专利名称：运用龙血树组织培养生产血竭的方法
技术领域：
本发明涉及一种运用生物技术生产血竭的方法，尤其涉及一种利用龙血树组织培养生产血竭的方法。
背景技术：
血竭是一种名贵而常用的传统中药，具有止血、活血、消炎、定痛和生肌的功效，现代药理学研究表明血竭具有改善机体微循环，调整机体新陈代谢，提高机体免疫功能等作用，因而在临床上得到广泛的应用。血竭主要来源于两类植物一是棕榈科黄藤属藤本植物麒麟竭(DaemonoropsdracoBl.)及同属他种植物果实中溶出或分泌的红色树脂(进口血竭)，另一种是百合科植物剑叶龙血树属植物含脂木质部中提取而得的树脂(国产血竭)。过去我国使用的血竭主要依靠进口，自上世纪70年代，我国著名植物学家蔡希陶教授和他的助手们在云南省南部发现龙血树资源，从而结束了我国不能生产血竭的历史，但现在市售的血竭仍主要依赖进口。
龙血树属植物，全世界有150种左右，分布于亚洲和非洲的热带与亚热带地区。我国原产有5种，主要分布在海南、云南西双版纳、广西、广东等地。龙血树生长缓慢，在植物界中它的生命期最长，可达八千年，因此被植物学家们誉之为“植物寿星”。龙血树不仅具有重要的观赏价值，既可做室内观赏盆景，又是公共场所的点缀观赏植物，它还是提炼名贵中药——“血竭”的重要原材料。如龙血树属中的剑叶龙血树、海南龙血树、岩棕等还是提炼名贵中药“血竭”的原材料，其经济价值极高。已有的研究表明国产血竭是龙血树树干受伤后(如机械损伤、昆虫蛀洞等)由于禾谷镰刀菌(红色)等真菌的浸入，龙血树植物本身产生一种防卫反应，而形成的防卫素即称为血竭。
通常，血竭的生产是从3年生以上的龙血树上取其树杆或者枝条，再用其提炼血竭。该法不仅需要大量的材料，而且提取过程的成本也很高，且因不断的砍伐还会导致资源的枯竭。由于野生的龙血树不断被挖掘利用，甚至被过渡采伐，使其自然资源遭到严重破坏，其资源面临枯竭的威胁，现已被列为国家三级保护的濒危植物种。
发明内容
本发明的目的是提供一种运用龙血树组织培养生产血竭的方法。
本发明所提出的龙血树组织培养生产血竭的方法是通过龙血树的组织培养进行快速繁殖，在繁殖的过程中加入外源诱导物质使之在幼苗的切割部位产生血竭并分泌到培养基中，幼苗可反复用于增殖和进行诱导培养，而培养基则用于提取血竭，其工艺过程包括愈伤组织的诱导过程、丛生芽的诱导过程、继代增殖及血竭的产生过程和血竭的提取过程。
所述愈伤组织的诱导过程是以龙血树幼枝的顶芽做为外植体，顶芽经消毒后取其生长点接种于愈伤组织诱导培养基上进行避光培养，以诱导愈伤组织的产生。所说的愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加有2，4-D、蔗糖、卡拉胶。
所述丛生芽的诱导过程是将上述获得的愈伤组织切成小方块，并接种于芽诱导培养基上进行培养，以诱导芽的分化。所说的丛生芽诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，然后按比例添加有6BA、NAA、蔗糖、卡拉胶。
所述继代增殖培养及血竭的产生过程是把在丛生芽诱导培养阶段所生成的芽切割后接种于增殖培养基上，于光照条件下培养，以诱导形成丛生芽；接着将形成的丛生芽分割成芽丛再接种于已加入植物生长素的培养基上进行继代增殖。切割后的芽在加入植物生长素的培养基上培养即可在切割部位产生血竭并分泌到培养基中，此时培养基开始变成淡红色，随着培养时间的延长，产生的血竭也不断地增加并分泌到培养基中，而且血竭的有效成分的种类和数量也随之增加使整个培养基呈现出深红色。此时丛生芽可继续用于下一周期的继代增殖，而呈深红色的培养基可直接用于提取血竭。所说的增殖培养基是以MS培养基为基础培养基，然后按比例添加有6BA、KT、蔗糖、卡拉胶。
所述血竭的提取过程是先将培养基烘干，然后用甲醇提取，SephadexLH-20、MCIgel和硅胶柱色谱分离其化学成分，即可得到血竭。
本发明所提供的运用龙血树组织培养生产血竭的方法工艺简单，利用该技术生产血竭不仅无需进行龙血树的规模化种植，还具有生产周期短、速度快、成本低、不受外界条件影响等优点，所体现的经济效益、社会效益和生态效益均非常显著。
具体实施例方式
下面结合实例对本发明进行详细说明。
本发明所涉及的利用龙血树组织培养生产血竭的方法，包括愈伤组织的诱导过程、丛生芽的诱导过程、继代增殖及血竭的产生过程以及血竭的提取过程。
1、愈伤组织的诱导过程取生长健壮的龙血树的幼枝顶芽，剥除其叶片，再用水冲洗干净，然后在无菌条件下先用70-80％的乙醇溶液进行表面消毒，再把小芽投入0.05-0.2％氯化汞水溶液中进行消毒处理，期间不断地进行摇动，使小芽始终浸泡在氯化汞水溶液中，8-15分钟后取出小芽用无菌水冲洗2-3次，再用无菌滤纸吸干水分；然后剥取其生长点并接种到预备好的愈伤组织诱导培养基上，先进行避光培养，再转入自然光下培养，以诱导愈伤组织的产生。所述愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加2，4-D0.5-2.2mg.L-1，蔗糖20-40g.L-1、卡拉胶6-8g.L-1。
2、丛生芽的诱导过程将上述获得的愈伤组织切成小方块，接种于芽诱导培养基上进行培养，以诱导芽的分化。所述丛生芽诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，然后按比例添加有6BA 1.0-5.0mg.L-1、NAA0.1-0.3mg.L-1、蔗糖20-40g.L-1、卡拉胶6-8g.L-1。
3、继代增殖培养及血竭的产生过程把在诱导培养阶段所形成的芽切割后接种于增殖培养基上，并在光照条件下培养，以诱导形成丛生芽，接着将形成的丛生芽再分割成小芽块接种于已加入植物生长素的培养基上进行继代增殖并在1000-2000Lx的光照条件下培养，10天后便可在芽的切割部位产生血竭并分泌到培养基中，此时培养基开始变成淡红色，随着培养时间的增加，产生的血竭也不断地增加并分泌到培养基中，同时血竭的有效成分的种类和数量也随之增加，培养40天后，产生和分泌的血竭达到高峰并使整个培养基呈现出深红色。此时丛生芽可继续用于下一周期的继代增殖，而呈深红色的培养基可直接用于提取血竭。所述增殖培养基是以MS培养基为基础培养基，然后按比例添加有6BA 1.8-6.0mg.L-1、KT 0.3-0.6mg.L-1、蔗糖20-40g.L-1、卡拉胶6-8g.L-1。
4、血竭的提取过程是将含有血竭的培养基烘干，然后用分析纯甲醇溶解已烘干的培养物，之后再经过滤并弃其残渣，所得滤液再用石油醚萃取，静置后分层。待甲醇层回收溶剂至小体积后再加入蒸馏水，使甲醇浓度达到28-35％，接着再进行过滤得到滤液和滤渣。将滤液于Diaion树脂上层析，再用蒸馏水洗脱除去寡糖，然后又用甲醇洗脱，回收甲醇洗脱液后用SephadexLH-20层析，再以45-55％甲醇为洗脱剂进行洗脱，得到若干个流分。所得流分用MCIgel柱或SephadexLH-20层析纯化，得若干化合物。将滤渣先以石油醚-丙酮的混合溶液为洗脱剂用200～300目硅胶柱层析，获得若干流分段，再经SephadexLH-20柱层析，再用MCIgel柱分别纯化，获得若干化合物。以上所得化合物即为血竭的有效成分。所说的石油醚-丙酮混合溶液中石油醚与丙酮的比例为5∶3。
权利要求
1.一种利用龙血树组织培养生产血竭的方法，包括愈伤组织的诱导过程、丛生芽的诱导过程、继代增殖培养及血竭的产生过程和血竭的提取过程，其特征在于(1)所说的愈伤组织的诱导过程是取生长健壮的龙血树的幼枝顶芽，剥除其叶片，再用水冲洗干净，然后在无菌条件下先用70-80％的乙醇溶液进行表面消毒，再把小芽投入0.05-0.2％氯化汞水溶液中进行消毒处理，期间不断地进行摇动，使小芽始终浸泡在氯化汞水溶液中，8-15分钟后取出小芽用无菌水冲洗2-3次，再用无菌滤纸吸干水分；然后剥取其生长点并接种到预备好的愈伤组织诱导培养基上，先进行避光培养，再转入自然光下培养，以诱导愈伤组织的产生；所述愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加2，4-D 0.5-2.2mg.L-1，蔗糖20-40g.L-1、卡拉胶6-8g.L-1；(2)所说的丛生芽的诱导过程将上述获得的愈伤组织切成小方块，接种于芽诱导培养基上进行培养，以诱导芽的分化；所述丛生芽诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，然后按比例添加有6BA1.0-5.0mg.L-1、NAA0.1-0.3mg.L-1、蔗糖20-40g.L-1、卡拉胶6-8g.L-1；(3)所说的继代增殖培养及血竭的产生过程是把在诱导培养阶段所形成的芽切割后接种于增殖培养基上，并在光照条件下培养，以诱导形成丛生芽，接着将形成的丛生芽再分割成小芽块接种于已加入植物生长素的培养基上进行继代增殖并在1000-2000Lx的光照条件下培养，便可在芽的切割部位产生血竭并分泌到培养基中而使培养基开始变成淡红色，随着培养时间的增加，产生的血竭也不断地增加并分泌到培养基中，同时血竭的有效成分的种类和数量也随之增加使整个培养基呈现出深红色，此时丛生芽可继续用于下一周期的继代增殖，而呈深红色的培养基可直接用于提取血竭；所述增殖培养基是以MS培养基为基础培养基，然后按比例添加有6BA1.8-6.0mg.L-1、KT0.3-0.6mg.L-1、蔗糖20-40g.L-1、卡拉胶6-8g.L-1；(4)所说的血竭的提取过程是将含有血竭的培养基烘干，然后用分析纯甲醇溶解已烘干的培养物，之后再经过滤并弃其残渣，所得滤液再用石油醚萃取，静置后分层；待甲醇层回收溶剂至小体积后再加入蒸馏水，使甲醇浓度达到28-35％，接着再进行过滤得到滤液和滤渣；将滤液于Diaion树脂上层析，再用蒸馏水洗脱除去寡糖，然后又用甲醇洗脱，回收甲醇洗脱液后用SephadexLH-20层析，再以45-55％甲醇为洗脱剂进行洗脱，得到若干个流分；所得流分用MCIgel柱或SephadexLH-20层析纯化，得若干化合物；将滤渣先以石油醚-丙酮的混合溶液为洗脱剂用200～300目硅胶柱层析，获得若干流分段，再经SephadexLH-20柱层析，再用MCIgel柱分别纯化，获得若干化合物；以上所得化合物即为血竭的有效成分；所述石油醚-丙酮混合溶液中石油醚与丙酮的体积比为5∶3。
全文摘要
本发明公开了一种运用龙血树组织培养生产血竭的方法，它是以龙血树的幼枝顶端生长点作为外植体，在诱导愈伤组织的培养基上培养诱导产生愈伤组织，愈伤组织再诱导分化形成丛生芽，丛生芽经过继代增殖并在增殖培养基中加入诱导血竭产生的植物生长素，以产生血竭并分泌到培养基中，培养基则直接用于分离和提取血竭。本发明所提供的龙血树组织培养生产血竭的技术，很好地解决了因龙血树资源匮乏而不能生产大量血竭的问题，为利用生物工程技术生产血竭提供了技术保证，该技术将对龙血树资源的保护、开发和利用提供有效的新途径，具有重要的经济、社会和生态效益。
文档编号A01H4/00GK1698422SQ200410010549
公开日2005年11月23日 申请日期2004年12月27日 优先权日2004年12月27日
发明者杨本鹏, 张树珍, 昝丽梅, 张学, 顾丽红 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所