专利名称：一种用生物工程技术获得肉苁蓉次生代谢产物的方法
技术领域：
本发明涉及一种获得肉苁蓉次生代谢产物的方法，特别是涉及一种利用生物工程技术获得肉苁蓉次生代谢产物的方法。
由于肉苁蓉栖息于干燥的荒漠或盐湖周边，生育环境极为恶劣，而且其被寄生植物的资源也十分短缺，因此肉苁蓉野生资源十分匮乏。特别是近些年来的狂采乱挖，现有的野生资源已经遭到严重破坏，肉苁蓉的产量日益下降。长此以往，会加速野生肉苁蓉灭绝的危险。虽然肉苁蓉的人工栽培已经被列为“十五”攻关项目，遗憾的是到目前为止还很难通过人工栽培来满足市场的需求。更何况肉苁蓉也是防沙固沙保持生态系统的重要植物材料之一，通过人工栽培恢复生态环境非常重要，采挖肉苁蓉是破坏固沙生态的一种行为。
为了减少对野生资源的采摘和破坏，为了将肉苁蓉的自然生产方式转变为工业化生产方式，利用现代生物技术生产肉苁蓉的次生代谢产物非常重要。
一种获得肉苁蓉次生代谢产物的方法，基本上包括以下步骤1)配制供下述各步骤使用的培养基在植物组织基本培养基中，加入1-10mg/L生长素或1-10mg/L细胞分裂素、20-60g/L蔗糖或葡萄糖，调pH值5-7，为液体培养基和合成培养基；再加入7-10g/L琼脂为固体培养基；2)将肉苁蓉的组织消毒后接种在固体培养基上，在20-25℃，黑暗条件下培养形成愈伤组织；3)将愈伤组织细胞放在液体培养基中，在20-25℃，避光条件下，在摇瓶机上旋转培养出悬浮单细胞系；4)自悬浮单细胞中筛选出高产单细胞系；5)将高产单细胞系接种在合成培养基中，20-25℃避光条件下培养10-30天；6)收获细胞并分离得到肉苁蓉次生代谢产物。
其中，所述植物组织基本培养基为Murashige & Skoog改良培养基、改良Miller培养基或改良Gamborg培养基。所述生长素优选为吲哚乙酸和α-萘乙酸；所述细胞分裂素优选为苄氨基嘌呤。
在上述过程中，所述接种在固体培养基上的肉苁蓉组织，在20-25℃黑暗条件下培养20-40天形成愈伤组织。所述愈伤组织细胞放在液体培养基中，在20-25℃，避光条件下，在摇瓶机上旋转培养10-20天，培养出悬浮单细胞系。
所述自悬浮单细胞中筛选出高产单细胞系的方法是将悬浮单细胞均匀接种在平板固体培养基上，在20-25℃，避光条件下培养25-30天，形成新的细胞团，筛选高速增殖的细胞团作为高产单细胞系。
为了保证细胞的有用代谢产物产量，所述得到的高产单细胞系在25℃，避光条件下培养20天达到快速生长期时再接种在合成培养基上。
收获的肉苁蓉细胞可以用常规方法将细胞破碎并分离得到肉苁蓉次生代谢产物。
利用本发明的方法来生产肉苁蓉的次生代谢产物，生产成本低，周期短，可以在不进行野外采挖的情况下，得到大量有益的肉苁蓉次生代谢产物，不仅保护了生态环境，还可以满足人们越来越多的对肉苁蓉次生代谢产物的需求量。
实验结果表明，肉苁蓉外植体的取材部位对形成愈伤组织、单细胞系及肉苁蓉次生代谢产物均没有显著影响。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
1、配制供下述各步骤使用的培养基在Murashige & Skoog(MS)改良培养基中，按每升培养液加入2mg/L吲哚乙酸(IAA)和8mg/L苄氨基嘌呤(BA)，再加入40g/L葡萄糖，用酸或碱将其pH值调整到6.5，再加入7g/L琼脂，经过加温溶解后，分装在试管中，经过125℃高温，0.1Mpa压力下消毒，经冷却后为固体培养基；同样的培养基不加凝固剂为液体培养基和合成培养基，合成培养基中的葡萄糖可以起到代谢前体的作用；2、将肉苁蓉的组织用70％的乙醇杀菌40秒钟，再用5％的次氯酸钠消毒10分钟，用无菌水冲洗三次后，接种在固体培养基上，在25℃，黑暗条件下培养40天，形成愈伤组织；3、将获得的愈伤组织细胞放在不加琼脂的液体培养基中，在25℃，避光条件下，在100rpm摇瓶机上旋转培养15天，培养出悬浮单细胞系；4、将培养出的悬浮单细胞均匀接种在平板固体培养基上，在25℃下，避光条件下培养30天，形成新的细胞团，筛选出增殖较快的细胞团，经过反复培养鉴定，筛选出高产细胞系；5、将高产细胞株接种在液体培养基中，在25℃，避光条件下培养20天达到快速生长期；6、将获得的细胞接种在合成培养基上，在25℃，避光条件下培养20天，即可以收获细胞；7、从收获细胞中用常规方法分离到苯乙醇甙类等活性物质。
实施例21、在改良Miller培养基中，按每升培养液加入5mg/L α-萘乙酸(NAA)和2mg/L苄氨基嘌呤(BA)，再加入30g/L蔗糖，用酸或碱将其pH值调整到5.8，做成液体培养基与合成培养基；再加入9g/L琼脂，经过加温溶解后，分装在试管中，经过125℃高温，0.1MPa压力下消毒后经冷却为固体培养基；2、将肉苁蓉的组织用70％的乙醇杀菌1分钟，再用5％的次氯酸钠消毒10分钟，用无菌水冲洗三次后，接种在固体培养基上，在25℃，黑暗条件下培养25天，形成愈伤组织；3、将获得的愈伤组织细胞放在不加琼脂的液体培养基中，在25℃，避光条件下，在100rpm摇瓶机上旋转培养15天，培养出悬浮单细胞系；4、将培养出的悬浮单细胞均匀接种在平板固体培养基上，在25℃下，避光条件下培养20天，形成新的细胞团，筛选出增殖较快的细胞团，经过反复培养鉴定，筛选出高产细胞系；
5、将高产细胞株接种在生长培养基中，在25℃，避光条件下培养20天达到快速生长期；6、将获得的细胞接种在合成培养基上，在25℃，避光条件下培养30天，即可以收获细胞；7、从收获细胞中用常规方法分离到苯乙醇甙类等活性物质。
实施例31、在改良Gamborg(B5)培养基中，按每升培养液加入8mg/L吲哆乙酸和5mg/L苄氨基嘌呤(BA)，再加入55g/L蔗糖，用酸或碱将其pH值调整到5.2，为液体培养基与合成培养基；加入10g/L琼脂，经过加温溶解后，分装在试管中，经过125℃高温，0.1MPa压力下消毒后经冷却为固体培养基；2、将肉苁蓉的组织用70％的乙醇杀菌1分钟，再用5％的次氯酸钠消毒15分钟，用无菌水冲洗三次后，接种在上述基本培养基上，在25℃，黑暗条件下培养35天，形成愈伤组织；3、将获得的愈伤组织细胞放在不加琼脂的液体培养基中，在25℃，避光条件下，在90rpm摇瓶机上旋转培养18天，培养出悬浮单细胞系；4、将培养出的悬浮单细胞均匀接种在平板固体培养基上，在25℃下，避光条件下培养20天，形成新的细胞团，筛选出增殖较快的细胞团，经过反复培养鉴定，筛选出高产细胞系；5、将高产细胞株接种在液体培养基中，在25℃，避光条件下培养20天达到快速生长期；6、将获得的细胞接种在合成培养基上，在25℃，避光条件下培养15天，即可以收获细胞；7、从收获细胞中用常规方法分离到苯乙醇甙类等活性物质。
权利要求
1.一种获得肉苁蓉次生代谢产物的方法，基本上包括以下步骤1)配制供下述各步骤使用的培养基在植物组织基本培养基中，加入1-10mg/L生长素或1-10mg/L细胞分裂素、20-60g/L蔗糖或葡萄糖，调pH值5-7，为液体培养基和合成培养基；再加入7-10g/L琼脂为固体培养基；2)将肉苁蓉的组织消毒后接种在固体培养基上，在20-25℃，黑暗条件下培养形成愈伤组织；3)将愈伤组织细胞放在液体培养基中，在20-25℃，避光条件下，在摇瓶机上旋转培养出悬浮单细胞系；4)自悬浮单细胞中筛选出高产单细胞系；5)将高产单细胞系接种在合成培养基中，20-25℃避光条件下培养10-30天；6)收获细胞并分离得到肉苁蓉次生代谢产物。
2.根据权利要求1所述的获得肉苁蓉次生代谢产物的方法，其特征在于所述植物组织基本培养基为Murashige & Skoog改良培养基、改良Miller培养基或改良Gamborg培养基。
3.根据权利要求1或2所述的获得肉苁蓉次生代谢产物的方法，其特征在于所述生长素优选为吲哚乙酸和α-萘乙酸；所述细胞分裂素优选为苄氨基嘌呤。
4.根据权利要求1所述的获得肉苁蓉次生代谢产物的方法，其特征在于所述接种在固体培养基上的肉苁蓉组织，在20-25℃黑暗条件下培养20-40天形成愈伤组织。
5.根据权利要求1所述的获得肉苁蓉次生代谢产物的方法，其特征在于所述愈伤组织细胞放在液体培养基中，在20-25℃，避光条件下，在摇瓶机上旋转培养10-20天，培养出悬浮单细胞系。
6.根据权利要求1所述的获得肉苁蓉次生代谢产物的方法，其特征在于所述自悬浮单细胞中筛选出高产单细胞系的方法是将悬浮单细胞均匀接种在平板固体培养基上，在20-25℃，避光条件下培养20-30天，形成新的细胞团，筛选高速增殖的细胞团作为高产单细胞系。
7.根据权利要求1所述的获得肉苁蓉次生代谢产物的方法，其特征在于所述得到的高产单细胞系在25℃，避光条件下培养20天达到快速生长期时再接种在合成培养基上。
全文摘要
本发明公开了一种用生物工程技术获得肉苁蓉次生代谢产物的方法，本发明的目的是提供一种在不破坏自然环境条件下，利用生物工程技术获得肉苁蓉次生代谢产物的方法。一种获得肉苁蓉次生代谢产物的方法，基本上包括以下步骤1)配制供下述各步骤使用的培养基2)将肉苁蓉的组织消毒后接种在固体培养基上，在20－25℃，黑暗条件下培养形成愈伤组织；3)将愈伤组织细胞放在液体培养基中，在20－25℃，避光条件下，在摇瓶机上旋转培养出悬浮单细胞系；4)自悬浮单细胞中筛选出高产单细胞系；5)将高产单细胞系接种在合成培养基上，20－25℃避光条件下培养10－30天；6)收获细胞并分离得到肉苁蓉次生代谢产物。
文档编号A01H4/00GK1446458SQ0211624
公开日2003年10月8日 申请日期2002年3月22日 优先权日2002年3月22日
发明者郭志刚 申请人:清华大学