专利名称：植物体外培养中的起始方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养方法。具体来说，本发明涉及外植体的起始。
组织培养是一种公认和有用的用于繁殖许多种类植物的方法。在植物器官中，由于根表面及其内部富含土壤微生物，新挖出的根尤其难于作为体外培养的起始材料。
由根引发体外培养物的现有方法通常从表面清洗和消毒开始，然后获得用于培养的外植体。适当的表面消毒被普遍认为是成功开始体外培养的先决条件。针对这一目的，引入了各种化学物质作为消毒剂并且已建立了不同的消毒方案。普通的表面消毒方法包括浸在消毒剂中，比如浸在次氯酸钠中。为了获得外植体，通常使用得自根中柱的髓组织。含有脉管组织的外植体经常伴有高度污染，这是因为脉管系统可能含有表面消毒所不能清除的内部感染。在较小的根中，髓只占根的一小部分，因此很难将髓组织与根的其他部分分开。另外，分离根髓而不触碰脉管系统从技术上也是困难的。在髓柱切除方法中，使用软木钻孔器来协助该过程，但这一技术要求高，操作困难经常导致污染。而且，根髓分离步骤中会浪费掉多数根组织，在外植体有限的情况下这就是一个严重的问题。
即使用先进的表面消毒和操作技术，来自根组织的体外培养物也易出现高水平的污染。为了缓解这一问题已提出了各种方法。Tadashi在1998年召开的XXV国际园艺大会上提交的一份论文中描述了一种用于试管繁殖兰花和其他植物的简单技术，该技术不需将培养基灭菌或使用层流罩超净台。在该方法中，直接将一种消毒剂(次氯酸钠或二氯异氰脲酸钠)加入无菌培养基中。外植体和培养基的所有表面也喷洒了相同的消毒剂以减少污染。
在日本专利申请7264944中公开的另一种方法中，用超声清洗仪器对多浆植物的植物组织进行表面灭菌，用杀菌剂处理并用无菌水洗涤。
试图减少污染的许多其他尝试包括将抗生素应用到培养基中以减少根组织的内部感染。某些相关方法中，在表面消毒之后脉冲式地给予更高剂量的抗生素。但是，抗生素对真菌作用很小；而且使用抗生素还会引起选择抗性菌株的顾虑。另一方面来说，抗生素脉冲处理(APT)法将对根外植体施加一个强的处理后应变，影响愈伤组织的诱导、愈伤组织的生长和胚胎再生以及从应变中恢复的时间。此外，抗生素脉冲处理的整个过程是费时费力的。
与前面提及的问题相关联的后果是成功引发培养物的效率低。因此多数研究人员采用了一种对大量植物材料进行灭菌和培养的策略以便提高成功培养物的数量。这种作法需要额外的资源，包括植物材料、实验空间和人力。所用消毒剂对环境的负面影响进一步增加。
因此本发明的一个目的是提供一种提高植物根体外培养产量的方法。
图1的示意图显示根据本发明的一个实施方案从根组织切取外植体的方法。
图2的数据显示抗生素处理对由未进行表面消毒的根切取下来的外植体其污染率的影响。
图3显示由未进行表面消毒的西洋参(W)和人参栽培种D、E、L和R的根切取下来的外植体的累积污染率。该图表明外植体的污染率取决于植物的种类和品种。其中W西洋参；D、E、L和R人参栽培种。
因此，本发明提供了一种由植物器官制备外植体的方法，该方法中省略了表面消毒。一方面，该方法避免了存在于器官表面的污染物在打开组织的过程中感染内部组织。另一方面，可以无菌地接近并从器官中取下外植体材料以便进行体外培养。该方法易于应用在那些难以进行表面灭菌的植物根上。
在优选实施方案中，只将根组织洗干净并吸干水，无需作进一步表面处理。然后将根横切成两段，每段有一个暴露的横断面。根的断裂方式使得横断面上暴露的内部组织保持无菌。然后从根上取下内部组织并转移到合适的培养基上进行培养。
在最优选的实施方案中，给洗过并干燥好的根喷洒70％的乙醇并迅速过火以燃尽乙醇。然后在希望断开的位置作一个浅的横切口。然后在切口处将根横断开。用无菌解剖刀在横断面处经无菌划开并割取暴露的根组织。将得到的外植体培养在合适的基质中。
本发明基于这样的原理，即在植物器官(例如根)表皮界面以内的组织，除非由于疾病或机械损伤造成的内部感染，它们是无菌的。因此本发明的方法不是消除根外表面的污染物，而是涉及防止这些污染物在外植体切除过程中感染根的内部。建立了这样一种技术，由此不需首先将根的外表面消毒就可以无菌地得到根的内部组织。该技术的优点是使根组织遭受的胁迫最小化，从而保证有最好的可能的外植体材料来引发生成体外培养物。
本文中使用的术语“外植体”指用于引发生成体外培养物的任何植物材料。植物器官是指希望从中获得外植体的植物的任何部位，比如茎、叶或根。根是指任何地下植物器官，包括储藏器官比如球根和根茎等。消毒是指使微生物减至最少的一种处理。
以下的具体说明描述了一种应用本发明的基本原理从植物根中获得外植体材料的方法。但是本领域技术人员应当明白，以下描述的根组织的培养旨在阐述本发明，不应解释为对本发明讨论的原理的限制。本发明尤其可用于伸长形状的器官，其中组织培养者可以容易地用手指进行折断。在下面的讨论和权利要求书中，术语“包括”、“具有”和“包含”是开放式的，因此应解释为表示“包括但不限于……”。
在本发明的优选实施方案中，所述方法可以大致分为三个步骤(a)表面处理；(b)器官的分段；以及(c)取下外植体进行体外培养。
表面处理的最简单的方法是一个简单的清洗步骤在流动的自来水中仔细地洗器官(比如根)以便除去土和细小的根毛。在优选实施方案中，随后在含有几滴表面活性剂的1g/L benlate溶液中于不断搅拌下浸泡40-60分钟。在清洗步骤后，或在附加的benlate浸泡步骤后，将根在自来水下彻底漂洗，并吸干水分。在最优选的实施方案中，在浸泡前，向1g/L benlate溶液中加入几滴吐温20。然后优选给根喷洒70％的乙醇并迅速过火以燃尽乙醇。
根的分段包括将其以内部组织不会被任何根表面的污染物污染的方式断成两段。在一个方法中，由组织培养者简单地将根断成两段，例如通过弯成U型。由于弯曲动作，根会裂开，从而在每段的一个端口形成一个开放和暴露的横截面，进而保证暴露的横截面不被污染。参见
图1A-C，另一种方法包括在根19上横向地作一个小的浅切口18。例如，可以作1-2mm深，3-5mm长的切口。然后在切口相对的一边(箭头20所示)将根弯曲以便将根折成两段26和28。同样，要小心以确保表面污染物不会感染暴露的内部组织。
然后可以通过无菌操作取出根的内部组织(包括髓和脉管组织)得到外植体，并将外植体材料置于合适的培养基中。在优选实施方案中，组织培养者用例如手或手指牢固地把持外表面，同时用无菌手术刀仔细地划开并挖出内部组织。从内部组织上取下外植体材料，要避开接近表皮的区域，每段留下一个空的外组织柱体。刮出来的部分用虚线表示。尽手术刀刃所能及地从段中取出内部组织。为了接近更多内部组织，在与空末端有一些距离的位置断开根段。
图1B显示了位于节段28所选位置上的第2个小的浅切口34，在与切口34相对的位置22弯曲根。第2个切口产生了两个小片段30和32。小片段30有一个空末端和一个有与切口位置相应的新暴露的内部组织的第2末端。再用无菌手术刀划开并挖掘从而将每个小片段的内部组织无菌操作取出(虚线表示)，并将外植体转移至合适的培养基。可以重复以上步骤直到取下了所有片段和小片段上的外植体材料。
所述培养基包含生长调节剂和标准基础培养基比如MS培养基(在以下实施例中定义)或任何其他适合引发生成体外培养物的培养基，比如G5、SH和White等。
实施例由人参的根引发生成体外培养物材料与方法材料本研究中使用了5年龄人参和西洋参的新挖出的根。这些根平均直径为2cm。小心清洗除去根上的土和细小的根毛，然后在1g/L benlate溶液(含有几滴吐温20)中于不停搅拌下浸40-60分钟。Benlate处理后，将根在流动的自来水下彻底清洗并吸干水分。这样它们就可用于在层流罩超净台中切取外植体。
外植体切取给上面洗过的根喷洒70％的乙醇并迅速过火以燃尽乙醇。然后用手术刀给根做标记。在表面上形成一个1-2mm深、3-5mm宽的切口，然后用手折成两段。一只手持一个片段，用新手术刀仔细地切取(挖出)根组织并将外植体置于培养基上。尽手术刀刃所能及地将表皮界线以内的根组织切出。此后在另一个片段上进行同样的操作。由于根没有做表面消毒，应注意不要切取根断开前以手术刀标记的区域，这是因为污染物可能通过手术刀从根表面扩散到标记区域。
无法继续切除外植体时，在根片段上做一个新切口，将该片段折成另外两段以便进行新一轮外植体切取。重复几次制备根片段和切取外植体的步骤，直到再无法形成片段，整个根表皮界线以内几乎切空了。对于对照处理，在2-3％次氯酸钠(NaOCl)溶液中将根表面消毒40-60分钟，然后分成两组。一组按照Teng和Nicholson(植物细胞报导16531-535，1997)的描述再接受抗生素脉冲处理(APT)。第二组在NaOCl消毒后直接进行培养。
培养条件将所有的外植体接种到培养基中，于23-25℃置暗处。培养基是MS(Murashige和Skoog,1962)基础盐附加0.5mg/l硫胺素-HCl、0.5mg/l吡哆醇、0.5mg/l尼克酸、1mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、2mg/l甘氨酸、100mg/l肌醇、3g/l phytogel和30g/l蔗糖。高压灭菌前将培养基pH调至5.8-6.0。对添加抗生素的情况，各以250mg/l浓度添加过滤除菌的青霉素-G和硫酸链霉素。将培养在抗生素培养基中的外植体保温2个月后转移到无抗生素培养基中。
使用了包括西洋参和人参的两个种的人参，后者包括在中国东北广泛栽培的4个栽培种。对于每个种/栽培种使用了5-10个根，每个根看作一个重复实验。从一个根切下来的外植体材料足够接种10-15个培养皿，每皿含6个外植体。将这些培养皿看作每个重复实验中的平行样品。在开始的两周内，隔天评估一次感染率和愈伤组织的诱导，以后每月做一次。按月将外植体常规地转移至新培养基中。
结果参见表1，本发明的外植体制备方法不需经过表面消毒，得到了明显优于使用表面消毒剂的传统作法(称为传统方法)的结果。对于通过本发明方法由根得到的外植体，7个月后的累积污染为7-8％。而来自经传统方法用2-3％NaOCl溶液处理40-60分钟的根的外植体，其污染率为85％。附加抗生素脉冲处理(APT)，尽管显著地提高了引发培养物的成功率，污染率仍达到了50％。
表1
a．根在2-3％的NaOCl溶液中表面消毒40-60分钟。表面消毒后给根添加(+)或不加(-)APT。
b．来自未表面灭菌的根的外植体在加有(+)或未加(-)250mg/l青霉素-G和硫酸链霉素的培养基中培养。
参见图2，结合本发明在培养基中加入抗生素时，第一个月里污染率进一步下降；差别在第二个月中缩小，8个月后就不明显了(还可参见表1)。由于抗生素带来的成功率的提高小于4％，并且其有益效果随时间而减小，因此认为没有必要在培养基中加入抗生素。
再参见表1，来自本发明方法的外植体上发生污染时，是随机地从髓、脉管组织和皮层开始的；而对于来自传统方法的外植体，污染主要从脉管组织开始。在后一种情况中污染由脉管组织起始暗示了脉管系统甚至在根收获前就发生了内部感染，这可能涉及水和营养物质的摄取及运输的特殊功能。这类内部污染无法通过表面消毒来消除，但正如由与无APT处理组相比，APT使污染下降35％所看到的，可以利用APT来尽量减少之。
即便附加APT的传统方法仍有高水平污染(见表1)，由此判断污染一部分归因于内部感染。本发明方法与传统方法之间内部感染结果的显著差异的原因尚不清楚，由于研究用的根来自相同的来源，两种方法制备的外植体发生内部感染的机会应当没有差别。可能内部污染物更容易在遭受强烈胁迫(例如，表面消毒)的外植体上生长。相反地，在未受胁迫的外植体上它们可能处于潜伏状态。已建立的稳定的人参培养物上偶尔出现的污染可能与这种潜在污染(比如内部感染)能潜伏数月到数年有关。
现在参见图3，植物的种和栽培种差异是影响本发明方法效率的主要因素。在所用的四种西洋参栽培种中，栽培种“E”最易感染，8个月中的污染率达到20％，其次是栽培种“L”。在栽培种“R”中观察到最低的污染率，为3％左右。栽培种“D”的污染率与人参的类似，在4％左右。
与传统方法相比，除了提高起始培养的成功率，本发明方法能缩短诱导愈伤组织所需时间。由本发明方法制备的外植体在几天后变黄，并在一周内显示出第一个可见的诱导出愈伤组织的迹象。由传统方法制备的外植体在1-3周后变黄，并根据所受胁迫的程度在3-4周后显示出第一个可见的愈伤组织诱导迹象。还记录了利用本发明方法的明显的愈伤组织生长情况，如表2所示。该结果提供了另一个证据表明表面消毒和附加APT对外植体有化学胁迫作用。
表2
a．根在1-3％的NaOCl溶液中表面消毒30-60分钟。表面消毒后给根添加(+)或不加(-)APT。
b．来自未表面灭菌的根的外植体在加有(+)或未加(-)250mg/l青霉素-G和硫酸链霉素的培养基中培养。
总之，本发明方法比传统方法有几个优势(1)不需要化学消毒剂，使得本发明方法对环境无害，(2)不需要表面消毒，简化了外植体制备过程，(3)最大程度地利用根组织，对珍贵材料来说尤其重要，以及(4)可获得高成功率，这将提高整个效率。最重要的是，不预先进行表面消毒从根切取外植体的概念打破了处理根时，必须进行表面消毒的一般观点。预计该方法可以应用于其他地下或地上储藏器官，以及其他植物器官。
参考前面提及的图表，并以人参种的根为重点具体描述了本发明，但应当明白附图仅用于说明，不应看作对本发明的限制。另外，显然本发明所述方法可用于许多需要无菌组织的应用。预计本领域技术人员在不脱离所述发明的精神和范围的情况下可以作出许多改变和修正。因此，同样的技术可能应用到那些可以无菌地获取和刮出内部组织的茎和其他多汁植物器官。这类器官看作是根的等同物，并落在所附权利要求书的范围内。
权利要求
1．一种体外培养植物器官的方法，包括清洗所述植物器官，但无须进行表面消毒；将所述器官折断从而产生两个横截面，所用方式使得断裂暴露的器官内部组织不被污染；无菌地切取表皮界线内的所述未污染组织；在合适的培养基中培养该取出的未污染组织。
2．权利要求1的方法，其中所述器官是植物根。
3．权利要求1的方法，在所述折断步骤前另外包括一个切开所述器官表皮的步骤，该切口在所述表皮的表面上希望断裂的位置上作出。
4．权利要求1的方法，在所述折断步骤前另外包括一个将所述器官浸在化学溶液中的步骤，该清洁溶液能使真菌数量减至最少。
5．权利要求1的方法，在所述折断步骤前另外包括一个将所述器官浸在化学溶液中的步骤，该化学溶液包含含有benlate的杀真菌活性组合物。
6．权利要求1的方法，在所述折断步骤前另外包括一个切开所述器官根表皮的步骤，该切口在所述表皮的表面上希望断裂的位置上作出；通过避开紧靠该切口的区域，再进行所述的切取步骤。
7．权利要求1的方法，在所述折断步骤前另外包括一个部分固定表面污染物的步骤。
8．权利要求1的方法，还包括一个给所述根表面喷洒乙醇并通过快速过火燃尽所述根上的乙醇的步骤，该喷洒步骤在所述折断步骤前进行。
9．一种体外培养植物根的方法，包括a)清洗所述植物根表面；b)将表面污染物部分固定在所述根的表面；c)对根进行横向切割产生一个浅的切口；d)在不污染所暴露出来的根内表面的情况下，将所述根折成两个横段；e)无菌地取出表皮界线内的未污染根组织；以及f)在合适的培养基中培养所述取出的未污染根组织。
10．权利要求9的方法，其中步骤a)不涉及消毒。
11．一种体外培养植物根的方法，包括a)清洗所述植物根表面；b)给所述植物根喷洒乙醇；c)短暂地烧一下根；d)将根横向切出一个大约1-2mm深，3-5mm长的切口；e)在不污染所暴露出来的根内表面的情况下，将所述根折成两个横段；f)无菌地取出表皮界线内的未污染根组织；以及g)在合适的培养基中培养所述取出的未污染根组织。
12．权利要求11的方法，另外包括h)将所述横段中的一段横向切出一个大约1-2mm深，3-5mm长的第二切口；i)在不污染所暴露出来的根内表面的情况下，将该段折成两个小片段；j)从该小片段所暴露出的内表面下无菌地取出未污染的根组织；以及k)在合适的培养基中培养所述取出的未污染根组织。
13．权利要求12的方法，还包括在产生的另外的小片段上重复步骤(h)到(k)。
14．权利要求11的方法，其中步骤a)包括在水中冲洗，然后浸在含有benlate的杀真菌活性组合物中。
15．一种由植物器官引发生成的体外植物培养物，所述培养物由无需消毒步骤的方法得到。
16．权利要求15的体外植物培养物，其中所述植物器官是根。
17．一种来自由植物器官引发生成的体外植物培养物的植物，所述培养物由无需消毒步骤的方法得到。
18．权利要求17的植物，其中所述植物器官是根。
全文摘要
一种由植物器官制备外植体的方法,其中省略了表面消毒。一方面,该方法避免了存在于器官表面的污染物在暴露组织的过程中感染内部组织。另一方面,可以无菌地接近并从器官中取出外植体材料以便进行体外培养。该方法易于应用在那些难以进行表面灭菌的植物根上。
文档编号A01H4/00GK1296738SQ0012280
公开日2001年5月30日 申请日期2000年8月25日 优先权日1999年8月27日
发明者滕惠兰 申请人:香港生物科技研究院有限公司