专利名称：牛x、y精子流动分离法的制作方法
技术领域：
本发明涉及牛X、Y精子流动分离法，属于动物繁殖方面的性别控制方法。
资料报导，世界各国对家畜的性别控制已研究了近一个世纪。主要是用实验的方法区分X精子和Y精子间的微妙差异，诸如精子的形态、重量和比重、化学成份、对酸碱的反应，所带电荷的不同及抗原性等，其方法如电泳法、密度梯度离心法、酸碱法等。但是到目前为止，还没有一种有效的方法能够使数以亿计的家畜精液样本分成X和Y精子以供人工授精。
本发明的目的是提供一种设备方法简单、操作方便有效，能在种公牛站广泛使用的牛X、Y精子流动分离法，实现现代遗传学在理论和实践上的重大突破。
牛的性别是由性染色体决定的，是雄性配子异型。含X、Y染色体的精子产生的数量相等，因此与卵子结合的概率也基本相同，从而后代的性比接近1∶1。据此，在牛人工授精的实践中，若将牛的两性精子分离，便可达到性别控制的目地。
利用含X、Y染色体的精子在流体中各自的运动特性将其分离，依据有二顺、反旋转性(自转运动)据观察和实验，精子是沿其纵轴旋转着向前运动的，从尾部望去，有顺时针和反时针两种。顺时针旋转者为Y精子；反时针旋转者为X精子。
逆流而上性在流速为精子运动速度的1～2倍或略高一些的液流中，精子有逆流而上的特性。
产生顺、反旋转的机理家畜正常的精子是沿其纵轴旋转着向前运动的，这在几十年前就有报导。但是关于旋转的方向问题，根据荷兰E、M、BIOknuis的实验(第四届国际家畜繁殖会议选译1961)，他认为“从后面看，精子的头部以反时针方向旋转(当然尾部也旋转)，到目前为止尚未看到例外”。经过发明人多次观察和实验，证明这种看法只反映问题的一面，即除反时针方向旋转之外，还有顺时针的。
如果我们用低倍镜观察牛精子的运动情况，便可发现其运动轨迹有四种特殊的现象其一，如果移动视野，跟踪一个精子，则可以发现精子的运动轨迹是园形的，并非当前公认的直线前进运动。所有正常的具有活力的精子都是这样(畸形、稀释液配制不良造成运动失调者除外)，其运动轨迹和运动的直线方向(假想线)略有偏离，呈圆弧状弯曲。如
图1精子圆弧轨迹示意图(虚线是假想线；圆圈表示视野)。
其二，正常精子的圆形运动轨迹的方向分为两种，一种是顺时针的，一种是反时针的。
其三，顺时针和反时针圆形运动轨迹的精子数的比例为1∶1。
其四，正常精子沿圆形轨迹运动到一段时间后便向相反圆弧的方向运动，这是接触到载玻片的结果。
精子的运动轨迹为什么有这些现象呢？根据发明人观察，系由以下三种原因造成的精子的外形特殊，精子能旋转(自转)运动及流体力学。
①精子的外形——分头、颈、尾三部份。头部呈扁卵圆形，中间凹陷；颈较短，细圆轴状；尾部很长，约为头长的10倍。值得注意的是活体的精子的头部平面与尾部的摆动平面之间有一个交角。
②旋转(自转)运动根据观察，牛精子的前进运动是靠尾部的有节律的摆动来实现的。摆动呈波形，与其周围液体相互作用与反作用形成推力，在前进的同时，由于精子的头部平面与尾部的摆动平面有一个交角，而这个交角又非常巧妙的适宜，头部的扁平面和侧方的液体发生相对运动。和放风筝相似，迎着液体运动的一面和相背的一面产生压强差，并形成举力。在此举力的作用下，精子头部便向侧方上扬或下抑。当头部达到新的位置时，由于尾部和头部是一整体，被扭转后也随之达到新的位置，并继续摆动。循此下去，尾部的摆动平面和头部平面均在空间的不断的依序变换位置，精子便旋转前进了。X、Y精子表现在尾部摆动平面与头部平面的相对位置是手征式的轴对称，这样旋转方向从尾部望去便有顺时针和反时针的不同。
③流体力学在静止的三维空间的液体中，精子的运动轨迹如下(1)精子旋转前进运动的同时，也受到重力场的影响，因此它的运动轨迹是逐渐下降的。
(2)精子在旋转前进并下降的过程中，由于有顺、反两种旋转运动，在两种精子前进方向一致的情况下，便会出现下面的运动轨迹；第一种介质——盐、糖类以含Y精子为例，精子下降的落点不是在自由落体的投影上，而是向左偏移。这是由于精子是顺时针方向旋转的，其左边转动的速度向上，其右边转动的速度向下，在受重力场影响下降的过程中，流体的运动速度(相对速度)的方向也是向上。这样根据速度相加原理，左边便成了两个速度之和，右边便成了两个速度之差。“差”的压强要大于“和”的压强，因此含Y的精子的运动轨迹在此“附加压力”的作用下便脱离了自由落体的轨迹而向左偏移。同理，含X的精子的运动轨迹向右偏移。
第二种介质——奶类奶类稀释液和糖、盐稀释液不同，是乳浊液，充满着球状颗粒。在这种不匀质的液体中，精子运动轨迹的偏移方向受两个相反方向的力所左右一是“附加压力”，一是“反作用力”。随着颗粒质量及浓度的改变，X、Y精子的偏移方向存在与第一种介质相同或相反或不偏移的三种可能性。
(3)精子旋转前进的过程中，它的前进方向不是直线而是曲线，这是由于精子受重力而下降，受“附加压力”而偏移的过程中，精子本身的形状不匀称，头部比尾部宽几倍，头部所受的力大。在此种持续力的作用下，其前进方向的运动轨迹便逐渐弯曲，最后近似的形成一个圆圈。因为精子本身有顺、反两种自转方式，所以圆圈也呈顺、反不同的轨迹。
总结(1)(2)(3)各点，在静止的三维空间的流体中，由于X、Y精子的外形构造，决定了精子本身的顺、反自转运动。由于顺、反的自转运动又决定了顺、反两种圆圈运动轨迹及其比例为1∶1。
精子逆流而上的运动特性正常的精子在适宜的温度下，当遇到自己运动速度1～2倍的液流时均毫无例外地头朝向同一方向逆流而上。液流速度增加，精子的旋转数及运动速度亦相应加快。
根据上述理论和实践，实现本发明目的的技术方案是1、将牛精液用奶、糖稀释液稀释；2、将稀释后的精液抽取在注射器中；3、将注射器水平放置用灯光照射；4、X、Y精子在注射器内闭琐循环中自动分离为两部分排列，由此将X、Y精子分离；5、X、Y精子分别用Tris稀释液稀释；6、常规液氮细管冷冻。
稀释液配方第一液 第二液Tris稀释液柠檬酸6.768g葡萄糖5.5gTris 12.112g 甘油 32ml蒸馏水345ml 卵黄 100ml青霉素、链霉素各50万单位附
图1是精子圆弧轨迹示意图，虚线是假想线，圆圈表示视野。
图2是X、Y精子流动分离装置结构示意图。
图3是图2的左视图。
图4是X、Y精子占据部位示意图。
图中1-注射器，2-分离架，3-灯光下面结合附图对本发明的分离方法作进一步描述。为实现本发明的分离方法，选用如下设备和动力；①动力——电灯光。该动力比较平稳、匀速、易于控制。
②设备——注射器、分离架。
分离时将注射器抽取适量精液水平放置在带有铝制托片的一个垂直分离架上。在其对面的一定距离上安装一光源进行照射，光线和注射器呈直角。注射器受到光线照射后便将光能转化成热能。近光线的精液受热较快，其体积增大密度变小而上升，其空出的位置被流来的较凉的密度较大的精液所填充。如此交替不止便产生了对流。近光线和远光线的精液总是存在温差，因此对流便持续不停。这种对流现象在光线照射后的数秒钟之内便可启动。
注射器需水平放置，这样液体流动的方向才能与地面呈环形垂直。由于注射器装满一定量的精液，不留空隙，因此精液在注射器内以管壁为外介作圆形闭琐的循环流动。
精液是粘滞液体，具有内摩擦力，所以外层的流动必然引起内层相应的流动。精液的流速很小，其内部的液流是层流状态。最外层流速最大，中轴部分流速为零，中间有一个速度梯度。根据力学原理，液体流速大则动量大；流速小则动量也小。精子在运动中头部前方形成喇叭口形，在逆流而上的过程中，喇叭口受到液流动量之差的作用被逐渐冲到较慢的一层。循此下去，精子便被动的向中轴方向移动。与此同时，由于精子的旋转而产生“附加压力”，由于顺、反时针旋转的不同而向注射器两端分离。
分离方法分离宜在18-25℃的暗室中进行。
首先制作精液稀释液第一液奶糖稀释液将12g乳糖倒入250ml三角烧瓶里，再加入100ml蒸馏水，加温，振荡溶解后取出75ml。将10g奶粉倒入另一250ml三角烧瓶里，再加入100ml蒸馏水，振荡，待充分溶解后取出25ml。将12％的乳糖溶液75ml和10％的奶粉溶液25ml混合在一起，蒸汽灭菌消毒10分钟，冷却过滤，并保持在37-40℃水浴中备用。
第二液 Tris稀释液按配方准确称量柠檬酸6.768g，葡萄糖5.5g,Tris(三羟基甲基氨基甲烷)12.112g溶解在345ml的蒸镏水中，振荡溶解后再加入甘油32ml，卵黄100ml(不含蛋清和卵黄膜)，青、链霉素各50万单位，充分振荡备用。
分离装置有一分离架，为一带座的垂直木板，木板上安放三排铝制的托片，其高度分别为7、13、19cm，放注射器用。
在分离架对面距43cm处，放一个300W的电灯泡，距桌面高度5.6cm。
精液处理牛精液采出后立即进行精液质量判定，包括一般性状的检查及活力、密度等检查。对合格精液准确计算出该份精液的稀释量，其计算公式为稀释量=(鲜精量×预估活力×密度)÷0.2根据牛流动分离法的技术操作要求，每支100ml注射器分离后的稀释量一般为60ml，每支0.5ml细管有效精子为0.1亿，预估活力为0.35，那么在分离前应该吸取使用的原精精子总数，即鲜精量×密度，按前式计算应为鲜精量×密度=稀释量×0.2÷预估活力=60×0.2÷0.35=34.28≈35(亿)根据精子的密度即可算出每支100ml注射器分离时所需的鲜精量(鲜精量=35亿÷密度)。将精液从集精管中倒入精液瓶(80ml带刻度的灼杯，标有品种、牛号)35亿的鲜精量，再用37-40℃的第一液稀至30ml，立即用100ml注射器将稀释后的精液全部抽取出来。
精液内留一小气泡(以便取水平，相当于水平仪中的汽泡)，其直径3mm为宜。注射器口用消毒的火柴杆堵塞。将该注射器放置在分离架的托片上。调节注射器内的气泡，使之处在液面的中央。注射器要与光线垂直。打开电源开关，照射50分钟。然后将火柴杆轻轻拔掉，在尽量保持注射器平稳的情况下推送注射器柄，将前半部收集于精液瓶中(标记有Y、品种、牛号的80ml灼杯)，余下半部收集于另一精液瓶中(标记有X、品种、牛号的80ml灼杯)。被分离出的带X、Y精液占据注射器的部位见图4X、Y精子占据部位示意图。
两个精液瓶内分别加入第二液(Tris稀释液)14ml和甘油1ml。青、链霉素各1.5万单位，使分离后的X、Y精液各为30ml。加入甘油1ml的依据是加第1液的量一般为26ml，原精约4ml，不含甘油。若甘油比例为6.5％，则计算比例为93.5∶6.5=26∶XX=1.8≈2每个精液瓶分别为2÷2=1(ml)根据细管冷冻精液制作工艺规程，立即将分离稀释后的精液送入0-5℃冰柜内平衡3-4小时。细管除印有品种、牛号、生产日期外，需另有X或Y的印字。分装、计数后在冷冻箱内深冻12-15分钟。在40℃下行冻后活力检查。
包装时每个纱布袋标有种公牛站产品标记、品种、牛号、生产日期、活力及X或Y，放入液氮罐中长期贮存。
本发明人1998年内部保密实施本发明分离方法成功的对X、Y精子进行分离，产犊73头，其中母犊60头，其性别控制成功率82％。
实施例此发明宜在种公牛站进行。
X、Y精子分离前应先作好准备工作，在室温为18-25℃的条件下，主要是1、配好稀释液，配方为第一液 二者混合为100ml，调正在37-40℃第二液Tris稀释液柠檬酸6.768g葡萄糖5.5gTris 12.112g 甘油 32ml蒸馏水 345ml 卵黄100ml青霉素、链霉素各50万单位2、放置好分离装置，使分离架和300W光源保持43cm，灯光高度5.6cm。3、牛精液采出后立即进行精液质量判定，包括一般性状及活力，密度检查。合格的精液准确计算出精液的稀释量。每个100ml注射器内一般分离35亿精子(密度×鲜精量)。从集精管中倒入标记有牛号、品种的精液瓶中(80ml带刻度的灼杯)35亿精子的鲜精量，再用37-40℃的第一液进行稀释至30ml。用100ml注射器将稀释后的精液全部抽取出来，精液内留一小汽泡，其直径3mm为宜。注射器口用消毒后的火柴杆堵塞，放置在带铝片托的分离架上(分离架上分三格7、13、19cm，每格均可)。调节注射器与光线垂直并保持水平。打开灯光开关，照射50分钟后将火柴杆拔掉。轻推注射器柄，将前半部收集于标有Y的精液瓶中，后半部收集于另一标有X的精液瓶中。将这两个精液瓶分别加入第二液14ml和甘油1ml及青、链霉素1.5万单位，轻轻晃动。总共分离后的精液各为30ml。将其送入0～5℃的冰柜内平衡3-4小时。其后按细管冷冻精液制作工艺规程进行分装、深冻、镜检、包装、贮存等。细管、纱布袋要特别标记X或Y的字样以免混淆。
权利要求
1.牛X、Y精子流动分离法，利用X、Y精子有顺、反旋转的不同及逆流而上性，其特征在于分离方法是(1)将牛精液用奶、糖稀释液稀释；(2)将稀释后的精液抽取在注射器中；(3)将注射器水平放置用灯光照射；(4)X、Y精子在注射器内闭琐循环中自动分离为两部分排列，由此将X、Y精子分离。(5)分离后的精液再用Tris稀释液及甘油稀释；(6)塑料细管冻精。
2.如权利要求1的牛X、Y精子流动分离法，其特征在于稀释液配方为第一液 第二液Tris稀释液柠檬酸6.768g葡萄糖5.5gTris 12.112g 甘油 32ml蒸馏水345ml 卵黄 100ml青霉素、链霉素各50万单位
3.根据权利要求1的牛X、Y精子流动分离法，其特征在于按照下列方法分离(1)将牛精液用12％乳糖75毫升、10％奶粉25毫升混合稀释液稀释；(2)用100毫升注射器抽取30毫升稀释后的精液；(3)将注射器水平放置，用300W电灯光，距注射器43厘米距离对注射器垂直照射；(4)照射50分钟后，X、Y精子自动分离；(5)分离后的精液再用Tris稀释液及甘油稀释；(6)塑料细管冻精。
全文摘要
牛X、Y精子流动分离法属于动物繁殖方面的性别控制方法。是以全新的理论和全新的方法将X、Y精子分离。利用X、Y精子的不同旋转性及逆流而上性,经稀释后装入100cc注射器中,在一定距离一定光强的照射下,形成闭琐循环对流,50分后将X、Y精子分离。制成塑料细管冻精。性别控制成功率达82%以上。
文档编号A61D19/00GK1306805SQ0010148
公开日2001年8月8日 申请日期2000年2月1日 优先权日2000年2月1日
发明者杨承权 申请人:杨承权