专利名称：生物工程改良水稻品质的方法
技术领域：
本发明涉及水稻育种技术，特别是用生物工程改良水稻品质的技术。
背景技术：
水稻是我国重要的粮食作物，对稻米品质的改良一直是水稻育种家追求的目标之一。稻米品质涉及米粒大小和形状、颜色、光泽、垩白及透明度等因素，其改良是十分复杂的。至今常规的水稻育种都是沿用杂交育种技术，即挑选米质优秀的父本和母本相互杂交，通过性状互补方式改良米质。此方法取得了不少成绩，培育出了许多品质改善的水稻品种，但它只能改良品质中的某些指标，不能使品质综合指标达到理想程度，同时由于性状连锁，在改良品质时，其他不良农艺性状也伴随传递进来，难以选育出品质优良而其他农艺性状也优秀的水稻品种。
我国长期以来只重视水稻高产，忽视品质改良，故我国稻米品质的总体水平较低。就稻米品质改良而言，稻米中直链淀粉含量、垩白度(率)和透明度的改良难度较大，且尚无良策。
发明内容
本发明要解决的技术问题是有效改良水稻品质，使稻米诸项指标——米粒长度、透明度、垩白率达到最佳程度。
本发明采用的技术方案其特殊之处是包括步骤①将除草剂基因转入一选定的水稻品种，再选取一水稻品种与其杂交，栽培后收获得杂交种F0代种子；②F0代种子经诱变处理后播种、栽培、收获得到与品质相关基因突变的诱变种F1代种子，选取其中的品质优良的突变体F1优；
③F1优种子播种、栽培得F2代植株，选取其中对所述的除草剂敏感的植株，培育后得到F2代种子，作为稻种。
所述的选取品质优良的突变体F1优，是指F1代种子中米粒长度、透明度、垩白率指标优秀的种子，淘汰米粒长度与所选亲本相似无变化的种子；对所述的除草剂敏感的植株，是指对除草剂无抗性的植株。
可以在步骤③中选取对除草剂敏感的植株后，再从其中选取优良植株，并从该优良植株的结种中选取品质优良的种子F2优，所述的稻种是指F2优。
为重复考察综合性状，获得品质稳定的种子，可以将F2代种子播种、栽培，优选将F2优种子播种、栽培，得F3代植株，从其中选取优良植株，收获得F3代种子。
还可以将F3代种子播种、栽培得F4代植株，从其中选取优良植株，收获得F4代种子。
本发明所述步骤①所选的两种水稻品种，优选为粳稻品种C211和京引119；所述诱变是用化学诱变剂EMS(甲基磺酸乙酯)+NEU(1-甲基-3-硝基-亚硝基胍)处理。
本发明所述的米粒长度、透明度、垩白率指标优秀是指米粒长度长，透明度高，垩白率低。
将抗除草剂基因转入一选定的水稻品种，可以用基因枪或农杆菌转化法实现，使该品种作为母本具有抗除草剂特性，以此作为选择标记，以便在以后的各个环节中识别母本的遗传成份。本发明所用抗除草剂基因为“bar”基因，其他已克隆的抗除草剂基因同样可应用于本发明。
本发明另选一水稻品种作为父本，与所述的母本杂交，其目的是丰富和动摇遗传性，使其发生遗传重组。
本发明中的杂交F0代种子及其化学诱变后栽培所结的发生品质相关基因突变的F1、F1优种子，以及由其培育出的F2代植株，含有抗除草剂基因，本发明在以后的选种、育种中，要排除抗除草剂基因，为此，在培育的F2代植株中，选取其中对除草剂敏感的植株，该植株对除草剂无抗性，不含有抗除草剂基因，其后代也就不含抗除草剂基因，故本发明采用了基因剔除方法就是利用基因重组后遗传分离现象，淘汰掉含抗除草剂基因的突变体的近等基因系植株。选取和保留下来的不含抗除草剂基因的植株已是非转基因植株，安全无害。
本发明所用化学诱变剂是甲基磺酸乙酯(EMS)和1-甲基-3-硝基-亚硝基胍(NEU)，它们具有较强的基因点突变频率，用其处理杂种F0代种子，能促进诱变发生。当然，物理诱变也可应用于本发明。
本发明可以优选京引119稻种作母本，粳稻品种C211作父本。
本发明的优点是可以在较短时间有效地选育出品质优良、米粒特长的粳稻新种质，显著优越于常规杂交育种改良品质技术，使稻米品质改良研究有新突破。
具体实施例方式
下面举例对本发明方法作详细说明。
1、杂交亲本的选配和杂交京引119为北方粳稻品种，品质优、产量高，曾为北方稻区推广品种。将其未成熟的胚(授粉后10～12天)剥离，灭菌条件下接种培养基上，用基因枪转化方法把含“bar”基因的质粒DNA(PCB1)轰击入未成熟幼胚组织中，该幼胚转入有选择压的愈伤诱导培养基上诱导愈伤组织1个月，设计bar基因两引物作探针，PCR扩增。PCR反应阳性者为含bar基因，相反，则不含bar基因。从105块诱导抗性愈伤组织中，获得98块愈伤组织有阳性反应(表1)，表明其中含有bar基因，将其保留下来，淘汰不含bar基因愈伤组织。含有bar基因的98块愈伤组织转入到分化培养基上，经24天光照/黑暗交替培养，最终生长出5株水稻小植株。该植株已含有bar基因，对其喷施除草剂Basta而不被杀死，具备了抗除草剂特性，即为带bar标记的亲本试验材料。
表1抗除草剂基因转入稻种结果
C211，为南方一粳稻品种，有较好的育性恢复性，常被选用作配制杂交稻的恢复系品种，米质较好。
1998年夏选京引119-bar为母本，C211为父本品种，进行有性杂交，获得356粒杂交结实种子(F0代)。
2、杂种F0代种子化学诱导处理研究表明化学诱变剂中烷化剂类的诱变频率较高，对植物诱变效果明显。据此，本发明实施中选用两种烷化剂混合处理，诱发杂合子发生点突变或染色体断裂，当出现明显的植株外形变化和米粒长度和品质改变时，易用肉眼观察检出。356粒杂交的种子剥去外壳，分成两份，分别放入两个玻璃烧杯中，各加入配制的烷化剂溶液10ml，溶液分A、B两种A、0.3％甲基磺酸乙酯(EMS)+1.5％1-甲基-3-硝基-亚硝基胍(NEU)B、1.5％甲基磺酸乙酯(EMS)+1.5％1-甲基-3-硝基-亚硝基胍(NEU)剥去稻壳的干种子浸泡在上述诱变剂中，于25℃浸泡1.30小时，在其间更换一次新配制的同种溶液，浸泡后取出种子水洗一次凉干，播入温室土壤中，其中一些种子不能正常出芽生长而死亡，一部分种子能正常生长(表2)。
表2诱变剂处理稻种出苗结果
3、定向选择品质突变体，筛选出品质优良植株经烷化剂处理后生长的杂种F1代植株，喷施0.25％Basta除草剂，全部成活而未被除草剂杀灭，说明bar基因已整合入水稻染色体基因组。为在烷化剂处理后的群体中发现稻米品质突变个体，待植株成熟时，按株收获稻穗，脱粒，剥去谷壳。直观初检米粒长度、米质透明度和垩白程度，将米粒长度在6.8～7.0mm之间，米质透明无垩白者，挑选出来(见表3)。
表3 诱变剂处理稻种培植结实米粒外观
由表3可知，经烷化剂处理的F0代种子，播种后F1植株中出现了米粒明显变长，米的外观色泽变得透明洁白，米粒的垩白度和垩白率下降，即米粒透明变亮。根据表3数据，单独挑选出A-6，A-7，B-2，B-4，B-5和B-6种子，即为稻米品质突变体。
4、遗传分离保留不含bar基因植株，淘汰抗除草剂植株(含bar基因)F1代收获的A-6，A-7，B-2，B-4，B-5和B-6各突变株种子，第二年夏播种，得到F2代植株，按孟德尔遗传规律，F2代群体中抗除草剂基因按3∶1规律分离，即F2代中有3份表现抗除草剂植株，而1份表现对除草剂敏感。当生长到苗期时，田间用0.25％Basta除草剂涂布植株叶片，一周后叶片发黄表明对除草剂敏感，叶片保持正常绿色者表明对除草剂有抗性。统计抗性植株对敏感植株数的比率，符合3∶1规律(表4)。保留对除草剂敏感植株，淘汰表现抗性植株。
表4 稻种基因遗传分离结果
5、常规选育优良单株获得长粳稻品种F2代经除草剂Basta测定，保留对其敏感植株，即不含bar基因，但米粒变长，米质已经变得透明，垩白率和垩白度都很低的突变单株。凡对除草剂表现抗性的所有植株，虽然米粒也变长，米质也变得透明，但将其淘汰。
待植株正常成熟后，上述A-6，A-7，B-2，B-4，B-5和B-6各株系优选单株，按株收获稻种，按株脱粒，测米粒长度，选留米粒长在6.8mm以上的，米质透明且无腹白优良单株，共计挑选出30个单株，分别来自诱变剂A处理和B处理。
从F2代挑选出的优良株30株，第二处夏季按株系播种获F3植株，重复考查综合农艺性状，尤其检测米粒长度，米质透明和垩白等重要性状指标，从F3不同株系群体中又选育出5株优良株，米粒长6.8～7.0mm之间，米质透明无垩白。
将F3代选育出5株优良株，当年去海南又按株播种，形成5个株系(即为F4代植株)。对5个株系进行综合考查，最终选出2株最优秀者，并将其暂定名为加禾212品种(B212)，种子送交农业部米质检测中心对其稻米品质进行测定。加禾212(B212)品种的检测结果如下(表5)表5 水稻品质改良结果
由表5可知，本发明改良水稻品质所得长粳稻米(加禾212)的米质的主要品质指标已接近和达到国家优质粳米一级标准，米质优秀，米粒长度明显大于其他粳稻品种。
本发明应用转基因技术，理化诱变合子胚，常规育种方法和基因剔除等综合技术，在1998年-2000年间，创造出我国稀有的长粳稻新品种，其米质优秀，农艺丰产性优良。本发明为创造和改良水稻品质提供了有效的技术途径。
权利要求
1.生物工程改良水稻品质的方法，其特征是包括步骤①将抗除草剂基因转入一选定的水稻品种，再选取一水稻品种与其杂交，栽培后收获得杂交种F0代种子；②F0代种子经诱变处理后播种、栽培、收获得到与品质相关基因突变的F1代种子，选取其中品质优良的突变体F1优；③F1优种子播种、栽培得F2代植株，选取其中对所述的除草剂敏感的植株，培育后得到F2代种子，作为稻种。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤③中选取对除草剂敏感的植株后，再从其中选取优良植株，并从该优良植株的结种中选取品质优良的种子F2优，所述的稻种是指F2优。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是F2或F2优种子播种、栽培得F3代植株，从其中选取优良植株，收获得F3代种子。
4.如权利要求3所述的方法，其特征是F3代种子播种、栽培得F4代植株，从其中选取优良植株，收获得F4代种子。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征是步骤①所选的两种水稻品种为粳稻品种C211和京引119；所述的诱变处理是用化学诱变剂EMS+NEU处理。
全文摘要
可以在较短时间内有效选育出品质优良稻种的生物工程改良水稻品质的方法,其特征是包括步骤:①将抗除草剂基因转入一选定的水稻品种,再选取一水稻品种与其杂交,栽培后收获得杂交种F
文档编号A01H1/02GK1363211SQ0113909
公开日2002年8月14日 申请日期2001年12月7日 优先权日2001年12月7日
发明者黄大年, 黄海祥, 钱前, 孙祥良, 华志华 申请人:黄大年, 黄海祥, 钱前