专利名称：一种杀甜菜夜蛾的苏云金芽孢杆菌菌株及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种具有高效杀甜菜夜蛾的苏云金芽孢杆菌菌株。苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis WY-190菌株对甜菜夜蛾幼虫具有极高毒杀作用。还涉及该菌株的制备方法。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis简称BT)杀虫剂在我国的研究与开发已有四十余年历史，实践证明对农作物五十余种常发性害虫有良好的防治效果，在病虫害的防治中发挥了重要作用。但BT杀虫剂主要是防治敏感性鳞翅目害虫，品种单一，严重影响了BT杀虫剂的有效利用。
近几年，甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)是危害蔬菜、棉花、小麦等农作物的主要害虫，每年给我国农业生产造成巨大损失，而且这种害虫对化学杀虫剂的抗药性日益增强，即使采用化学农药防治效果也甚微，目前已商业化的BT杀虫剂对其基本无效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效杀甜菜夜蛾的苏云金芽孢杆菌菌株，采用该菌株是高毒力菌株的3-4倍。
本发明另一个目的在于提供一种制备苏云金芽孢杆菌菌株的方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施将土壤中分离的一株苏云金芽孢杆菌，用发酵培养基进行发酵，培养至伴孢晶体脱落。将此发酵液通过甜菜夜蛾进行生物测定。该样品对甜菜夜蛾具有很强的毒杀作用。同时对该菌株的鞭毛血清型、菌体、伴孢晶体形态特征及生理生化性质进行分析。结果显示，该菌株对甜菜夜蛾具有极高毒杀作用，其命名为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis WY-190。该菌株在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NOM202005。
其步骤是1.将采集的土样少许放入装有4.5ml的营养液试管中，经75-78℃，水浴14-20分钟，振荡培养48-52小时。
2.将培养液稀释至10-7-10-8倍，涂布到分离培养基上，28-30℃恒温箱中倒置培养3天，镜检挑选产生伴孢晶体的单菌落。
3.将单菌落纯化，接种于发酵培养基进行摇瓶发酵，至伴孢晶体脱落。
4.将发酵液与人工饲料混合至2000-3000倍，放入一定量的甜菜夜蛾，置入25-28℃温箱中，进行靶标昆虫的生物测定。
5.菌株的形态学描述。
6.血清学及生理生化特征分析。
苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis WY-190菌株的性质根据上述实施方法，得到一株对甜菜夜蛾具有极高毒力的苏云金芽孢杆菌，命名为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis WY-190。该菌株于2002年1月31日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNOM202005。
1.苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis WY-190菌株的杀虫活性该菌株在发酵培养基中培养至伴孢晶体脱落，发酵液稀释至2000-3000倍，对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)致死率为70-90％。显示极高杀虫毒力，其毒力是目前国内外高毒力菌株的3-4倍。
2.苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis WY-190菌株的形态特征营养体细胞呈杆状，两端钝圆，孢子囊不膨大，芽孢偏端生，另一端形成伴孢晶体。伴孢晶体形态为棱形、正方形、近圆形和椭圆形，并且有镶嵌结构。
3.苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis WY-190菌株的血清学及生理生化特征鞭毛抗原分析属H3ab血清型。V.P反应+；卵磷脂酶++；菌膜+；甘露糖-；纤维二糖+；水杨苷+；蔗糖+；水解淀粉+；明胶水解++；精氨酸脱羧酶+；几丁质酶+。
本发明与现有技术相比，具有以下优点该发明针对农作物主要难治害虫甜菜夜蛾，分离筛选到一株对甜菜夜蛾具有极高杀虫毒力的苏云金芽孢杆菌，其毒力是目前国内外高毒力菌株的3-4倍。利用这一菌株特点，可研制、开发出高效抗甜菜夜蛾的BT杀虫剂新品种，使BT杀虫剂在防治夜蛾科难治害虫方面能有一个大的突破。具有重大创新性和产业化价值。
具体实施例方式
1.菌种分离、培养将少许土样放入装有4.5ml的营养液试管中，经78℃，水浴15分钟，振荡培养48小时。将培养液稀释至10-7-10-8倍，涂布到分离培养基上，30℃恒温箱中倒置培养3天，镜检挑选产生伴孢晶体的单菌落。
营养培养液蛋白胨1％ 牛肉膏0.3％ NaCl0.5％ PH7.5。
分离培养基蛋白胨1％ 牛肉膏0.3％ NaCl0.5％ 琼脂2％ PH7.5。
2.菌种摇瓶发酵将分离纯化菌株用发酵培养基进行摇瓶发酵，500ml的摇瓶装量80ml，摇床转速为230rpm，培养温度30℃，培养时间72小时。取样涂片显微镜观察，伴孢晶体脱落50％，无污染且菌株生长良好的发酵液用于生物测定。
发酵培养基淀粉2％ 豆粕3％ 酵母粉0.3％ CaCO30.1％ PH8.5。
3.生物测定将发酵液与人工饲料混合至2000-3000倍，放入一定量的甜菜夜蛾，置入26℃温箱中，72小时后计算供试昆虫死亡率。
权利要求
1.一种杀甜菜夜蛾的苏云金芽孢杆菌菌株，其特征是苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis WY-190，CCTCC NOM202005。
2.一种实现权利要求1所述的杀甜菜夜蛾的苏云金芽孢杆菌菌株的制备方法，包括下列步骤A、将采集的土样放入营养液试管中，经75-78℃，水浴14-20分钟，振荡培养48-52小时；B、将培养液稀释至10-7-10-8倍，涂布到分离培养基上，28-30℃恒温箱中倒置培养3天，镜检挑选产生伴孢晶体的单菌落；C、将单菌落纯化，接种于发酵培养基进行摇瓶发酵，至伴孢晶体脱落；D、将发酵液与人工饲料混合至2000-3000倍，放入甜菜夜蛾，置入25-28℃温箱中，进行靶标昆虫的生物测定。
3.根据权利要求2所述的一种杀甜菜夜蛾的苏云金芽孢杆菌菌株的制备方法，其特征在于营养培养液为蛋白胨1％、牛肉膏0.3％、NaCl0.5％、PH7.5。
4.根据权利要求2所述的一种杀甜菜夜蛾的苏云金芽孢杆菌菌株的制备方法，其特征在于分离培养基为蛋白胨1％、牛肉膏0.3％、NaCl0.5％、琼脂2％、PH7.5。
5.根据权利要求2所述的一种杀甜菜夜蛾的苏云金芽孢杆菌菌株的制备方法，其特征在于发酵培养基为淀粉2％、豆粕3％、酵母粉0.3％、CaCO30.1％、PH8.5。
全文摘要
本发明公开了一种杀甜菜夜蛾的苏云金芽孢杆菌菌株及制备方法。苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis WY－190,CCTCC NO:M202005。首先是将土样放入营养液试管中,经一定温度、水溶、振荡培养;其次是将培养液稀释、涂布到分离培养基上,恒温箱中倒置培养;再是将单菌落纯化,接种于发酵培养基进行摇瓶发酵,至伴孢晶体脱落;第四是将发酵液与人工饲料混合,进行靶标昆虫的生物测定。该菌株对甜菜夜蛾毒力是目前国内外高毒力菌株的3－4倍。利用其能研制出抗甜菜夜蛾BT杀虫剂新品种,能使BT杀虫剂在防治夜蛾科难治害虫方面取得大的突破。
文档编号A01N63/00GK1368550SQ0211558
公开日2002年9月11日 申请日期2002年3月6日 优先权日2002年3月6日
发明者阎建平, 牛桂兰, 郑大胜, 袁志明, 罗绍彬 申请人:中国科学院武汉病毒研究所