经移植前暴露于死亡配体的造血祖细胞的活化的制作方法
【专利说明】经移植前暴露于死亡配体的造血祖细胞的活化
【背景技术】
[0001] 造血干细胞和造血祖细胞移植是肿瘤学中的常规疗法，其在各种耐放射化疗的恶 性肿瘤中都具有治疗能力。移植程序的改进和逐步推进，开启了造血移植在非肿瘤疾病中 的广泛实施，其中非肿瘤疾病包括先天性缺陷、先天性和获得性免疫缺陷综合征、免疫力异 常、自身免疫性疾病，W及对器官和组织移植物的耐受性的诱导。
[0002] TNF家族包括19种已知的受体/配体相互作用，它们在诱导体细胞调亡中具有相同 的活性。
[0003] 在使用鼠科和人类细胞的应力造血和移植模型中所进行的研究，对肿瘤坏死因子 (TNF)家族受体作为细胞调亡和刺激的双重介质的作用[1-4]，取得了有争议性的证据和解 释。一方面，传统观念主要认为运些受体起到细胞调亡（细胞发育的少数不可逆事件之一） 介质的作用。因此，认为化s/化sL的相互作用是使造血祖细胞发育的负调节因子，类似于在 分化末期对克隆扩增进行抑制[5-7]。运一观念是基于如下数据，该数据显示出化S受体在 体外抑制造血祖细胞的功能[8,9]，阻遏克隆形成活性[10,11]，W及损害免疫低下的小鼠 [12,13]和人类[11]中的人类细胞植入。
[0004] 有人提出，祖细胞免于发生细胞调亡是归因于，转导细胞调亡和抑制信号的TNF家 族受体的低水平表达。
[0005] 另一方面，在归巢且接种到受体骨髓内之后不久，就在供体细胞中观察到几种TNF 家族受体发生剧烈上调。
[0006] 如W02007/138597中所记载的，造血祖细胞对细胞调亡的抗性在移植环境中具有 几种重要意义。一方面，W02007/138597提出作为基于表型进行选择的替代方式，基于功能 特性，使用调亡挑战来富集用于移植的祖细胞。该有效且可靠的选择程序是简单且低廉的， 并且在供体移植物中包括了表达低水平或不表达诸如CD34和CD133标记物的祖细胞。此外， 基于细胞调亡的细胞制剂具有W下明显优势：消除了移植物抗宿主(GvHD)的效应物和自身 反应性T细胞，W及来自供体移植物的恶性细胞[33，34]。
[0007] 本发明人早先曾表明，TNF家族受体在体外对造血细胞功能的负面影响仅限于经 细胞因子刺激的骨髓和UCB细胞[8-20，23，27]，而且通过去除细胞因子进一步加剧了该负 面影响[35]。在与逐渐丧失植入潜能相关的长期离体培养期间，表达化S的CD34+祖细胞部 分对自发性细胞调亡显示出过度敏感性[12,13]，然而，运种现象与化S受体交联无关[28， 31]。已表明，移植后祖细胞在体内保持对细胞调亡的固有抗性，从而使对细胞调亡不敏感 的祖细胞优先植入到被搞糟的骨髓环境中[2引，其中被搞糟的骨髓环境是由移植前调节所 造成的损伤导致的。祖细胞的运种特性使得它们成为免疫细胞的有效替代物，用于进行免 疫调节，W减轻体内介导排斥反应的宿主抗移植物化vG)的同种免疫应答，运是通过化sL膜 蛋白的异位表达来实现的[36,37]。
【发明内容】
[000引本发明设及通过活化TNF家族受体，来改进造血细胞的植入。与死亡受体的活化不 利于造血祖细胞的植入和功能运一传统观念相反的是，本发明人证实了，对受体介导的细 胞调亡具有固有抗性的祖细胞中的那些受体的诱导活性。离体暴露于化S-配体、TNF-a和 T R A I L W及它们的组合，增加了 S C I D小鼠中的定量异嵌合性（q U a η t i t a t i V e xenochimerism)并且改善了体内骨髓重建。在培养物中，还证明了骨髓祖细胞活性的诱导。 对于新鲜的厮带血和经低溫保存的动员外周血，示出了具体实施例，W证明造血祖细胞的 活化包括普通来源的供体细胞移植物，并且与储存无关。活化不同来源的祖细胞所需的时 间和配体浓度是不同的，并且进行了相应优化。根据本发明，使供体造血移植物暴露于用于 祖细胞活化的TNF超家族配体，W实现优秀的定量和定性的植入和重建。
[0009] 因此，在本发明的第一方面，本发明提供了一种增加干细胞和祖细胞(SPC)在需要 进行SPC移植的受体内的植入的方法，所述方法包括：
[0010] a.使从供体获得的生物样品与TNF超家族的至少一个成员或其任意片段或衍生物 进行离体接触，所述生物样品包括SPC的群；W及
[0011] b.在所述接触步骤(a)之后，将所述SPC移植到所述受体内；
[001^ 其中，移植的所述SPC显示出增加的植入。
[0013] 另一方面，本发明提供了用于移植方法的细胞的群，其中，所述细胞为具有增加的 植入特性的干细胞和祖细胞(SPC)，其中，通过使从供体获得的生物样品与TNF超家族的至 少一个成员或其任意片段或衍生物进行离体接触，来获得所述具有增加的植入特性的SPC 的群，所述生物样品包括SPC的群。
【附图说明】
[0014] 图1A为示出小鼠的存活率的曲线图（n = 20)，该小鼠植入有在培养基中解育且预 暴露于5(K)ng/ml TRAIL的细胞。在此，超过4周的时长中并没有额外的死亡。图1B为示出与 250ng/ml化sL嵌合蛋白、2化g/ml TWa及其组合预解育的细胞的受体的存活率的曲线图 (n = 20)。图1C为示出在移植后3周，在对应实验组(每组中n = 6)中供体嵌合体的水平的图 解。图1D为示出小鼠中的品系嵌合体的曲线图，该小鼠植入有预暴露于代表GR-1+骨髓细 胞、CD4+和CD8+T细胞W及B220+B淋己细胞的死亡配体。
[0015] 图2A为演示实验开始的示意图。图2B为示出了通过用人抗-CD45的单克隆抗体对 新鲜的UCB(n = 27)，移植前在培养基中解育24、48和72小时的UCB(n分别=12、10、5)，在具 有化sL的培养基中解育24、48和72小时的UCB(n分别=8、8、8)，在具有TNF-a的培养基中解 育24、48和72小时的UCB(n分别= 7、7、5)，W及在具有TRAIL的培养基中解育24、48和72小时 的UCB(n分别=7、8、9)进行染色，所确定的人类嵌合体百分比的图解。图2C为示出了利用物 种特异性CD45对鼠科动物骨髓中的人类细胞嵌合体进行代表性测量的示意图。
[0016] 图3A为在移植后12周，在鼠科动物骨髓中，由人类UCB细胞发育出的谱系的示意 图。在移植前，移植细胞与20ng/ml TNF-a进行预解育:CD34+和阴性（lin-)祖细胞系、CD3+T 细胞、CD 19+B淋己细胞、CD33+骨髓细胞。图3B为示出了在细胞移植后12周，骨髓中的人类细 胞植入百分比的柱状图，其中细胞与50ng/ml化sL预解育48小时、与20ng/ml TNF和1.扣g/ ml TRAIL预解育48(每组中n = 7~12)。图3C为示出在预暴露于死亡配体(含有CD14+单核细 胞）24~48小时后的定性植入的示意图（每组中n = 4~7)。绘制出了增加的骨髓单细胞部 分。
[0017] 图4A是示出了与对照和经TNF-α处理的UCB细胞相比，在首次受体（prima巧 recipient)和二次受体（secondaiT recipient)中的植入百分比的图解。图4B是示出了在 经TNF或对照(培养基)处理24小时或48小时的UCB细胞的受体中，骨髓集落数目的柱状图。
[0018] 图5A为在培养基中、具有50ng/ml化sL或1.化g/ml TRAIL的培养基中解育后的 UCB细胞中，Fas、TNF受体和TRAIL受体的分数表达的示意图（每组中n = 5~9)。图5B为示出 了在与FasL、TNF-a和TRAIL解育48小时后，单核（MNC)UCB细胞、CD34+和阴性祖细胞系 (lin-)的增殖指数的图解(每组中n = 4~7)。右图是利用ModFit模拟软件测量来自CFSE稀 释的增殖的指示图。图5C为示出了在与配体解育48小时后，CD34+和lirT祖细胞中的细胞周 期时相的柱状图。右图为利用舰化丙晚测量DNA含量的指示图（每组中，n = 4~7)。
[0019] 图6A为演示实验开始的示意图。图6B为示出了对于新鲜的UCB(对照），和在培养基 中解育后W及在具有死亡配体的培养基中解育24~72小时（在每个时间点，n = 6~14)之 后，每1〇3铺板细胞表示的骨髓集落形成的柱状图。图6C为示出了在CD34+祖细胞中，Fas表达 百分比的柱状图（n = 9)。图6D为示出了在甲基纤维素培养物中，骨髓祖细胞活性的柱状图 (n = 7~15)。
[0020] 图7A为示出了在新鲜的样品中，W及与各配体解育后，Fas表达％的柱状图（n = 29 新鲜的，n = ll解育的）；图7B为示出了在新鲜的样品中，W及与配体TNF-Rl(n = 7新鲜的，η =5解育的）和TNF-R2(n=12新鲜的，η=10解育的）中的每一种解育后，Fas表达％的柱状图 图；图7C为示出了在新鲜的样品中，W及与配体TRA比-Rl(DR4，n = 9)和TRA化-R2(DR5，n = 8)中的每一种解育后，Fas表达％的柱状图。图7D至图7F为受体串扰kross-talk) W及被同 源配体诱导的结果的示意图：图7D为受体的诱导表达，图7E为细胞增殖的衰减，图7F为基于 膜下信号传导通路的示意图的细胞调亡。
[0021] 图8A为示出了在培养基和含配体的培养基中解育之后，移植了 11个mro样品，然后 通过人类抗CD45染色，所确定的人类供体嵌合体的累积水平的图解(每个实验组中，n = 9~ 17只小鼠）。图8B为在移植后12周，宿主骨髓中谱系的分数分布的示意图，其中包括:CD34+ 和阴性祖细胞系（lin-)、CD3+T细胞、CD19+B淋己细胞和CD33+骨髓细胞(在每组中，n = 4~ 7)。
[0022] 图9A为示出了CFU/103mPB细胞的数目的柱状图。图9B为示出了与配体解育4小时 和16小时后，大骨髓集落(〉50个细胞)和小骨髓集落(30~50个细胞)的分配的柱状图。
【具体实施方式】
[0023] 本发明设及利用TNF家族受体的信号传导，来诱导干细胞和祖细胞的活化。因为细 胞调亡机制在所有细胞(包括最原始的干细胞和祖细胞）中都是高度保守的，所W该通路用 于进行营养性(tro地ic)信号传导。根据本发明，在移植前，将造血细胞移植物暴露于TNF家 族受体的配体的各种组合，W诱导它们随后在体内的活性。
[0024] 本发明基于W下的新发现:干细胞和祖细胞(SPC)，尤其是造血干细胞和造血祖细 胞化SPC)上的TNF家族受体在移植前的活化，通过促进造血祖细胞的植入和重建而改进了 移植的结果。尽管每一单独的受体在造血干细胞和造血祖细胞的相对少的部分中表达，但 是在约50%的新鲜厮带血化CB)祖细胞中发现了运些受体。因此，联合活化具有影响显著一 部分祖细胞的活性的能力。结果证明了，TNF家族受体活化足W体内诱导造血祖细胞的活 性。
[0025] 此外，在没有额外的细胞因子和生长因子的情况下，利用TNF家族配体持续相对短 的时间段，进行TNF家族受体的活化。对于移植物(其通常不包括支持因子和刺激因子)的移 植前制备的情况，该方法是可行的。
[0026] 此外，本发明与移植物制剂的细胞调亡介导的机制不同，其中移植物制剂细胞调 亡介导的机制，使用祖细胞对细胞调亡的抗性，来消除产生GvHD的细胞调亡敏感的亚群并 且排除来自自体移植物的残余恶性细胞。未来实现祖细胞的营养性移植前活化，暴露时间、 配体浓度W及活化受体的性质不同于基于祖细胞对细胞调亡的不敏感性来对组细胞进行 功能性阴性选择(W02007/138597)。
[0027] 厮带血是造血干细胞和造血祖细胞的丰富来源，厮带血的应用使得通过移植来治 疗恶性疾病和非恶性疾病发生指数增加。UCB作为供体细胞源的主要限制是:低于成人受体 移植所需阔值的，较少数量的祖细胞；W及，缓慢植入，该缓慢植入延长了再生障碍W及宿 主暴露于感染的危险期延长。对于运些限制所提出的解决方案包括:共移植数个厮带单元 (cord unit), W及对祖细胞进行离体扩增。本发明人先前已经证明了，与基于表型标记物 (CD34、CD133)进行的分离相比，对细胞调亡具有抗性的UCB祖细胞的功能性选择，增加了它 们的有效数目。此外，消除变得对细胞调亡敏感的分化细胞，通过赋予未定向的细胞调亡- 不敏感前体优点，而提高了