专利名称：一种防止植物组织培养中褐化现象产生的方法
技术领域：
本发明涉及一种植物组织培养方法，特别是涉及一种防止植物组织培养中褐化现象产生的方法。
在植物组织培养快速繁殖中经常会产生褐化现象。这是由于外植体或培养物切口表面渗出的酚类物质氧化后使培养基变成暗褐色所致。褐化现象对不同物种外植体组织或培养物会产生不同程度的毒害，严重的会导致培养物死亡。目前，减轻褐化的措施有(1)对母株和外植体进行预处理，如对外植体进行高温或低温处理，外植体先在液体培养基上预培养几天，然后再在半固体培养基上培养(2)选择适宜的培养基和培养条件，在适宜的培养基和培养条件下外植体生长旺盛，有较强的分生能力，可以减轻褐化，如调整培养基中的无机元素的组成和浓度，改变培养温度、光照和PH值等；(3)在培养基中加入防褐剂，如抗氧化的抗坏血酸，盐酸半胱氨酸和柠檬酸以及具吸附作用的活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；(4)缩短继代时间，连续转移外植体，这样可以减轻褐化的毒害。但现有技术只能相对地减轻某些植物组织培养中的褐化程度，并不能有效地解决褐化问题。绝大多数组织培养易褐化的植物还没有一种有效的抗褐化技术，更没有一种能完全消除褐化现象的方法。而且现有技术中有些措施会对组织培养物产生不良的副作用，如对外植体进行高温预处理会对外植体产生伤害，在培养基加入活性炭会降低培养基中激素的活性。由于现有的抗褐化技术效果差，不能有效地解决褐化问题，到目前为止，有些易褐化且褐化对组织培养物毒害很大的作物的组织培养程序化途径尚未建立，致使这些作物的组织培养与快速繁殖的成功率很低。而组织培养与快速繁殖又是这些植物唯一有效的迅速增殖途径。这就严重影响了这些作物新品种的推广应用速度。兰科观赏植物的快速繁殖有两种途径，一是用种子无菌播种，生产实生苗，二是通过组织培养生产分生苗。由于实生苗存在变异，难以保持优良品种的种性，所以名贵优良品种一般通过组织培养生产分生苗(克隆苗)。但兰花组织培养中普遍存在褐化现象，尤其以卡特兰组织培养最为严重。卡特兰组织培养中的褐化现象对外植体的毒害较大，致使其不能正常生长发育，甚至外植体死亡。对此，现有的抗褐化技术尚不能有效地克服，致使卡特兰新品种不能迅速推广。
本发明提供了一种防止植物组织培养中褐化现象产生的方法，该方法能有效地解决植物组织培养中的褐化问题，达到使易褐化植物组织培养与快速繁殖成功率提高的目的。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是本发明主要是利用组织培养中不褐化植物的培养物的代谢过程抑制易褐化植物的组织培养物的褐化。首先取组织培养中不产生褐化现象的植物，经组织培养形成快速繁殖的中间繁殖体(以下简称中间繁殖体)。红掌是一种天南星科花烛属观赏植物，在整个组织培养过程中无褐化现象产生。其组织培养外植体可以用顶芽、腋芽和幼嫩叶片。但由于顶芽和腋芽难以彻底灭菌，所以通常采用幼嫩叶片作外植体。幼嫩叶片经0.1％氯化汞水溶液灭菌10分钟左右，无菌水洗5～8次后，分切成1cm2左右的小块，接种于愈伤组织诱导培养基(1/2MS+BA4mg/L+2，4-Dlmg/L+3％蔗糖，PH5.8，琼脂0.7％固化)，50天左右诱导出愈伤组织。愈伤组织在分化培养基(MS+BA8mg/L+3％蔗糖，PH5.8，琼脂0.7％固化)上培养30天左右形成再分化的组织，再分化的组织在继代增殖培养基(MS+BA3mg/L+NAA0.2mg/L+3％蔗糖，PH5.8，琼脂0.7％固化)上继代培养2～3次(每代30天)后形成可快速增殖的丛芽块(一种具丛生芽的块状组织，即快速繁殖的中间繁殖体)。其次取组织培养中易产生褐化现象的植物的外植体或培养物(以下简称培养对象)，用下面的方法之一进行培养(1)将培养对象和中间繁殖体共同接种于培养对象的培养基中进行培养；(2)将中间繁殖体在培养对象的培养基中先培养20～40天，然后去掉中间繁殖体，再在该培养基中接种培养对象；(3)用培养过中间繁殖体的液体培养基再配制培养对象的培养基，然后接种培养对象。例如，用不附加植物生长调节剂和琼脂的MS基本培养基培养红掌，10天左右去除红掌，然后在该液体培养基中加入培养对象组织培养与快速繁殖所需的生长调节剂和琼脂固化剂，以及再补充一些营养物配制新培养基，再在这种培养基上接种培养对象。蝴蝶兰是一种兰科观赏植物，其组织培养的外植体有花梗芽、茎芽和幼嫩叶片等，但经常是使用花梗芽。蝴蝶兰组织培养中外植体百分之百地存在严重褐化现象。这严重地影响了花梗芽的生长发育。将蝴蝶兰花梗带芽切段或者已诱导出的花梗芽和红掌丛芽快一起接种于蝴蝶兰花梗芽培养基(MS+BA3mg/L+3％蔗糖，PH5.8，琼脂0.7％固化)，每培养瓶装培养基25ml，接种一个花梗带芽切段或者已诱导出的花梗芽和3～4块直径1cm左右的红掌丛芽块。这样可以基本消除蝴蝶兰花梗芽组织培养时产生的褐化现象，而对照(蝴蝶兰花梗芽单独培养)百分之百产生严重褐化现象。
本发明的有益效果是利用不褐化植物组织培养快速繁殖的中间繁殖体产生的天然抗褐化物质，能有效地解决易褐化植物组织培养中的褐化问题。
实施例(1)取天南星科花烛属观赏植物红掌的组织培养快速繁殖的中间繁殖体(丛芽块)和蝴蝶兰花梗芽共培养于蝴蝶兰花梗芽的培养基(MS+BA3mg/L+3％蔗糖，PH5.8，琼脂0.7％固化)中，每培养瓶装培养基25ml，接种一个花梗芽和3～4块直径1cm左右的红掌丛芽块，能基本消除蝴蝶兰花梗芽组织培养中的褐化现象。先将红掌丛芽块在该培养基上预培养3～5天，再接蝴蝶兰花梗芽，效果更好。
实施例(2)将红掌快速繁殖的中间繁殖体先在继代培养基(MS+BA3mg/L+NAA0.2mg/L+3％蔗糖，PH5.8，琼脂0.7％固化)上继代培养30天左右(每培养瓶装培养基25ml，接种3～4块直径1cm左右的红掌从芽块)，之后去除培养物，然后将卡特兰腋芽外植体接种于该培养基上，能基本消除卡特兰腋芽组织培养中的褐化现象，且腋芽可生根萌发。而对照(卡特兰腋芽外植体接种于新鲜培养基中)全部褐化，生长发育受抑制，甚至死亡。
实施例(3)天南星科花烛属观赏植物观叶花烛在组织培养过程中也不产生褐化现象，将其快速繁殖的中间繁殖体先在培养基(MS+BA3mg/L+NAA0.2mg/L+3％蔗糖，PH5.8，琼脂0.7％固化)上继代培养30天左右，之后去除培养物，然后将美冠兰芽外植体接种于该继代培养基上，能基本消除美冠兰芽组织培养中的褐化现象，培养半个月左右芽开始萌发。而对照(美冠兰芽外植体接种于新鲜培养基中)全部褐化，生长发育受抑制。
权利要求
1.一种防止植物组织培养中褐化现象产生的方法，其特征是1)取组织培养中不产生褐化现象的植物，经组织培养形成快速繁殖的中间繁殖体；2)将易褐化植物的培养物与不褐化植物的中间繁殖体共同接种于易褐化植物的培养基中进行培养；3)将不褐化植物的中间繁殖体在易褐化的培养对象的培养基中先培养20～40天，然后去掉中间繁殖体，再在该培养基中接种培养对象；4)用培养过不易褐化植物中间繁殖体的液体培养基再配制成易褐化的培养对象的培养基，然后接种培养对象。
2.根据权利要求1所述的一种防止植物组织培养中褐化现象产生的方法，其特征是所述的组织培养中不产生褐化现象的植物为天南星科花烛属观赏植物红掌。
全文摘要
一种防止植物组织培养中褐化现象产生的方法。其主要是利用组织培养中不褐化植物的组织培养物的代谢过程抑制易褐化植物培养中褐化现象的产生。将不褐化植物快速繁殖的中间繁殖体(以下简称中繁体)与易褐化植物外植体或培养物(以下简称培养对象)共培养，将培养对象接种于已培养过中繁体20～40天的培养基中和将培养对象接种于用培养过中繁体的液体培养基再配制的培养基中，均能有效地抑制易褐化植物组织培养中褐化现象的产生，甚至消除褐化现象。
文档编号A01H4/00GK1468508SQ0213440
公开日2004年1月21日 申请日期2002年7月19日 优先权日2002年7月19日
发明者吕复兵 申请人:广东省农业科学院花卉研究所