专利名称：一种耐铵工程菌和含有这种工程菌的生物肥料的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种耐铵工程菌和含有这种工程菌的生物肥料。
自1976年巴西Dobereiner实验室报道从禾本科植物根际分离得固氮螺菌(Azospirillum spp)，并测定固氮螺菌对宿主的氮素供应达2KgN-ha-1 d-1(后来的研究表明由于测定方法的问题，此数值偏高)。激起世界范，围的研究热。各研究组相继从禾本科作物根际分离多种固氮菌(统称联合固氮菌)包括肠杆菌科、固氮菌科、芽孢杆菌科、假单孢菌科、螺菌科的细菌.但研究最多的还是固氮螺菌，，大量的文献报导固氮螺菌的生理，生化及遗传特性并用固氮螺菌在田间做了大量的接种实验。目前国际上固氮微生物制剂商业产品中最主要的是根瘤菌。以联合固氮菌Azospirillum为主要商业产品只有法国的AzogreenTM，意大利、法国、比利时联合生产的Zea-Net TM，美国的Azo-Green墨西哥的Biofertilizonepara Maiz.这些产品商业规模都不大。1993年在乌拉圭召开以固氮螺菌的农业应用为题的国际研讨会总结了20年来用固氮螺菌的田间接种实验，由此研讨会总结的资料可反映出联合固氮菌在田间接种的概况。20年的实验表明在不同地区和气侯条件下接种联合固氮菌对农业上一些重要作物如玉米、水稻、小麦是有增产作用的，虽然很难精确估计接种实验成功的百分数，用统计学上有意义的增产率5-30％计算，实验的成功率在60-70％(有些失败的试验未报道)。但至今接种实验所用的菌株都是野生型菌株，在中国用野生型联合固氮菌研制的菌剂产品名目繁多，良莠参杂，据统计生产生物菌肥的厂家不下300家。应用菌株主要是肠杆菌科的联合固氮菌Klebsila pneumoniae，芽胞杆菌及根瘤菌。生产量最多并形成产品的有保定微生物所生产的小麦根际联合固氮菌剂，玉米根际联合固氮菌剂，推广面积达几百万亩，但由于增产效果不稳定已停产。
国外实验室用遗传操作构建不同类型耐铵沁铵工程菌的研究仍仃留在温室盆栽阶段(Colnaghi et al 1997)，(Fujii et al 1987)，(Christiansen et al1991)。1996年用外源dctABD基因及修饰的nifA基因重组的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)的接种实验在美国已进入大田应用阶段。国内自1988年863高技术研究发展计划设立了水稻及玉米联合固氮工程菌研究课题，两课题组成功地构建了数株不同性能的工程菌并进行了田间小区实验，八五期间广东微生物所在广东省中国农科院原子能利用研究所在江苏省用水稻联合固氮工程菌进行了数十万亩大面积接种试验，增产率分别达到8.4％及5-7％。经中国专利信息中心计算机检索从1980-1994年11月国内外没有有关联合固氮菌菌肥专利的报道，2000年1月由中国科学院文献情报中心做的查新报告结果指出国外文献中未见有关联合固氮耐铵工程菌进行田间试验的报道，国内未见用联合固氮菌构建耐铵工程菌在田间接种玉米获得成功的报道。1950-2000年美国专利，1976-2000年日本专利，1985-2000年中国专利没有有关联合固氮工程菌菌肥专利的报道。，田间接种成功受很多因素影响，它依赖于起始细菌的特性，植物品种、土壤类型、接种量和环境条件，而要更好的发挥接种微生物的作用，其中一个重要环节是研究接种剂的配方，(包括菌和载体)以提供一个合适的微环境以保证在产品贮存、运输、施用到土壤后，接种微生物的存活率。联合固氮菌多数是非芽胞杆菌在土壤中存活率低对菌剂中保持菌种存活率的条件要求亦更高.。以草炭作为接种剂载体10年前在根瘤菌制剂上已得到成功，并广泛得到应用。由于草炭是一不确定的复杂有机物，使制造、贮存，应用过程有很大变异性，近10年有很多关于新的合成聚合物和天然聚合物用作为微生物包裹剂，用这些聚合物包裹的细菌细胞制成新型的微生物制剂，改进了传统草炭菌剂的缺点，大大提高了微生物接种剂的在土壤中存活率，抗干旱能力和生物效益，是很有潜力的，如法国的Azogreen TM但这类产品仍存在价格高，制作难度大，对产业化设备要求高的问题。同时很多研究亦表明混合接种剂(多种微生物组合)对植物的效应优于单一菌种，这也是微生物菌剂生产的一种趋势。
本发明的一个目的是提供一种经过生物工程改造的耐铵工程菌。
本发明的另一个目的是提供一种生物肥料。
本发明人通过将筛选到的一种新的联合固氮菌，日勾维肠杆菌(Enterobacter gergoviae)57-7(保藏号为CGMCC No.0510)，通过基因工程改造得到一种耐铵工程菌(日勾维肠杆菌Enterobacter gergoviaeE7)，并在中国微生物军种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏(保藏中心地址中国，北京，中关村，邮政编码100080)，保藏号为CGMCC No.0511。保藏日为2000年11月28日。
耐铵工程菌Enterobacter gergoviae E7的特性1.耐铵工程菌E7的构建根据K.pneumoniue中固氮基因表达的调控机制，当nifA基因组成型表达，超量的nifA基因产物消除了nifL产物的阻遏作用，通过改造nifA基因，构建解除NH4+阻遏的耐铵工程菌使固氮菌在10mmol/L NH4+以上合成固氮酶。
重组质粒pCK3由美国C.Kennedy实验室构建，(C.Kennedy 1985)是由pRK290质粒(Ditta 1980)与pMC73A质粒(Buchanan-Wallaston 1981a)整合而成。重组质粒的载体是pRK290广宿主范围低拷贝数的质粒，质粒大小为20Kb.具有二单一的限制性内切酶位点Bgl II和EcoR I和四环素抗性标记基因.pRR290中Bgl II位点整合来自pMC73A质粒BamH IDNA片段。BamH I片段含K.pneumoniae nifB启动子控制的抗卡拉霉素基因及完整的nifA基因及nifL片段，由于nifL启动子缺失，nifA基因的表达受pRK290质粒上四环素抗性基因启动子控制是组成型表达的。pCK3重组质粒具有四环素及卡拉霉素抗性标记，是低拷贝数的质粒只有在助质粒pRK2013存在下才能在革兰氏阴性菌间转化，并能在革兰氏阴性细菌中自行复制。
重组质粒pCK3在助质粒的pRK2013帮助下通过三亲杂交，转化到受体菌E.gergoviae 57-7中获得转交子E.gergoviae 57-7/pCK3。转交子在含300mmol/L甲胺的平板上反复筛选得到抗甲胺并具有部分泌铵能力的耐铵工程菌E.gergoviae E7作为进一步的实验菌株。
2.耐铵工程菌E7特性
转交子E.gergoviae 57-7/pCK3在含抗生素的无氮KP培养基中的生长速率与固氮活性的消长规律与野生型菌相同，用抗固氮酶铁蛋白抗体作为第一抗体的免疫印迹实验表明转交子在50mmol/L NH4+中仍能合成固氮酶，乙炔还原实验表明转交子在50mmol/L NH4+中恢复76％固氮活性在100mmol/L中恢复52％固氮活性，而野生型菌在10mmol/L NH4+就不能合成固氮酶，没有固氮活性。NH4+对E.gergoviae57-7及E.gergoviae 57-7/pCK3固氮活性的影响
携带目的基因nifA的重组质粒pCK3在有抗性协迫条件下能在受体菌中稳定复制并表达。因nifA基因是受体菌本身具有的，nifA基因的组成型表达使受体菌具有耐铵能力，而在没有抗性协迫条件下重组质粒pCK3在受体菌E.gergoviae 57-7不稳定，在宿主细胞连续裂殖过程中pCK3随宿主细胞裂殖而自行丢失，在LB培养基中当宿主细胞裂殖50代pCK3的缺失达50％而宿主细胞裂殖110代pCK3质粒只存留0.1％。
采用Ap.Km.Tc三种抗性同时监测工程菌E7。经Rep-PCR基因组指纹图谱分析得到E7的特征图谱。
本发明还提供了一种生物肥料，它含有本发明的耐铵工程菌E7。这种生物肥料中所使用的载体可以是草炭。
实施例在佳木斯田间小区接种E7，10天后的幼苗玉米根系含E7菌量5×105CFU/克干根、根际土3.5×105CFU/克土、根外土0.2×103CFU/克土。20天后菌数达5.6×105CFU/克干根、6.2×105CFU/克根际土、0.2×103CFU/克根外土。到了抽雄期，玉米根系含E7菌数下降至3×102CFU/克土根，根际土含E7菌数下降为0.3×102CFU/克土，根外土中E7菌数为零，在地下水中一直监测不到E7的存在。
玉米联合固氮工程菌E7在根、土壤、地下水中的存活(佳木斯农垦作物所1999年)
接种量＞1×107cfu/种子土壤草甸土培养基改良KP培养基+Ap100，Km50，Tc12.5
在气温较高的北京实验地E7的消长规律与佳木斯相同。在自然条件下E7随着根系生长而繁殖，但由于没有抗生素协迫，pCK3质粒容易丢失部分E7回复成野生型。
用E57-7和E7接种在盆栽缺氮条件下培养的玉米幼苗和田间小区施氮肥条件下生长的玉米，发现接种使玉米根的次生根增加，根系总长和干重也明显增加，接种工程菌E7比接种野生型E57-7更显著地促进玉米根系的生长和发育。将载有nifH-gfp融合基因的质粒pMGFP21导入E57-7，并接种玉米幼苗，由于受化合态氮、氧和碳源等因素的限制，nifH-gfp融合基因在玉米根际不能表达。进而将载有能组成表达nifA基因的质粒导入E57-7/pGFP21，其中nifH-gfp的表达不再受化合态氮、氧等因素的遏制，耐铵工程菌在玉米根表面上表达了nifH-gfp。用15N同位素稀释法也证实，玉米幼苗接种E7后，幼苗在34天里吸收的氮素中有14％源于生物固氮，而接种E57-7的固氮百分率为0。耐铵工程菌E.gergoviae E7与玉米联合固氮
15N同位素稀释法，盆栽实验每项处理10盆每盆1株，37天苗龄E7在无机盐培养基中生长，能向胞外分泌吲哚乙酸、赤霉酸、玉米素等植物激素。工程菌E7由于不仅能分泌植物激素，而且能持续固氮并向玉米提供氮素，因此能比接种E57-7更显著地促进玉米根系的生长和发育，增强根系吸收水分和营养的能力，进而促进植株的生长和发育，在适宜的农艺管理下，就能使玉米显著增产并节省氮肥。
2.菌剂制备及接种方式用含50μg/ml卡那霉素的KP培养基培养工程菌E7，固体平板培养基含1.5％琼脂，种子罐及大罐培养基含50mmoles NH4+。30℃培养16-18小时菌数达8×109CFU/ml，用草炭作载体与菌液混合(7∶3)制备菌剂，使菌数达1-2×109CFU/克菌剂。
KP培养基配方Na2HPO4.12H2O 32g/LKH2PO40.68g/L PH8.0柠檬酸铁 36mg/LMgSO430mg/LCaCl2.2H2O 26mg/LMnSO40.3mg/LNa2MoO4.2H2O 7.6mg/L蔗糖 20g/L酵母粉0.5g/L草炭菌剂采用拌种，做底肥或拌种加底肥，三种施用方法在田间小区做接种实验。在正常施肥条件下三种施用方法皆比无菌对照有增产作用。按增产幅度计算拌种加做底肥＞做底肥＞拌种。施用量为1kg/666.7m2，5×107CFU/种子。工程菌的田间应用效果1995-1998年连续4年，在吉林省及黑龙江省农垦地区采用适宜的农田管理条件在田间小区接种工程菌E7比接种野生型菌及无菌载体显著地促进了玉米增产及节省氮肥，为进一步大田应用提供了依据。
接种耐铵工程菌E7对玉米生长的影响以1997年宝泉岭农场试验为例，在砂壤土的田间小区试验结果表明，接种工程菌E7与接种野生型菌和无菌载体相比，在不同生育期地上部分、地下部分干重皆有明显增加，这种效应在苗期比较明显。
接种工程菌E7对玉米生长的影响(宝泉岭农场1997) 注玉米品种为四早11号，覆膜育苗，施肥量NPK＝20kg/666.7m2接种工程菌E7对玉米的增产效应试验结果表明，无论在土壤肥力较高的草甸黑土或土壤肥力较低的白浆土，砂壤土及黑土、黑钙土中接种工程菌E7对玉米产量的影响皆优于野生型菌及无菌载体，但增产的幅度与土质有明显相关性。在土壤肥力较低的白浆土、砂壤土中，不论施用化肥量为16.8kg/666.7m2或20kg/666.7m2，接种工程菌E7皆比接种无菌载体及野生菌对产量的影响大，接种工程菌E7比无菌载体增产平均幅度达到12.3％，而接种工程菌E7比接种野生菌E57-7平均增产8.8％。多数实验点的生物统计表明差异达到显著水平(P＝0.05)
在白浆土、砂壤土中接种工程菌E7对玉米的增产效应
*生物统计差异显著(P＝0.05)
在黑土及黑钙土试验田，接种工程菌E7比无菌载体增产平均幅度达到14.6％生物统计表明差异达到显著水平(P＝0.05)而接种工程菌E7比接种野生菌E57-7平均增产4.7％。在黑土、黑钙土中接种工程菌E7对玉米的增产效应
生物统计F测定各处理间差异显著，用L.S.D法多重比较，E7及E7+K处理，效果皆高于WT及CK，产量差异显著或极显著。除化肥外加施农家肥2m3/亩。
K为硅酸盐细菌(复合菌剂的效果比单一菌好)。
在肥力较高的草甸黑土中，当NPK施肥量在20kg/666.7m2时，接种工程菌E7与接种野生菌E57-7和无菌载体CK相比对玉米产量的影响差别不大，增产幅度只有2.6％。但当降低化肥用量至16.8kg/666.7m2时接种工程菌E7增产幅度提高。
在草甸黑土中接种工程菌E7对玉米的增产效应
接种工程菌E7的节肥效应1997-1998年在黑龙江省土质为白浆土砂垠土的试验田做小区节肥试验，节肥实验方案化肥N∶P∶K＝2∶1∶0.3，NPK＝16.8kg或20kg/666.7m2。(1)对照+100％氮肥；(2)野生型菌株E57-7+100％氮肥；(3)野生型菌株E57-7+90％氮肥；(4)工程菌E7+100氮肥；(5)工程菌E7+90％氮肥；(6)工程菌E7+80％氮肥。
每项处理用磷酸二铵和氯化钾做种肥，施用量相同。在玉米生长至大喇叭口期施不同量的尿素做追肥，100％氮肥指正常施氮量，90％、80％氮肥指施氮量为正常施氮量的80％、90％。
当降低氮肥用量至正常施氮量的90％，接种工程菌E7仍比正常施氮量(100％N)下接种无菌载体使玉米增产，分别为17.9％，10.2％，5.6％，1.6％和-2.6％。而当氮肥用量为正常施氮量的80％时，接种工程菌E7比正常施氮量(100％N)下接种无菌载体平产或略减产。结果表明，在玉米相同产量水平上接种工程菌E7比接种无菌载体节省15％-20％氮肥。
当降低氮肥用量至正常施氮量的90％，接种工程菌E7比正常施氮量(100％N)下接种野生型菌使玉米增产，增产幅度分别为9.6％，5.9％，7.9％，1.2％ 和-5.2％，而当氮肥用量为正常施氮量的80％时接种工程菌E7比正常施氮量(100％N)下接种野生型菌平产或减产。结果表明，在玉米相同产量水平上，接种工程菌E7比接种野生型菌节省15％氮肥。
玉米田间小区接种工程菌E7的节肥效应(1997-1998年) NPK总施用量20Kg/666.7m2，土质为白浆土，或砂壤土。*生物统计差异显著(P＝0.05)
1999年在黑龙江省进行400亩大田(白浆土)接种工程菌E7示范对比实验，增产幅度达到7.3％(由于接种剂质量及当年气温较低影响增产幅度)。玉米联合固氮工程菌E7大田示范实验(1999年)
菌剂E＜1×109CFU/克草炭，菌剂拌种，玉米直播.N∶P∶K＝2∶1∶0.31999年4-7月黑龙江地区气温偏低，比往年低5℃采用沟施法接种，E7接种量为2Kg/菌剂/666.7m，E7菌数＜109CFU/克菌剂
权利要求
1.一种耐铵工程菌，日勾维肠杆菌Enterobacter gergoviae E7，保藏号为CGMCCNo.0511。
2.一种生物肥料，含有权利要求1所述的耐铵工程菌。
3.按照权利要求1所述的生物肥料，还含有草炭。
全文摘要
本发明涉及一种耐铵工程菌,日勾维肠杆菌Enterobacter gergoviaeE7,保藏号为:CGMCC No.0511。本发明还涉及一种生物肥料,含有权利要求1所述的耐铵工程菌。
文档编号C05F11/08GK1355294SQ0013362
公开日2002年6月26日 申请日期2000年11月29日 优先权日2000年11月29日
发明者李久蒂, 李永兴, 董越梅, 安千里, 王继文, 匡柏健 申请人:中国科学院植物研究所