专利名称：一种用于防治水稻纹枯病和稻曲病的微生物复配农药的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物复配农药，特别是一种对水稻纹枯病和稻曲病有拮抗作用的微生物复配农药。
长期以来，水稻生产上水稻纹枯病的防治主要依赖于井冈霉素。井冈霉素使用年限较长，用药量逐年增加，水稻纹枯病的发生频率和严重度表现出上升趋势。现用于防治纹枯病的次数已从20年前的2次/年增加到目前的4-5次/年，使用量也已从以前的1.5公斤/公顷增加到目前的4.5-6.0公斤/公顷，继续用井冈霉素防治水稻纹枯病存在着巨大的风险。水稻稻曲病的防治主要依赖于有机铜、有机锡类的药剂，此类重金属药剂对水稻易产生药害、并在稻米中易富积残留，影响稻米的品质。随着经济的快速发展和人民生活水平的提高，人们对水稻质量和产量的要求越来越高。绿色稻米生产迫切需要在尽量减少由病虫害导致的产量损失的同时，减少化学农药的用量和残留，保持稻米的天然品质，因此，研制开发新的防治药剂，尤其生物农药显得极为重要和紧迫。
据申请人所知，有一种微生物细菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，其菌群中具有对多种真菌病害的病原菌有拮抗作用的菌株。用具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌来防治作物病害，国内外都有研究，国外报导主要对棉花、番茄的枯萎病(Mahaffee，W.Rosales A.M.Effects of seed factors on Spermoshpere and rhizoshpere colonization ofcotton by Bacillus subtilis GB03，Phtopathology83，1120-1125)，国内研究者发表了枯草芽孢杆菌抗菌物质及对其抗菌蛋白分离的研究报告(孔建等，1992“枯草芽孢杆菌B-903菌株抗菌物质研究”《微生物学报》32(6))，但上述研究多在实验室内进行，未大面积用于田间防治作物病害。
目前，未见有高效枯草芽孢杆菌的微生物制剂，也未见有大面积应用于农田防治水稻病害的微生物菌制剂和微生物菌制剂与化学农药的复配剂。
申请人通过筛选大量土壤拮抗微生物，发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B-916对水稻纹枯病菌和稻曲病菌的生长具有强烈的抑制作用。
拮抗菌枯草芽孢杆菌B-916的生物学性状菌落形态单细胞形成菌落圆形，四周光滑，YPGA(酵母膏5.0g，胰蛋白胨5.0g；葡萄糖5.0g，琼脂17.0g；水1000ml)培养基平板上生长24h的菌落3-5mm，米色，表面有皱褶。鉴别性状格兰氏反应阴性，严格好气，2％NaCl不能生长，乳果糖、L-阿拉伯糖、L-乳酸、松三糖和D-苹果酸利用反应均为阴性，甘油、蔗糖、麦芽糖和纤维二糖利用反应均为阳性。
本发明技术解决方案的要点是将枯草芽孢杆菌B-916进行发酵培养，再将具有一定菌含量的发酵液和井冈霉素复配，获得一种能用于防治水稻纹枯病和稻曲病的微生物复配农药。
本发明微生物复配农药的工业生产方法包括如下步骤(1)、按照常规方法，在实验室进行枯草芽孢杆菌菌株活化，(2)、按照常规方法，在实验室进行菌株培养，(3)、按接种量1∶150-1∶300，将培养好的菌株移入种子罐进行发酵培养，定时检测菌体芽孢含量和菌含量，发酵时间为18-48小时(4)、按接种量1∶150-1∶300，将种子罐中的发酵液移入大型发酵罐进行发酵，定时检测菌体芽孢含量和菌含量，发酵时间为20-40小时，(5)、发酵液出大型发酵罐，将出罐后的发酵液与井冈霉素复配，搅拌均匀，即得微生物复配农药产品。
本发明微生物复配农药的有益效果如下1、依据微生态学原理，通过引进微生物菌剂，操纵管理水稻根叶围生态环境中微生物群落的合理分布，恶化病原菌的生存环境，结合栽培管理、农业和化学防治措施，形成一个稳定的、平衡的、生物多样化的水稻生态系统，从而有效地、较持久地控制水稻病害的流行。
2、微生物农药具有化学药剂所不具备的优点，其控病作用机制主要为①优势种群的竞争作用——枯草芽孢杆菌B-916具有在水稻植株上定殖能力强、繁殖快的特点，能与病原菌有效竞争侵染位点，减少纹枯病发病机率(参见表1)。②拮抗素抗生作用——枯草芽孢杆菌B-916能分泌产生拮抗素，其能有效地抑制纹枯菌的生长、侵染和蔓延(参见表2)。③拮抗菌的诱导抗性作用——枯草芽孢杆菌B-916在叶面喷施后，可以诱导水稻植株内大量产生与抗病性有关的酶类，从而增强了水稻植株抵御病原菌侵入、蔓延的能力。
3、复配剂的增效作用，枯草芽孢杆菌B-916和井冈霉素复配后，形成优势互补的作用，既能发挥抗生素高效、快速的抑菌作用，又能发挥B-916在田间定殖、大量繁殖后微生物群落合理分布的调整功能，从而达到可持续控制病害的目的。
4、可以将枯草芽孢杆菌发酵液与井冈霉素以任意比例进行复配，只要选取恰当的复配比例，就可以使本发明农药的应用达到既能发挥最佳药效作用、又能减少抗生素井冈霉素使用量和使用次数、尽可能保持稻米天然品质的目的。
5、经测试表明，本发明复配农药产品中的井冈霉素对枯草芽孢杆菌B-916的菌落数形成无干扰作用，产品具有药效稳定、保持时间长(可达两年)的特性。经实验表明，本发明产品对环境安全，对人、畜无致病性，对农作物病虫害天敌安全。
实施实例2，本发明微生物复配农药产品(纹曲宁)的工业生产方法首先按照常规方法，在实验室将枯草芽孢杆菌菌株B-916活化，然后在实验室按照常规方法进行菌株培养，将活化后的菌株移入500mlYPG(胰蛋白胨5g、酵母膏5g、葡萄糖5g，水1000ml)培养液中，在120转/min、28℃下培养48小时后，按接种量1∶150PH值7.0-7.4，)进行发酵培养，发酵时间为18-48小时，其间每隔2小时对种子罐进行一次检测，当其中菌含量大于等于1010cfu/ml时，按接种量1∶150-1∶300，将种子罐中的发酵液转入大型发酵罐发酵(温度28-32℃，酸碱度PH值7.0-7.4，泡沫较多时可适量加入消泡剂)，在大型发酵罐中发酵时间为20-40小时，其间每隔2小时进行一次检测，观察菌含量、测定发酵液的酸碱度，当大型发酵罐中菌体的芽孢含量大于等于90％后，检测其中的菌含量，当菌含量大于等于2×1010cfu/ml时将发酵液出罐，将发酵液与5％井冈霉素按照体积1∶1的比例进行复配，搅拌均匀，最后，在复配农药中加入占总体积2‰的苯甲酸防腐剂，搅拌均匀，进行分装。
井冈霉素和枯草芽孢杆菌B-916的含量指标是产品的基本质量指标。井冈霉素含量采用液相色谱法进行测定(A≥2.0％)，枯草芽孢杆菌的菌数采用平板稀释计数法进行测定(≥1010cfu/ml)。经测试表明，复配农药产品中的井冈霉素对枯草芽孢杆菌B-916的菌落数形成无干扰作用。
本发明微生物复配农药的使用方法如下1、防治水稻纹枯病，在水稻纹枯病发病初期，每亩使用本品纹曲宁200-250ml，兑水65-80Kg粗喷雾；隔15-20天可进第二次防治；2、防治水稻稻曲病，在水稻破口前一周左右进行防治，每亩使用本品纹曲宁250-300ml，兑水65-80Kg粗喷雾防治。
本发明微生物复配农药应用于防治水稻纹枯病，如表3所示，表明有良好的防治效果，当本发明农药纹曲宁用量为200-300ml/亩时，15天的防治效果达65.2-77.5％，持效期比井冈霉素有所增加。其中单用枯草芽孢杆菌B-916发酵液对水稻纹枯病也有一定的防效。表3为在安徽、江苏和江西三省用本发明农药防治水稻纹枯病的药效试验结果。
本发明微生物复配农药应用于防治水稻稻曲病，如表4所示，表明有良好的防治效果，当本发明农药纹曲宁用量为300ml/亩时，防治效果达75.9-79.1％。其中单用枯草芽孢杆菌B-916发酵液对稻曲病也有一定的防治效果。表4为在安徽、江苏和江西三省用本发明农药防治水稻稻曲病的药效试验结果。表1、拮抗菌B-916发酵液对水稻纹枯病菌和稻曲病菌生长的抑制作用对照菌落原液1∶100 1∶500病原菌直径(mm)菌落直径抑制率菌落直径抑制率菌落直径抑制率(mm)(％) (mm)(％) (mm)(％)水稻纹枯病菌90 11.895.4 17.188.9 17.888.1水稻稻曲病菌90 90 100 90 100 90 100表2、拮抗菌B-916分泌物对水稻纹枯病菌和稻曲病菌生长的抑制作用原液 1∶100 1∶500对照菌落病原菌直径(mm) 菌落直径 抑制率 菌落直径抑制率 菌落直径 抑制率(mm) (％)(mm)(％)(mm) (％)水稻纹枯病菌9070.7 23.572.221.773.7 19.9水稻稻曲病菌9090100 90 100 90100表3、本发明微生物复配农药防治水稻纹枯病试验结果
表4、本发明微生物复配农药防治水稻稻曲病试验结果
权利要求
1.一种用于防治水稻纹枯病和稻曲病的微生物复配农药，其特征是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B-916发酵液和井冈霉素复配而成。
2.根据权利要求1所述的一种用于防治水稻纹枯病和稻曲病的微生物复配农药，其特征是由芽孢含量大于等于菌体的90％，并且菌含量大于等于2×1010cfu/ml的枯草芽孢杆菌发酵液与5％井冈霉素按照体积1∶1的比例复配而成。
3.根据权利要求2所述的一种用于防治水稻纹枯病和稻曲病的微生物复配农药，其特征是所述的微生物复配农药中具有占总体积2‰的苯甲酸防腐剂。
4.一种用于防治水稻纹枯病和稻曲病的微生物复配农药的工业生产方法，其特征是包括如下步骤(1)、按照常规方法，在实验室进行枯草芽孢杆菌菌株活化，(2)、按照常规方法，在实验室进行菌株培养，(3)、按接种量1∶150-1∶300，将培养好的菌株移入种子罐进行发酵培养，定时检测菌体芽孢含量和菌含量，发酵时间为18-48小时(4)、按接种量1∶150-1∶300，将种子罐中的发酵液移入大型发酵罐进行发酵，定时检测菌体芽孢含量和菌含量，发酵时间为20-40小时，(5)、发酵液出大型发酵罐，将出罐后的发酵液与井冈霉素复配，搅拌均匀，即得微生物复配农药产品。
5.根据权利要求4所述的一种用于防治水稻纹枯病和稻曲病的微生物复配农药的工业生产方法，其特征是种子罐和大型发酵罐的生产工艺控制条件为温度28℃-32℃，酸碱度pH值7.0-7.4。
6.根据权利要求4所述的一种用于防治水稻纹枯病和稻曲病的微生物复配农药的工业生产方法，其特征是每隔2小时对种子罐进行一次检测，当其中菌体的芽孢含量大于等于10％时，将种子罐中的发酵液转入大型发酵罐。
7.根据权利要求4所述的一种用于防治水稻纹枯病和稻曲病的微生物复配农药的工业生产方法，其特征是每隔2小时对大型发酵罐进行一次检测，当其中菌体的芽孢含量大于等于90％并且菌含量大于等于2×1010cfu/ml时将发酵液出罐。
8.根据权利要求7所述的一种用于防治水稻纹枯病和稻曲病的微生物复配农药的工业生产方法，其特征是将芽孢含量大于等于菌体的90％并且菌含量大于等于2×1010cfu/ml的枯草芽孢杆菌发酵液与5％井冈霉素按照体积1∶1的比例进行复配，搅拌均匀，即得微生物复配农药产品。
9.根据权利要求8所述的一种用于防治水稻纹枯病和稻曲病的微生物复配农药的工业生产方法，其特征是在所述的微生物复配农药中加入占总体积2‰的苯甲酸防腐剂。
全文摘要
一种用于防治水稻纹枯病和稻曲病的微生物复配农药，通过对一种枯草芽孢杆菌进行发酵培养，再将具有一定菌含量的发酵液和井冈霉素进行复配成为微生物复配农药，枯草芽孢杆菌与井冈霉素形成优势互补的作用，用于大田防治水稻纹枯病和稻曲病，既能发挥抗生素高效、快速的抑菌作用，又能发挥枯草芽孢杆菌在田间定殖、大量繁殖后微生物群落合理分布的调整功能，从而具有增效作用，达到既能发挥最佳药效作用、又能减少抗生素井冈霉素使用量和使用次数、尽可能保持稻米天然品质的目的，产品具有药效稳定、保持时间长(可达两年)的性质。
文档编号A01N63/02GK1468524SQ02138379
公开日2004年1月21日 申请日期2002年9月30日 优先权日2002年9月30日
发明者陈志谊, 刘永锋 申请人:江苏省农业科学院