]表2不同培养基对香樟'涌金'丛生芽增殖的影响
[0048]注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平下差异显著。
[0049]如图1-9所示，通过香樟'涌金'丛生芽增殖的研究发现，丛生芽在只有6-BA的培养 基(Al、A6、A8)中有少量芽点形成，但生长困难，且在Al培养基中丛生芽的叶片发黄，基部褐 化严重，并随着培养时间的延长叶片脱落，植株死亡（如图1)。而添加适量的生长素可使丛 生芽生长旺盛，叶色嫩绿，其增殖能力随着生长素的升高而增强。若培养基中细胞分裂素与 生长素的比例适当，则香樟'涌金'丛生芽的增殖倍数迅速增大(A3、A4、A5)。
[0050] 增殖培养基中添加适宜浓度的IAA对香樟'涌金'丛生芽的增殖效果好，苗生长旺 盛，叶色嫩绿。当IAA浓度为0.04mg/L时，对增殖产生抑制作用，苗基部形成较大的愈伤组 织，产生一圈褐色抑制物质而导致基部叶变红，继而发枯，影响整株的生长(A3、A5、A7)。
[0051] GA3对香樟'涌金'丛生芽的生长和增殖效果无明显的促进作用。GA3浓度依次为0、 0.05、0.1mg/L，丛生芽的生长状况并没有因为GA3浓度的升高而改变，且随着GA3叶发灰，形 成的芽点不能发育，几乎无增殖。
[0052]实验结果还显示，不同的基本培养基对香樟'涌金'丛生芽生长有重要影响：由培 养基结果可见，在添加了 50mg/L KH2PO4的MS基本培养基和1/2MS中，丛生芽增殖过程中褐化 有明显改善(A4、A5、A6)。
[0053] 3.2不同蔗糖浓度对香樟'涌金'丛生芽增殖效果的影响
[0054]在上述实验的基础上，研究不同蔗糖浓度对香樟'涌金'丛生芽增殖效果的影响。 蔗糖浓度水平分别为：10、20、30、40、50，60g/L。培养基为 MS、50mg/L 的 KH2P〇4、2mg/L 的 6-BA 和0.02mg/L的IAA，琼脂浓度为7g/L，pH值5.8。实验结果见图10-图15和表3。
[0055]表3蔗糖浓度对香樟'涌金'丛生芽增殖的影响
[0057] 注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平下差异显著。
[0058] 如图10-15所示，在植物组织培养时，由于培养物的光合作用能力较弱，所以需要 在培养基中添加一些糖类，一方面作为生长发育所需的碳源和能源，同时也可以维持一定 的渗透压。在香樟'涌金'丛生芽增殖培养中，不同蔗糖量的加入对增殖和生长状态均产生 一定的影响。丛生芽在较低浓度的蔗糖培养基Bl上表现为叶淡绿、芽细弱，而靠近基部的叶 片也出现枯黄;在B3培养基上，苗生长较为旺盛，叶色嫩绿，基本没有枯苗出现;而在较高蔗 糖浓度的B4、B5培养基上，苗生长缓慢，分化少，叶黄绿，变粗和老化，基部聚集褐色物质，有 枯苗夹杂于芽丛中间。从表3结果可以看出，随着蔗糖浓度的加大，增殖系数大致先升高而 后降低。同时由表3可以知道，B2和B3培养基中蔗糖浓度为20、30g/L，这时的增殖倍数最 大，达到2.80和3.38，但因 B3增殖系数较高，芽偏细弱，一般生产考虑更多的有效苗，故而培 养基中蔗糖浓度选择20~25g/L为宜。
[0059] 3.3不同pH值对香樟'涌金'丛生芽增殖的影响
[0060] pH值影响丛生芽的增殖培养，因此本实验设计了以下几个pH值，以选择最佳的培 养条件，培养基包括MS、50mg/L的KH 2P〇4、2mg/L的6-BA和0 · 02mg/L的IAA，琼脂浓度为7g/L。 实验结果见表4。
[0061] 表4不同pH值对香樟'涌金'丛生芽增殖的影响
[0063] 注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平下差异显著。
[0064] 培养基中pH值也是影响植物组织培养的一个重要因素。pH值的变化影响到一些离 子的溶解度而影响到植物对各元素的吸收而发生缺素症状。同时过高或过低PH值会影响到 培养基的凝固，PH值偏大，会使培养基发硬，反之则培养基太软。pH值在5.5时，灭菌后培养 基较软，丛生芽叶灰绿，分化的丛生芽有玻璃化趋势且芽生长缓慢;pH值在5.8~6.5的培养 基上，香樟'涌金'丛生芽均能比较正常的生长，增殖倍数高，有效芽多;PH值高于7.0时，丛 生芽叶表现出黄绿状况，且芽生长缓慢，增殖倍数降低。由表4可知，香樟'涌金'丛生芽在pH 值为5.8~6.0之间时，芽苗能够旺盛生长，且能维持较高的增殖倍数。
[0065] 3.4不同继代方式对香樟'涌金'丛生芽增殖的影响
[0066] 将下列5种培养基进行交替培养，培养结果见表5。
[0067] ① MS、50mg/L 的 KH2PO4、3mg/L 的 6-BA和 0 · 02mg/L 的 IAA;
[0068] ② MS、50mg/L 的 KH2PO4、2mg/L 的 6-BA和 0 · 02mg/L 的 IAA;
[0069] ③ MS、50mg/L 的 KH2PO4、lmg/L 的 6-BA和 0 · 02mg/L 的 IAA;
[0070] ④ MS、50mg/L 的 KH2PO4、0 · 5mg/L 的 6-BA和 0 · 02mg/L 的 IAA;
[0071] ⑤ MS、50mg/L 的 KH2PO4和 0.02mg/L 的 IAA。
[0072] 表5不继代方式对香樟'涌金'丛生芽增殖的影响
[0074] 注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平下差异显著。
[0075] 组培苗增殖通常是外植体连续继代于含有6-BA增殖培养基中，这种方式常常导致 组培苗的玻璃化或生长畸形，因此比较了不同继代方式对香樟'涌金'丛生芽增殖和生长的 影响。首先将外植体接种于所筛选出的丛生芽的增殖培养基MS+50mg/L的KH2P0 4+3mg/L的6-BA+0.02mg/L的IAA(①）中，25d后分别转移至浓度逐渐降低的（②、③、④)或去掉6-BA培养 基(⑤）中，25d后再转移至增殖培养基中①中。结果显示(表5)，五种继代方式中，D3方式最 有利于香樟'涌金'丛生芽的增殖，平均增殖系数最高，且芽生长快速;连续在培养基①中培 养会导致增殖系数明显降低，且丛生芽易出现玻璃化。
[0076] 3.5不同继代周期对香樟'涌金'丛生增殖的影响
[0077] 实验中发现继代周期对香樟'涌金'丛生芽增殖影响较大，故而设计如下实验方 案，以筛选出适宜的继代时间，培养基MS+50mg/L的KH2P0 4+2mg/L的6-BA+0.02mg/L的IAA， 琼脂浓度为7g/L，pH值5.8，实验结果见表6。
[0078] 表6同继续代周期对香樟'涌金'丛生芽增殖的影响
[0080] 注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平下差异显著。
[0081 ]培养过程中材料长期不转移，会导致培养材料褐变，最终材料全部死亡。及时更新 培养基是有效降低褐化的重要措施之一。针对香樟'涌金'丛生芽的增殖特点，比较了不同 继代周期对其生长的影响。结果表明，培养IOd即转移增殖倍数最低，其增殖倍数随继代周 期的延长出现先增加后降低的趋势。继代周期在25d~30d增殖倍数与其他处理比较呈显著 差异(p〈0.05)，且继代周期在25d其增殖倍数平均可达。尽管30d继代丛生芽的增殖倍数也 较高，但丛生芽生长情况开始恶化，出现黄叶和死苗的现象，不利于继续培养。因此选择25 ~30d进行继代为佳，有利于丛生芽的发育和增殖。
[0082]四、最终确定的香樟'涌金'丛生芽增殖方法
[0083]取腋芽尚未萌发的香樟'涌金'新梢，无菌处理后接种于诱导培养基（MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.02mg/L)形成丛生芽;将形成丛生芽的香樟'涌金'新梢转移到增殖培养基 (MS+KH2PO4 50mg/L+6-BA 3.0mg/L+IAA 0.02mg/L+蔗糖20-258/1印!1=5.8-6.0)培养25(1， 然后转移至第二培养基(MS+KH 2P〇4 50mg/L+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.02mg/L)培养25d，最后再 转移至增殖培养基(MS+KH2PO4 50mg/L+6-BA 3.0mg/L+IAA 0.02mg/L+蔗糖 20-25g/L，pH= 5.8-6.0)培养25d，完成丛生芽增殖。
[0084] 本发明的方法通过对基本培养基，激素、附加物质、培养条件等因素的考察，有效 改善了香樟'涌金'继代培养室丛生芽长势衰弱、黄叶、褐化的问题，提高了增殖效率。
[0085] 如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术 人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不 以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的"包含"为 一开放式用语，故应解释成"包含但不限定于"。"大致"是指在可接收的误差范围内，本领域 技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续 描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本发明的一般原则为目的，并非 用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
[0086] 还需要说明的是，术语"包括"、"包含"或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的 包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确 列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情 况下，由语句"包括一个……"限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还 存在另外的相同要素。
[0087] 上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明 并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、 修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识 进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发 明所附权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 香樟涌金丛生芽增殖方法，其特征在于，包括以下步骤:取腋芽尚未萌发的香樟涌金 新梢，无菌处理后接种于诱导培养基中形成丛生芽;将形成丛生芽的香樟涌金新梢转移到 增殖培养基培养中培养25d，然后转移至第二培养基培养25d，最后再转移至增殖培养基培 养25d，完成丛生芽增殖。2. 如权利要求1所述的香樟涌金丛生芽增殖方法，其特征在于，所述增殖培养基包括MS 培养基、KH2PO4、6-BA 和 IAA。3. 如权利要求2所述的香樟涌金丛生芽增殖方法，其特征在于，所述增殖培养基中 KH2PO4 浓度为 50mg/L、6-BA 浓度为 3mg/L、IAA 浓度为 0 · 02mg/L。4. 如权利要求3所述的香樟涌金丛生芽增殖方法，其特征在于，所述增殖培养基还包括 蔗糖，所述蔗糖浓度为20_25g/L。5. 如权利要求4所述的香樟涌金丛生芽增殖方法，其特征在于，所述增殖培养基pH值为 5.8~6.0〇6. 如权利要求5所述的香樟涌金丛生芽增殖方法，其特征在于，所述第二培养基包括MS 培养基、KH2PO4、6-BA 和 IAA。7. 如权利要求6所述的香樟涌金丛生芽增殖方法，其特征在于，所述第二培养基中 KH2P〇4 浓度为 50mg/L、6-BA 浓度为 lmg/L、IAA 浓度为 0 · 02mg/L。8. 如权利要求7所述的香樟涌金丛生芽增殖方法，其特征在于，所述诱导培养基所述诱 导培养基为包括MS培养基、6-BA和IBA。9. 如权利要求8所述的香樟涌金丛生芽增殖方法，其特征在于，所述诱导培养基中6-BA 浓度为 1 · 〇mg/L、IBA 浓度为 0 · 02mg/L。
【文档编号】A01H4/00GK105941150SQ201610345914
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】何月秋, 张椿芳, 王建军
【申请人】宁波城市职业技术学院