专利名称：一种胶孢炭疽菌菌株及其用于生物除草的方法
技术领域：
本发明为一种胶孢炭疽菌菌株及其用于生物除草的方法，属于微生物应用于农业植物保护、防除农作物杂草的技术领域，专用于农田杂草的防除。
随着人们对化学除草剂残留、环境污染以及耐药和抗药性杂草发展的认识，绿色食品和有机农业的大力推广，研制生物除草剂防除杂草已成为生产实际的迫切需求；也是一个新兴的技术和杂草防除最活跃的研究领域。它具有投资少、研制周期短、专一性强、对环境安全和不产生污染等优点。被认为是未来化学除草剂的替代产品。目前，商业化的生物除草剂品种有80年代初研制出的DeVine和Collego以及90年代末推出的Comperico和Biochon。这些除草剂在控制相应的目标杂草上起到了重要作用，甚至是唯一的选择。如DeVine的持效性可以保证使用一次，2-3年无须再除草。有希望商业化的生物除草剂项目有数十项，其中稗草、野荸荠等具有十分诱人的前景。
波斯婆婆纳(Veronica persica Poir)是麦类、油菜等夏熟作物田的恶性杂草，对棉、玉米、大豆等幼苗生长也危害严重，蔬菜田、果园、草坪和园艺作物田中也常有发生。波斯婆婆纳的分布范围广泛，我国长江流域及华北地区均有其发生和危害的报道，另外它也是欧洲、西亚和美洲农田的恶性杂草。该杂草繁殖能力强，生长速度快，生长期长，耐药性强，人工、机械和化学防除比较困难。研制生物除草剂防除波斯婆婆纳不仅可以有效防除该杂草，而且对环境安全性高。目前，国内外尚无有关波斯婆婆纳的生物除草剂的研究报道，而该生物除草剂的开发将有极为显著的经济和社会效益。
本发明的目的是针对麦类、油菜等夏熟作物田以及棉、玉米、大豆等苗期的恶性杂草波斯婆婆纳(Veronica persica Poir)以及猪殃殃等，筛选一种胶孢炭疽菌菌株，用于生物除草，能安全有效地控制和防治恶性杂草波斯婆婆纳、大婆婆纳(Veronicadidyma)、直立婆婆纳(Veronica arvense)和猪殃殃等，成本低，无污染，对农作物安全。
本发明一种胶孢炭疽菌菌株及其用于生物除草的方法，其内容和实施方案如下胶孢炭疽菌菌株(QZ-97a)，(保藏单位中国微生物菌种保藏委员会；保藏日期2000年8月28日保藏号CGMCC NO.0483)，婆婆纳专化型(Colletotrichumgloeosporioides Penz.f.sp veronicae Sheng Qiang et Qing Zeng)，半知菌类(FungiImperfecti)，黑盘孢目(Melanconiales)，炭疽菌属(Colletotrichum Corda.)，胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)，PDA培养基上菌株QZ-97a的菌落呈桔红色或粉红色，菌丝体埋生，菌丝分隔、分枝，气生菌丝未见或极少；培养中不产生分生孢子盘，于基面菌丝及分枝上产生大量分生孢子，分生孢子梗短，单细胞，5-20×2-5μm。分生孢子单细胞无色，圆筒形或卵形，孢子大小为2-4×5-15μm，新产生的孢子具1-2个油球，产生时间较长的孢子具有若干大小不等的液泡；培养过程中常形成桔红色的粘孢子团；附着胞圆形或椭圆形，3-5×3.5-6μm，在发病寄主上分生孢子盘生于角质层下，圆形或近圆形，直径50-240μm，盘中无刚毛；条件不适时在培养基内产生菌核，直径20-120μm。
将上述胶孢炭疽菌菌株用于生物除草的方法为利用该专化型菌株的分生孢子以及菌丝的浓度为每毫升105至109，或者用该菌的分生孢子与1/8至1/20常规用量的化学除草剂配合使用。
上述胶孢炭疽菌菌株用于生物除草的方法为上述化学除草剂主要指使它隆、高特克、苯磺隆、2甲4氯、2，4-D、百草敌等。
发明人在对波斯婆婆纳的生物防治研究过程中发现了田间波斯婆婆纳的自然发病现象，故对其寄生真菌进行筛选研究。首先分离获得胶胞炭疽菌婆婆纳专化型(Colletotrichum gloeosporioides Penz sp.f.veronicae Sheng Qiang et Qing Zeng)菌株，研究发现其专化性强，对作物和其它绝大多数植物安全，但对波斯婆婆纳、直立婆婆纳、大婆婆纳和猪殃殃有很强的感染致病率，一周后的控制效果在85％以上。菌剂的培养条件、大批量生产方法均已进行了详细的研究；该菌的感染致病条件也进行了专门的研究工作。显示出该菌有较大的潜力开发成商品化生物除草剂。可用于油菜、棉花、小麦和蔬菜地控制上述4种杂草。
目前，国内外尚没有有关研究波斯婆婆纳的真菌除草剂的报道，这方面的研究对解决该草的防除将提供一个新的优良的途径。本发明采集到的波斯婆婆纳罹病植株茎叶上均可见大小不等的褐色病斑，病斑初为圆点状，直径约0.5-2.0mm，病斑扩大后为圆形或不规则形状，严重时多个病斑联合，致使叶片整个坏死。茎上的病斑先为圆点状，然后逐渐发展为椭圆形或条形，严重者茎整段坏死。在光镜下观察病叶可见粗细不等的菌丝从叶片中伸出，还发现3种不同形态特征的分生孢子。经过分离后得到4种真菌，其培养特征与致病特征如下经观察，PDA培养基上菌株QZ-97a的菌落呈桔红色或粉红色，菌丝体埋生，菌丝分隔、分枝，气生菌丝未见或极少；培养中不产生分生孢子盘，于基面菌丝及分枝上产生大量分生孢子，分生孢子梗短，单细胞，5-20×2-5μm。分生孢子单细胞无色，圆筒形或卵形，孢子大小为2-4×5-15μm，新产生的孢子具1-2个油球，产生时间较长的孢子具有若干大小不等的液泡；培养过程中常形成桔红色的粘孢子团；附着胞圆形或椭圆形，3-5×3.5-6μm，在发病寄主上分生孢子盘生于角质层下，圆形或近圆形，直径50-240μm，盘中无刚毛；条件不适时在培养基内产生菌核，直径20-120μm。
自然界采回的罹病波斯婆婆纳茎叶自上而下病症逐渐加重，上部茎叶具水渍状褐色病斑，圆点状，下部茎叶大片至整片烂死，病斑深褐色，表面可见桔红色或粉红色的孢子层。做病叶横切后镜检可见不具刚毛的分生孢子盘和大量与培养条件相同的分生孢子。
炭疽菌QZ-97a纯培养产生的孢子在波斯婆婆纳上的致病症状为茎叶上最初水渍状褐色病斑，圆点状，随后数量增加似麻斑，最后叶大片或整片烂死，茎则大段或全部烂掉，呈深褐色，其上可见粉色的分生孢子层，分生孢子盘密集排列。经观察，病斑表面的孢子与所喷施的炭疽菌孢子一样。
以上实验条件下的发病症状与自然病症相似。
按其特征鉴定为半知菌类(Fungi Imperfecti)，黑盘孢目(Melanconiales)，炭疽菌属(Colletotrichum Corda.)，胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)。该专化型主要侵染婆婆纳属(Veronica L．)植物以及猪殃殃(Galium aparine L.var.tenerum(Gren.et Godr.)Rehb.)，对水稻、小麦、棉花、玉米、大豆、油菜和大麦等主要作物高度免疫，以及供试的其它19科32种植物，26种高度免疫、6种免疫(表1和表2)，故可以用于小麦、棉花、玉米、大豆、油菜、白菜和大麦等作物田，防除杂草。
其培养方法为该菌可用下列培养基培养，并诱导产生分生孢子PDA培养基--马铃薯葡萄糖琼脂培养基马铃薯 200g葡萄糖 20g琼脂20g水 1LLEPDA培养基--波斯婆婆纳浸汁PDA培养基波斯婆婆纳茎叶 60g(洗净晾干，粉碎，过滤)马铃薯 200g葡萄糖 20g琼脂20g蒸馏水 1LCDA培养基。---CzapekDoxAgar培养基NaNO32gK2HPO4 1gKCl 0.5gMgSO40.5gFeSO40.01g蔗糖 30g
琼脂20g水 1LYEA培养基--酵母浸膏琼脂培养基酵母浸膏 30g琼脂 20g水1LPCA培养基--马铃薯胡萝卜琼脂培养基马铃薯 20g(煮沸1h，用细筛过滤)胡萝卜 20g(煮沸1h，用细筛过滤)琼脂20g水 1LMDYEA培养基--玉米葡萄糖酵母浸膏琼脂培养基玉米粉20g葡萄糖20g酵母浸膏 2g琼脂 20g水1LV6A培养基--V6蔬菜汁琼脂培养基V6蔬菜汁 200mlCaCO3 3g琼脂 20g水0.8LMSSA培养基--玉米粉豆粉蔗糖固体培养基玉米粉 15g黄豆粉 15g蔗糖15g琼脂20g水 1L玉米粉豆粉蔗糖液体培养基，按玉米粉豆粒蔗糖固体培养基配方，但去除琼脂。
该菌分生孢子的大批量生产可以用上述固体培养基的任一种进行固体培养。还可以液体发酵的方法(详见实施例2)。或者用液体-固体联合培养办法生产，其主要的步骤包括用玉米粉豆粉蔗糖液体培养基，对胶孢炭疽菌进行培养约4天，滤去培养残液，将菌丝在无菌条件下置于无菌滤纸上，350～380nm的近紫外光照射(12小时光照/12小时黑暗)，诱导产孢，无菌水收集分生孢子。
本发明的主要优点和积极效果如下胶孢炭疽菌婆婆纳专化型菌剂用于生物除草，可制成婆婆纳和猪殃殃专化型菌剂，可以在阔叶作物与这些杂草间进行安全地选择。常规防阔叶杂草的化学除草，几乎不能在阔叶作物与这些阔叶杂草间进行选择。在供试的42种植物中，对炭疽菌QZ-97a菌株不敏感的(高度免疫)有29种，稍敏感的(免疫)有9种，敏感的有1种，很敏感的有3种。从形态角度看，植物表面附属结构发达的植物对该菌较为敏感，而表面有蜡质、硅质的植物对该菌不够敏感。禾本科植物由于叶片竖立，叶面吸附性差，受害程度较小。而婆婆纳属杂草表皮毛和腺毛发达，叶片平展，叶面吸附性强，病害程度较重。从分类角度看，婆婆纳属的另两种杂草对该菌也很敏感，茜草科的一种杂草对该菌敏感，石竹科的两种杂草、牻牛儿苗科、菊科、锦葵科的各一种杂草对该菌稍敏感，而其他大多数科的杂草对该草不敏感。
表1供试杂草对菌株QZ-97a的敏感性
注不敏感(一)致病率在10％以下；稍敏感(+)毁炳翠征10～30％，与对照差异显著敏感(++)致病率在30％～60％，与对照差异显著；极敏感(+++)致病率在60％以上，与对照差异显著。
表2供试作物对炭疽菌QZ-97a的敏感性情况
根据以上测试结果，炭疽菌QZ-97a对作物和大多数供试植物安全，仅对婆婆纳属杂草以及猪殃殃等杂草敏感性较高，在麦田、油菜田、大豆、棉田和玉米田等旱田中可以安全使用，并能同时用于控制上述几种杂草。这再次表明了炭疽菌QZ-97a具有开发为防除波斯婆婆纳生物除草剂的潜力。
本发明用于生物除草，是利用活的生物本身，该生物是直接采集于农田自然环境，是目标作物田间及其环境中发生的目标杂草的天然致病菌，由于环境中已经存在，故没有在使用过程中的生态风险，加之，该菌株专化性强，对作物及其它非目标植物安全性高，不会导致对环境的残留危害。其菌体死亡后迅速腐化降解，其降解产物均为可循环有机物，不会因使用导致污染，因而，对环境安全，可用于生产出绿色或有机农产品。
对目标杂草控制效果可以达到85％以上，特别是苗期和衰老的植株。胶孢炭疽菌QZ-97a对波斯婆婆纳有最高的致病率(表3和表4)。
表3菌株QZ-97a与其他胶孢炭疽菌分离系对波斯婆婆纳致病力的比较
表4波斯婆婆纳株龄炭疽菌QZ-97a致病力的影响
(A-B为处理与对照之间的差异显著性；E-J为全部病指的差异显著性)
从野外采集到患病波斯婆婆纳的茎叶，记录植株发病症状，镜检。用波斯婆婆纳汁琼脂培养基进行病原真菌的分离。在显微镜下挑取各菌株的单孢子，分别接种在PDA培养基上，于黑暗，25±1℃下培养，观察病原真菌纯培养的菌落特征并测量各菌落直径。另取直径6mm的各菌落圆片接种在PDA平板中央，分别于7d后测量各菌落直径。
分别用不同浓度的各种病原真菌孢子悬浮液喷施波斯婆婆纳，观察各真菌的致病特性(表5)。
表5波斯婆婆纳病原真菌菌落特征的比较
*D1表示单孢子7d后形成的菌落直径D2表示6mm菌落圆片5d后形成的菌落直径表6从波斯婆婆纳植株上分离的几种真菌对波斯婆婆纳的致病力比较
从表6可知，以QZ-97a的致病率最高。实施例2将QZ-97a菌株在PDA培养基上培养7天，接种到玉米黄豆液体培养基中培养7天，过滤掉菌丝，得孢子悬浮液，用手持喷雾器喷施，接种到培养30天后的波斯婆婆纳上，保湿15小时以上。在处理1周后，可以完全杀死该草。实施例3按实施例2的方法，生产出孢子悬液，分别添加1/20-1/5倍的异丙隆、高特克、苯磺隆、2甲4氯、2，4-D、百草敌等，处理波斯婆婆纳、猪殃殃、大婆婆纳等杂草后，可以明显提高杀草的速度，减少5-24小时的保湿时间。
胶孢炭疽菌QZ-97a的分生孢子与低量化学除草剂配合应用，可以加快该真菌的侵染发病速度，减少对湿度的依赖性。在浓度为8.75×107个孢子/ml的炭疽菌QZ-97a孢子悬浮液中加入正常用量1/20剂量的使它隆(40％乳剂，陶氏益农公司，正常用量为0.32g治莠灵/lL水)、苯磺隆(75％干式胶悬剂，杜邦公司，正常用量为0.02g阔草清/1L水)、高特克(30％悬浮剂，江苏农药研究所南京农药厂，正常用量为1g高特克/1L水)、2甲4氯(60％可湿粉剂，辽宁抚顺化工厂，正常用量为0.8g／1L水)、百草敌(48％水剂，Sandos公司，1ml/1L水)。混匀后喷施到盆栽的波斯婆婆纳上，保湿1d后揭去保鲜袋，7和14d后检查并记录病害程度。日均温为18.3℃，各5个重复。
表1、低量化学除草剂对胶孢炭疽菌QZ-97a侵染波斯婆婆纳的影响
(A-B为处理与对照之间的差异显著性；E-J为全部病情指数间的差异性P＜0.05)
权利要求
1．一种胶孢炭疽菌菌株，其特征在于胶孢炭疽菌菌株(QZ-97a)，(保藏单位中国微生物菌种保藏委员会；保藏日期2000年8月28日；保藏号CGMCC NO.0483)，婆婆纳专化型(Colletotrichum gloeosporioides Penz.f.sp veronicae Sheng Qiang et Qing Zeng)，半知菌类(Fungi Imperfecti)，黑盘孢目(Melanconiales)，炭疽菌属(ColletotrichumCorda.)，胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)，PDA培养基上菌株QZ-97a的菌落呈桔红色或粉红色，菌丝体埋生，菌丝分隔、分枝，气生菌丝未见或极少；培养中不产生分生孢子盘，于基面菌丝及分枝上产生大量分生孢子，分生孢子梗短，单细胞，5-20×2-5μm；分生孢子单细胞无色，圆筒形或卵形，孢子大小为2-4×5-15μm，新产生的孢子具1-2个油球，产生时间较长的孢子具有若干大小不等的液泡；培养过程中常形成桔红色的粘孢子团；附着胞圆形或椭圆形，3-5×3.5-6μm，在发病寄主上分生孢子盘生于角质层下，圆形或近圆形，直径50-240μm，盘中无刚毛；条件不适时在培养基内产生菌核，直径20-120μm。
2．权利要求1所述胶孢炭疽菌菌株用于生物除草的方法为利用该专化型菌株的分生孢子以及菌丝的浓度为每毫升105至109，或者用该菌的分生孢子与1/8至1/20常规用量的化学除草剂配合使用。
3．根据权利要求2所述的胶孢炭疽菌菌株用于生物除草方法，其特征在于上述化学除草剂主要指使它隆、高特克、苯磺隆、2甲4氯、2，4-D、百草敌等。
全文摘要
本发明为一种胶孢炭疽菌菌株及其用于生物除草的方法,属于微生物应用于农业植物保护领域。胶孢炭疽菌菌株(QZ－97a),(保藏单位:中国微生物菌种保藏委员会;保藏日期:2000年8月28日保藏号:CGMCCNO.0483),属婆婆纳专化型。用该专化型菌株的分生孢子以及菌丝的浓度为每毫升10
文档编号A01N63/00GK1284558SQ0011250
公开日2001年2月21日 申请日期2000年9月4日 优先权日2000年9月4日
发明者强胜, 曾青, 朱春林, 戴宝江 申请人:南京农业大学, 南通江山农药化工股份有限公司