专利名称：一种非无菌条件下的植物组织培养方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域中的植物组织培养技术，具体地说是在非无菌自然环境条件下的植物组织培养方法。
背景技术：
植物组织培养是本世纪初开始，以植物生理学为基础发展起来的一项技术。它是应用无菌操作方法，培养植物的一个离体器官、组织或细胞。经过各国科学家80多年的辛勤探索，几乎所有植物都成功实现了其器官、组织和细胞的离体培养。大多数还能从细胞的一部分，甚至没有细胞壁的裸露的原生质体中，再生出无数的小植株。
植物组织培养技术已成为农业高新技术中最重要、最活跃的领域之一，它不仅是农业继续发展的基础，而且是生物技术中应用最广、最具现实意义的领域，被世人誉为农业发展史上的第四次绿色革命，对解决经济和社会发展所面临的人口增长、农业资源贫乏、环境污染等重大问题，具有十分重要的战略意义。
当前，世界各国政府，都十分重视组培技术研究。在欧美、日本等发达国家把植物组织培养技术用于商品种苗生产，大规模的植物工厂化生产技术已日趋成熟。无论是发达的美国、日本，还是第三世界的印度，都巨额投资。世界已有1000多个‘组培公司’。如美国政府，1989年投资60亿美元的研究开发经费，1992年投入科研经费达42亿美元。美国孟山都公司投资1.65亿美元兴建了生命科学研究中心，英国也投巨资建立了植物研究中心。日本政府建立了“管、产、学”三位一体联合开发体制。仅1990年政府拨款100亿日元，企业资助200亿日元。1996年，日本生物技术研究预算达2050亿日元。欧洲从1985年实施“生物技术行动计划”“新框架计划”等，投资总额为330亿美元。印度政府“八五”计划中，投入45亿卢比。我国政府也制定了“863”高技术发展计划，投资强度较高。“八五”期间每年2亿人民币。“九五”投资强度更大，为我国发展高科技创造了条件。植物组织培养已在快速繁殖、去除病毒、加速育种进程、次生代谢物生产和种质资源的保存等各方面取得巨大的经济效益、社会效益和生态效益。
由于富含营养的培养基既适合植物组织生长发育，更适合杂菌的滋生。在传统的组织培养中，严格的无菌环境、无菌操作、无菌培养成为必备条件，也使该技术成为投资大、成本高、难以普及的主要原因。虽然几十年来，无数科学家在减少污染、降低成本，简化工艺方面做了艰苦努力，均未获得显著突破。因此，现有的植物组织培养技术基本掌握在科研人员手中，大量的科研成果难以走出实验室。在发达国家也仅有100多个以高档名贵花卉、蔬菜为主的植物品种实现了组培产业化。我国仅有香蕉、马铃薯、草莓、兰花等少数实现了组培产业化。
制约植物组织培养技术普及的主要问题是1、高投资为了创造无菌操作和无菌环境，价格昂贵的高压灭菌锅、超净工作台、无菌培养室及培养器皿等成为必备。一个年产10万株组培苗设施投入就高达十几万元。所以，形成了现有组培单位的组培设施基本靠国家投入的局面，而众多种苗生产单位无应用组培技术的财力。
2、高风险在现有的组培中，尽管有完备的无菌操作环境和设施，尽管有技术熟练的科研人员或操作人员的操作，组培苗被污染的情况仍时常发生，控制较好的，污染率在10％左右，稍有不慎，污染率可达20-30％，有的高达50％以上。因全军覆没而导致珍贵植物材料损失的情况也时有发生。因此组培苗被污染成为科研和生产人员最为担心的问题。
3、炼苗期长、成活率低常规技术组培苗要成为生产用苗必须经过室内炼苗、温室炼苗阶段。由于在密闭无菌环境长成的组培苗普遍弱小，导致了在炼苗阶段的缓苗期长、死亡率高，通常因炼苗而死亡的组培苗草本植物为20-30％，木本植物为30-40％。
由于上述原因，导致组培苗生产成本过高，也限制了该技术的普及应用。减少和控制污染成为解决问题的关键为了解决污染问题，几十年来，各国科学家做了不懈的努力，也曾做过在培养基中添加各种抗生素、杀菌剂的试验，例如，Philips，R.等，Piant Sci.Lett，21235-240(1981)；Pullock，K.等Plant Cell Reports，236-39(1983)；Gilbert，J.E.等，Ann.Appl.Biol，119113-120(1991)；Macek，T.等，Biotechnology Techniques，8(12)885-888(1994)；Franck，D.A.，Aquatic Botany，26113-117(1986)；Haldeman，J.H.等，Hortscience，22(2)306-307(1987)；Kneifel，W.和Leonhardt，W，Plant Cell，Tissue andOrgan Culturer，29139-144(1992)。利用杀菌剂解决组培污染的专利有日本的4-311326，9-235208，7-255305，7-255306，3-297331，10-313717；国内的有专利申请号为00128614.5，87104410A，98121867.9等。这些试验和专利虽然在一定程度上可以减少和防止污染的发生，但均未形成在非无菌条件下，不改变常规培养基配方的全过程的植物组织培养。
日本日清纺绩株式会社的00128614.5专利通过添加抗菌剂、去除琼脂和糖分有利于实施非无菌培养，但定量施加二氧化碳补充碳源和用蛭石、纤维替代琼脂的方式又增加了新的技术难点和投资，与目前国内外通用的人们已普遍掌握的组培技术差距太大，难于推广应用。
昆明环境科学研究所在国家科委的支持下，引进了日本的这项技术，并形成了“一种无糖箱式植物组织的培养方法”的专利申请(申请号为98121867.9)，该专利申请由于必须有有机玻璃箱、二氧化碳净化供应系统的高投入，特别是依然没有脱离无菌环境和操作，只能用于科研，无法为生产应用。
发明内容
为了解决在植物组织培养中，因微生物污染而导致的高投入、高风险、炼苗期长、成活率低、成本过高等问题，为了使这项生物技术能够在中国普及、特别是能为广大农民所用，本发明人提出了一种可以在接近于作物自然生长的自然条件、即在无需进行任何严格消毒灭菌处理的非无菌自然环境条件下，进行植物组织培养的方法。
本发明所述植物组织培养方法的全过程是在非无菌自然环境条件下实施的；该方法特点包括在培养基中添加消毒杀菌剂，制备抑菌培养基；在非无菌自然环境条件下接种；将培养材料置于无需进行特别无菌处理的，任何能满足培养材料生长发育的温度、光照条件的房间或设施内在自然环境条件下进行培养。
本发明提供了在常规植物组织培养基中添加消毒杀菌剂制备抑菌培养基的技术，添加消毒杀菌剂制得的抑菌培养基可以有效地防止细菌、真菌的生长，因此可以省略掉占总投资比例较大的消毒灭菌设置、工具、材料以及繁琐的环境和各操作环节的严格消毒灭菌手续，从而形成了一种简单、易行、投资少而且可以在非无菌自然环境和条件下的植物组织培养方法，该方法不但能使植物组织正常生长，而且长势明显优于不使用抑菌培养基的常规培养。
本发明所述的用于制作抑菌培养基的常规培养基的配方是指在常规植物组织培养中常用的固体或液体培养基的配方，它含有一定无机盐、植物激素、维生素、糖类、琼脂等。其具体配方可参照现有有关常规组织培养的手册和书刊。
本发明所述的植物组织培养方法中所说的制作抑菌培养基过程中添加的消毒杀菌剂，可以是苯甲酸类或山梨酸类或醛类或酚类或含氯化合物类或季胺盐类或脲类或胍类或恶唑烷类或聚阳离子类或含银制剂类或两性表面活性剂类或天然消毒杀菌剂。
消毒杀菌剂在常规培养基中的添加用量范围一般为0.001～10g/L(指每立升培养基中添加杀菌剂的克数。以下同。)个别的如苯甲酸钠、山梨酸钾等上限可扩大至25g/L。
依据添加不同量的杀菌剂的抑菌培养基的抗污染能力和对种子发芽率、组培苗分化、生根等影响的综合评价分析，本发明人确认消毒杀菌剂的优选的用量范围为0.01～5g/L。
本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是氯胺B，它的分子式是C6H5CINO2SNa·2H2O，其添加量为0.001～4g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是氯胺T，它的分子式是C7H7CINO2SNa3·3H2O，其添加量为0.005～5g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是二氯异氰尿酸钠，它的分子式是C3O3N3Cl2Na，其添加量为0.01～3g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是三氯异氰尿酸，它的分子式是C3O3N3CL3，其添加量为0.001～1g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是二氯二甲基乙内酰脲，它的分子式是C5H6Cl2N2O2，其添加量为0.001～1g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是甲酚，它的分子式是C7H9O，其添加量为0.05～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是氯代酚，它的分子式是C6H5ClO，其添加量为0.05～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是洁而灭，它的分子式是C21H38NCl，其添加量为0.02～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是新洁而灭，它的分子式是C21H38NBr，其添加量为0.02～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是度米芬，它的分子式是C22H40BrNO，其添加量为0.02～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是消毒净，它的分子式是C20H36NBr，其添加量为0.02～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是氯化二甲基二癸基铵，它的分子式是C22H48NCl，其添加量为0.002～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是溴化二甲基二癸基铵，它的分子式是C22H48NBr，其添加量为0.002～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是十二烷基二氨基乙基甘氨酸，它的分子式是C12H25NHC2H4NHC2H4NHCH2COOH，其添加量为0.01～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是洗必泰，它的分子式是C22H30N10Cl2·2HCl，其添加量为0.005～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是聚六亚甲基双胍盐酸盐，它是高聚物，其添加量为0.01～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是磺胺嘧啶银，它的分子式是C10H9O2N4SAg，其添加量为0.5～10g/L；或本发明添加的可以是对氨基苯磺酸银，它的分子式是C6H7O3N2Ag，其添加量为0.1～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是苯甲酸，它的分子式是C7H6O2，其添加量为0.5～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是苯甲酸钠，它的分子式是C7H5NaO2，0.2～25g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是山梨酸，它的分子式是C6H8O2，其添加量为0.1～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是山梨酸钾，它的分子式是C6H7O2K，其添加量为0.1～25g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是尼泊金甲酯，它的分子式是C8H8O3，其添加量为0.01～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是尼泊金乙酯，它的分子式是C9H10O3，其添加量为0.01～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是尼泊金丙酯，它的分子式是C10H12O3，其添加量为0.01～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是尼泊金丁酯，它的分子式是C11H14O3，其添加量为0.01～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是咪唑烷基脲，它的分子式是C11H16N8O8，其添加量为0.05～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是双咪唑烷基脲，它的分子式是C8H14N4O7，其添加量为0.05～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是布罗波尔，它的分子式是C3H6O4NBr，其添加量为0.01～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是道维希尔-200，它的分子式是C6H12N4(CH2CHCHCl)Cl，其添加量为0.005～5g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是三氯生又名玉洁新DP300，它的分子式是C12H7C13O2，其添加量为0.01～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是甘宝素(又名活性甘宝素、二唑酮)，它的分子式是C15H17O2Cl，其添加量为0.001～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是三氯卡巴又名三氯碳酸苯胺，它的分子式是C13H9Cl3N2O，0.001～2g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是DMDM乙内酰脲，它的分子式是C7H12N2O4，其添加量为0.05～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是Germall-Plus又名乔曼-Plus，它是C8H14N4O7与C8H12INO2的混合物，其添加量为0.02～5g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是对氯间二甲苯酚，它的分子式是C8H9ClO，添加量为0.05～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是富马酸二甲酯，它的分子式是C6H8O4，添加量为0.05～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是琼脂低聚糖，其添加量为0.01～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是蜂胶黄酮防腐抗氧化剂，它是白杨素，良姜素，高良姜素，金合欢素，洋芹素，山萘素，鼠李素的混合物，其添加量为0.01～10/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是鱼精蛋白，它是碱性蛋白质，常与核酸结合，其添加量为0.01～10g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是肉桂醛，它的分子式是C9H8O，其添加量为0.01～5g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是乳酸链球菌素，它是34个氨基酸组成的多肽，0.01～2g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是二甲基恶唑烷或7-乙基二环恶唑烷，其添加量为0.01～5g/L；或本发明添加在培养基中的消毒杀菌剂可以是聚苯乙烯基聚阳离子或聚环氧丙烷基聚阳离子化合物，其结构如式I和式II 其中 或 R1＝-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-CH2CH2CH2CH3，-CH2C6H5，-CH2CH＝CH2，-CH2CH＝CHX，-CH2CH2OH，-CH2CH(OH)CH3；R2＝-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-CH2CH2CH2CH3，-CH2C6H5，-CH2CH＝CH2，-CH2CH＝CHX，-CH2CH2OH，-CH2CH(OH)CH3；R3＝-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-CH2CH2CH2CH3，-CH2C6H5，-CH2CH＝CH2，-CH2CH＝CHX，-CH2CH2OH，-CH2CH(OH)CH3或者R1＝-CH3，-CH2CH3R2，R3＝-COCH＝CHS-，-COCH＝CClS-；X＝Cl或Br；n＝2～500单元。当n值小于50个单元时，相应材料有较好的水溶性。
该类化合物在培养基中的添加量为0.01～8g/L。
该类化合物分子和分子量大，不易内吸，对植物组织的生长无抑制作用，同时具有相当高的抑菌效果。
在上述式II中，当 R1＝-CH3，R2，R3＝-CH2CH＝CHCl或者R1＝-CH3，R1＝-CH3，R2，R3＝-COCH＝CHS-或者R1＝-CH3，R2，R3＝-COCH＝CClS-时，分别为化合物1，化合物2，化合3。
该三个化合物可以单独使用，也可以复合使用，其在培养基中的总添加量为0.01～8g/L；当复合使用时，其用量比例为化合物1∶化合物2∶化合物3＝0～0.5∶1∶1～3。
依据添加不同量的该杀菌剂的抑菌培养基的抗污染能力和对种子发芽率、组培苗分化、生根等影响的综合评价分析，本发明人确认，该类杀菌剂总添加量的优选范围为0.1～5g/L。
化合物1、化合物2、化合物3的具体化学名称和化学结如下 化合物1含氯化-甲基二(3’氯烯丙基)铵盐基团的聚环氧丙烷 化合物2含氯化N-甲基-N，N-硫烯丙酰基铵盐基团的聚环氧丙烷 化合物3含氯化N-甲基-N，N-硫氯烯丙酰基铵盐基团的聚环氧丙烷上述三个化合物结构式中n＝30～70。
化合物1、化合物2、化合物3的制备方法如下
1)制备聚环氧氯丙烷以少许酸作引发剂，将环氧氯丙烷慢慢滴入反应器中，在50℃下进行开环阳离子聚核反应，待加料毕，继续保温反应4h即可。
2)制备聚阳离子化合物将聚环氧氯丙烷与甲基二(3’-氯烯丙基)胺在50℃下反应10h，再将料液处理至中性，然后以水做介质进行超微过滤(滤膜分子截取值为200)，除去小分子，再浓缩产品浓度至30％左右即可得化合物1。
将聚环氧氯丙烷与N-甲基-N，N-硫烯丙酰基胺在70℃下反应16h，再将料液处理至中性，然后以水做介质进行超微过滤(滤膜分子截取值为200)，除去小分子，再浓缩产品浓度至30％左右即可得化合物2。
将聚环氧氯丙烷与N-甲基-N，N-硫氯烯丙酰基胺在70℃下反应20h，再将料液处理至中性，然后以水做介质进行超微过滤(滤膜分子截取值为200)，除去小分子，再浓缩产品浓度至30％左右即可得化合物3。
本发明所述的抑菌培养基包括固体抑菌培养基和液体抑菌培养基。
本发明所述的固体抑菌培养基的制作工艺是按培养植物需要的常规培养基配方，配制加有无机盐、糖、激素和琼脂的混合液，将其加热至琼脂完全溶化，然后添加所选用的一定量的杀菌剂，搅拌均匀后，分装至培养容器中。
本发明所述的液体抑菌培养基的制作工艺是按培养植物需要的常规培养基配方，配制加有无机盐、糖、激素的水溶液，然后添加所选用的一定量的杀菌剂，搅拌均匀后，分装至培养容器中。
使用本发明所提供的方法制备的抑菌培养基，可以有效的防止和减少植物组织培养过程中微生物的污染，并保证种子正常发芽和植物组织、器官、细胞以及培养苗的正常发育生长。
本发明所提供的抑菌培养基可用于植物的叶、茎、根、芽、花、胚、分生组织、愈伤组织等的接种和培养。
本发明所说的接种是在非无菌自然环境条件下将上述植物组织接种在抑菌培养基中，除无需进行严格无菌处理程序外，具体接种操作手续与常规组培的接种手续相同。
接种后，可将装有接种培养材料的培养容器，置于无需进行无菌处理的任何能满足培养材料生长发育的温度、光照等条件的房间或设施内在自然环境条件下进行培养，具体温度、光照等条件与培养材料与常规组培时所需的条件相同。
由于使用了抑菌培养基，因而本发明所述的植物组织培养方法中的接种及培养操作过程中无需再进行严格的无菌处理，改变了常规植物组织培养全过程中必须进行严格无菌处理的传统观念，可以省略投资较高的超净工作台、紫外灯等设备及严格无菌的环境设施，并省略了繁琐的消毒手续。
本发明所提供的植物组织培养方法是一种全新的低投入、低成本、高效率、高效益的在非无菌的自然环境条件下的植物组织培养方法，也可以称为是一种开放式的植物组织培养方式。
传统的植物组织培养方式均是在严格控制无菌的封闭条件下进行的，将自然环境生长的植物置于人为创造的光照、温度和密闭无菌的环境，极易产生特殊的玻璃化、褐化、黄化等难以解决的问题，必然出现生长缓慢、瘦弱、炼苗期长、死亡率高等不良后果。另外，无菌操作是所有常规植物组培的一项严格要求，如要对培养基、培养容器高压、高温灭菌，任何用于操作和处理植物组织的器具都要消毒，其操作过程都必须在无菌环境如超净工作台内进行。即使熟练的技术员最严格地使用无菌技术，细菌、真菌污染几乎无法避免，甚至出现灾难性的损失。因此，寻找一种使组培植物在适宜的自然环境生长，免除繁杂的无菌培养过程、大幅度降低生产成本，使组培技术走出实验室并为农民所掌握的方法将是极为重要的。
本发明与“传统无菌组培”相比，具有以下特点简化环节，节省投资“非无菌组培”无需高压灭菌、无菌接种和无菌培养，省去昂贵的高压灭菌锅和超净工作台，将操作困难、易损的玻璃器皿更换为价格低廉、操作简便的塑料杯、塑料盒或塑料袋，一次性投资节省80％以上，降低了应用组织培养技术的门槛。
幼苗质量好，生产成本低本发明“非无菌组培”是在有杂菌存在的自然环境中接种、自然阳光光照培养环境中进行培养，组培苗生长势强，常见的玻璃化、褐变等影响正常生长问题大为缓解；组培苗向商品苗过度期的炼苗、缓苗时间短，成活率高达95％以上。
本发明“非无菌组培”的生产费用比常规“无菌组培”节省78％。“无菌组培”的单苗成本为0.2106元，“非无菌组培”的单苗成本仅为0.0671元(详见附表)。
植物组织培养将向产业化分工协作转化传统的组培方式，无论科研或生产单位，都要完成从培养基配方研究到制作生产，从外植体处理、增殖扩繁到炼苗出苗的全过程。这种“小而全”的方式已经阻碍了植物组培的进步与发展。
“非无菌组培”方式可将‘抑菌培养基’从“小而全”的传统方式中逐渐分离成专业化、系列化、商品化生产，也促使组培苗生产和商品苗生产相互独立，最终使组培技术能按产业化模式运行。
广泛应用于资源保护、利用只有依靠种子、整株植物、适宜季节才能完成的濒危植物抢救、野生资源收集、种质资源保存、优良品种国内外交换、杂交亲本的繁殖等繁杂工作，将被本发明非无菌组培技术取代。此前，一个濒危植物、珍贵野生物种、国外优良品种、甚至杂交种子亲本必须在适宜的季节，由其所产种子获得；而今，在任何季节都可以依靠非无菌组培技术以任何方式采集和交换植物的组织、茎尖等繁殖材料。
以下以列表对比的方式说明本发明所述的植物组织培养方法与在严格无菌条件下的常规组织培养技术的不同点及其优异效果表一常规组培与本发明非无菌组培操作技术要点和步骤对照
表二本发明非无菌组培与常规组培经济效益对比表(以生产100万组培苗为例)
表三常规组培与本发明非无菌组培的产业化生产工艺流程及机械设备配置对比。
表四常规组培与本发明非无菌组培接种工序对比。
本发明所述的非无菌组织培养的市场前景1.目前，进口的优质特种蔬菜、瓜果成为市场抢手货，而这些品种种子价格昂贵，如樱桃番茄、彩色辣椒等部分杂交品种的价格超过了黄金，卖到农民手中价格高达每克100多元人民币，一粒种子能卖到一元多。应用本发明“开放式组培”，只需少量种子或从田间采摘部分茎尖，就可以克隆出几十万、几百万、上千万市场急需的、质优价廉的种苗。而这一技术乡镇、村甚至一家一户都能掌握。面对庞大的蔬菜、瓜果市场，无论是大量克隆种苗，还是转让“非无菌组培”技术都有巨大的潜力。
2.我国花卉产业每年以35-40％速度递增，1999年栽培面积已达12.2万公顷(居世界第一)，产值达540亿元人民币。由于产品质量差，出口交易额为2.8亿美元，仅占世界交易额的0.4％(而同期荷兰花卉出口交易额达337.2亿美元，占世界贸易的45％)，每公顷产值仅为荷兰的1.7％、以色列的5.9％、哥伦比亚的7.7％。在花卉质量构成中，种苗因素占到50％以上，而荷兰花卉种苗基本靠组织培养生产。因此，“非无菌组培”可迅速提高我国花卉种苗质量，缩小与发达国家的差距，增强产品的国际市场竞争力。
3.中国是一个低森林覆盖率的国家，每年都投入巨资植树造林。2002年，全国造林绿化突破1亿亩，对林业的投资达到347亿元，比2001年增加167亿元。今年全国计划营造林任务1.6亿亩，需各种苗木226亿株。从全国苗木拥有量看，已供过于求，但地区性、结构性矛盾仍很突出，许多适宜的优良树种在短期内依靠扦插、嫁接无法满足数量需要；依靠常规的“无菌组培”又无法满足价格低廉的要求。因此，本发明“非无菌组培”有可能成为植树造林、退耕还林、还草等国家级绿化工程、生态环境治理的重点应用技术。
4.进入21世纪，“让森林走进城市、让城市融入森林”已成为提升城市形象和竞争力、推动区域经济持续健康发展的新理念，城区绿岛、城边绿带、城郊森林将成为各城市竟相发展的基本模式。国务院有关部门已经做出规划到2050年，全国70％以上的城市林木覆盖率要达到45％以上，实现“城在林中、路在绿中、房在园中、人在景中”，建成以森林为主体，分布合理、植物多样、景观优美的城市森林生态网络体系。“绿色奥运”的生态理念将使北京成为人均绿地面积最高的城市；上海每年将投入40亿元用于绿化和造林，到2020年全市森林面积将达到1900平方公里；到2005年，深圳城市绿化覆盖率将达到48％以上，人均公共绿地面积达到16平方米；安徽省有十个县完成了森林生态网络规划；江苏省启动了“绿色江苏行动”，大幅度增加森林植被。在全国各地，以“城市森林”计划为投资主体的建设高潮已经形成。
5、次生代谢物提取药用植物有效成分的产量、质量、受其遗传性、生长条件、收获时间及贮藏和运输等因素影响很大，采用组织培养，生产有效成分，就可克服这些缺点，这对生长条件要求严格、生长缓慢、产量低、价值贵重的植物药更有意义。目前药用植物的组培主要有两个方面一是快繁大量种苗以满足人工栽培需要；二是通过愈伤组织或悬浮细胞的大量培养，直接提取药物，或通过生物转化、酶促反应生产药物。我国有5000多种野生药用植物，但传统的获取方式是以采集和消耗大量野生资源为代价，当采集量超过自然再生时，必然导致物种的濒危甚至灭绝，加之自然环境恶化，许多药用植物已呈匮乏之势。《中国植物红皮书》收载了388种国产珍稀濒危野生植物，其中有药用价值的约100余种。目前，我国从药用植物培养中产生的有效成分已有200多种，如人参组培提取人参皂甙已进入产业化；因紫杉醇奇特药效而濒临灭绝的红豆杉正在依靠组培获得保护。
具体实施例方式
现以列表的方式介绍本发明的
具体实施方式
和效果。
一抑菌培养基制作植物组培所使用的培养基种类很多，如MS、VW、WH、N6、WS等，其中MS培养基应用最为广泛，以下为MS培养基的配制过程1、配制工作母液。将大量元素和微量元素配制成所需浓度的100倍工作母液。如表五表五
2、配制培养基。在干净的容器中加入表五中1-6号MS培养基母液各10毫升，然后加入所需的植物生长调节剂、糖、琼脂，最后加入洁净水至1L。
3、调整PH值。用1mo1/L盐酸或氢氧化钠调整pH值，大多数植物适宜pH值为5.3-6.0的培养基。
4、加热溶化琼脂。将调整好pH值的培养基加热至琼脂溶化。加热时需不断搅拌，以防琼脂、糖沉淀而烧焦或溢出。
5、加入消毒杀菌剂。琼脂充分溶化后，停止加热，并添加所选定的一定量的杀菌剂。可选用的杀菌剂及其用量的具体实施例见表六表六抑菌培养基中添加的消毒杀菌剂品种及用量的实施例
6、培养基分装。将已配制好的培养基在没有冷却之前分装到培养容器中，分装时可以手工进行，也可以机械分装。对培养时间长，培养材料较高的，培养基厚度应厚一些；如果培养时间短，培养材料稍矮的，培养基厚度可以薄一些；培养容器可以选用任何透明、无毒的材料制作，只要能保证光照和对组织培养无副作用，任何廉价材料都可选用。
7、将分装好培养基的容器盖上盖子或用保鲜膜封口，以保持水份。培养基冷凉后即可接种植物。
二、抑菌培养基的抑菌效果实验和对培养组织分化、根系生长的影响表七抑菌培养基的抗污染实验实验条件采用空白MS培养基，每升添加白砂糖30g，琼脂4g。培养基分别添加不同抑菌药品后，调PH至5.8，分装于培养皿中，在室内敞口放置15分钟，自然感菌，然后加盖培养皿盖，进行培养。设置对照为相同培养基，不添加抑菌药品，调PH至5.8，直接分装灭菌。然后室内自然敞口15分钟然后封闭。每个组合做15个处理。观察结果如下
表八马铃薯组培苗在抑菌培养基中的分化、生长实验试验条件采用空白MS培养基，每升添加白砂糖30g，琼脂4g，B90.05mg/L。培养基分别添加不同抑菌药品后，调PH至5.8，分装于培养瓶中，用保鲜膜封口。以马铃薯组培苗茎段在室内自然条件下接种，封盖，进行培养。培养光周期为16/8。设置对照为相同培养基，不添加抑菌药品，调PH至5.8，直接分装灭菌。然后在超净工作台上进行马铃薯组培苗茎段接种操作。每个组合做8个处理。观察结果如下
表九抑菌培养基对樱桃组培苗根系生长影响培养条件采用生根培养基MS+6BA0.3+ZT0.09+NAA0.2，每升添加白砂糖30g，琼脂4g。培养基分别添加不同抑菌药品后，调PH至5.8，分装于培养瓶中，用保鲜膜封口。以樱桃组培苗茎段在室内自然条件下接种，封盖，进行培养。光周期16/8。设置对照为相同培养基，不添加抑菌药品，调PH至5.8，直接分装灭菌。然后在超净工作台上进行樱桃组培苗茎段接种操作。观察结果如下
<p>本发明胶体电解质蓄电池经测试，其质量指标达到或超过国家规定标准，有关数据见下表
而且经实践(试用)表明，本发明具有如下明显优于现有蓄电池1、本产品的电解质为胶状体，在生产和使用过程中无酸雾气体析出，无电解液溢出，无毒，无污染，避免了传统铅酸蓄电池在使用过程中由于颠簸震动等原因使液体电解液大量外溢，易对机体表面腐蚀，污染环境，对人体、衣物烧坏的情况时有发生。在使用过程中两极柱不产生任何杂质和污垢，所以不会因接触不良对生产造成影响，大大提高了胶体蓄电池的有效使用率。即使胶体蓄电池壳体意外破裂，短时间内仍能安全运行。电解质为胶状体，可对极板周围形成固定保护层，保护极板避免因震动或碰撞而产生损坏或破裂，防止极板弯曲现象以造成内部短路而导致的容量下降，具有很好的物理性和化学性，因而质量得到保障，加之胶体蓄电池电解质使其容量增加，所以使用寿命大大延长。将本发明的胶状体电解质蓄电池和铅酸蓄电池在相同的条件下作寿命循环的对比试验(按国标GB5008-<1-91>)，其结果超过国标的1.5-3倍。即一个胶体电解蓄电池的使用寿命相当于1.5至3个铅酸蓄电池的使用寿命。
2、胶体电解质蓄电池的充电接受能力强，上下电位差小，电容量大，深放电能力强，性能好，自放电极小，是普通铅酸蓄电池的1‰，有利于长期储存和作为电视台、银行、通信领域、微机中心等备用电源。
3、长期使用无需加酸液，无需调比重，因产品表面清洁无污垢，所以无需经常维护。节约大量能源及保养、维护使用。
权利要求
1.一种非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于植物组织培养的全过程是在非无菌自然环境条件下实施的；它包括在培养基中添加消毒杀菌剂，制备抑菌培养基；在非无菌自然环境条件下接种；将培养材料置于满足植物组织培养的温度、光照条件的房间或设施内在自然环境条件下进行培养。
2.如权利要求1所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于制备抑菌培养基过程中添加的消毒杀菌剂可以是苯甲酸类或山梨酸类或酚类或含氯化合物类或季胺盐类或脲类或胍类或恶唑烷类或聚阳离子类或含银制剂类或两性表面活性剂类或天然消毒杀菌剂。
3.如权利要求1所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于在培养基中添加的消毒杀菌剂的用量范围为0.001～10g/L，(指每立升培养基中添加杀菌剂的克数，以下同)。
4.如权利要求1所的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于培养基中添加的消毒杀菌剂的优选的用量范围为0.01～5g/L。
5.如权利要求1或2所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于制备抑菌培养基过程中添加的消毒杀菌剂品种及用量为氯胺B，它的分子式是C6H5CINO2SNa·2H2O，其添加量为0.001～4g/L；或氯胺T，它的分子式是C7H7CINO2SNa3·3H2O，其添加量为0.001～5g/L；或二氯异氰尿酸钠，它的分子式是C3O3N3Cl2Na，其添加量为0.01～3g/L；或三氯异氰尿酸，它的分子式是C3O3N3CL3，其添加量为0.01～1g/L；或二氯二甲基乙内酰脲，它的分子式是C5H6Cl2N2O2，其添加量为0.001～1g/L；或甲酚，它的分子式是C7H9O，其添加量为0.05～10g/L；或氯代酚，它的分子式是C6H5ClO，其添加量为0.05～10g/L；或洁而灭，它的分子式是C21H38NCl，其添加量为0.02～10g/L；或新洁而灭，它的分子式是C21H38NBr，其添加量为0.02～10g/L；或度米芬，它的分子式是C22H40BrNO，其添加量为0.02～10g/L；或清毒净，它的分子式是C20H36NBr，其其添加量为0.02～10g/L；或氯化二甲基二癸基铵，它的分子式是C22H48NCl，其添加量为0.002～10g/L；或C20H36NBr2H30N10Cl2O2C22C22溴化二甲基二癸基铵，它的分子式是C22H48NBr，其添加量为0.002～10g/L；或十二烷基二氨基乙基甘氨酸，它的分子式是C12H25NHC2H4NHC2H4NH·CH2COOH，其添加量为0.01～10g/L；或洗必泰，它的分子式是C22H30N10Cl2·2HCl，其添加量为0.005～10g/L；或聚六亚甲基双胍盐酸盐，它是高聚物，其添加量为0.01～10g/L；或磺胺嘧啶银，它的分子式是C10H9O2N4SAg，其添加量为0.5～10g/L；或对氨基苯磺酸银，它的分子式是C6H7O3N2Ag，其添加量为0.1～10g/L；或苯甲酸，它的分子式是C7H6O2，其添加量为0.5～10g/L；或苯甲酸钠，它的分子式是C7H5NaO2，其添加量为0.2～25g/L；或山梨酸，它的分子式是C6H8O2，其添加量为0.1～10g/L；或山梨酸钾，它的分子式是C6H7O2K，其添加量为0.1～25g/L；或尼泊金甲酯，它的分子式是C8H8O3，其添加量为0.01～10g/L；或尼泊金乙酯，它的分子式是C9H10O3，其添加量为0.01～10g/L；或尼泊金丙酯，它的分子式是C10H12O3，其添加量为0.01～10g/L；或尼泊金丁酯，它的分子式是C11H14O3其添加量为0.01～10g/L；或咪唑烷基脲，它的分子式是C8H14N4O7，其添加量为0.05～10g/L；或双咪唑烷基脲，它的分子式是C11H16N8O8，其添加量为0.05～10g/L；或布罗波尔，它的分子式是CH3H6O4NBr，其添加量为0.01～10g/L；或道维希尔-200，它的分子式是C6H12N4(CH2CHCHCl)Cl，其添加量为0.05～5g/L；或三氯生又名玉洁新DP300，它的分子式是C12H7C13O2，其添加量为0.01～10g/L；或甘宝素(又名活性甘宝素、二唑酮)，它的分子式是C15H17O2Cl，其添加量为0.001～10g/L；或三氯卡巴又名三氯碳酸苯胺，它的分子式是C13H9Cl3N2O，其添加量为0.001～2g/L；或DMDM乙内酰脲，它的分子式是C7H12N2O4，其添加量为0.05～10g/L；或Germall-Plus又名乔曼-Plus，它是C8H14N4O7与C8H12INO2的混合物，其添加量为0.02～5g/L；或对氯间二甲苯酚，它的分子式是C8H9ClO，其添加量为0.05～10g/L；或富马酸二甲酯，它的分子式是C6H8O4，其添加量为0.05～10g/L；或琼脂低聚糖，其添加量为0.01～10g/L；或胶黄酮防腐抗氧化剂，它是白杨素，良姜素，高良姜素，金合欢素，洋芹素，山奈素，鼠李素的混合物，其添加量为0.01～10g/L；或鱼精蛋白，它是碱性蛋白质，常与核酸结合，其添加量为0.01～10g/L；或肉桂醛，它的分子式是C9H8O，其添加量为0.01～5g/L；或乳酸链球菌素，它是34个氨基酸组成的多肽，其添加量为0.01～2g/L；或二甲基恶唑烷或7一乙基二环恶唑烷，其添加量为用量为0.01～5g/L。
6.如权利要求1所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于制作抑菌培养基过程中添加的消毒杀菌剂为聚苯乙烯基聚阳离子或聚环氧丙烷基聚阳离子化合物，其结构式如下 此类结构中， 或 R1＝-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH2CH2CH2CH3、-CH2C6H5、-CH2CH＝CH2、-CH2CH＝CHX、-CH2CH2OH或-CH2CH(OH)CH3；R2＝-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH2CH2CH2CH3、-CH2C6H6、-CH2CH＝CH2、-CH2CH＝CHX、-CH2CH2OH或-CH2CH(OH)CH3；R3＝-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH2CH2CH2CH3、-CH2C6H5、-CH2CH＝CH2、-CH2CH＝CHX、-CH2CH2OH或-CH2CH(OH)CH3或者R1＝-CH3、-CH2CH3；R2，R3＝-COCH＝CHS-、-COCH＝CClS-；X＝Cl或Br；n＝2～500单元。当n值小于50个单元时，相应材料有较好的水溶性；该聚阳离子类杀菌剂在培养基中的添加量为0.01～8g/L。
7.如权利要求1所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于制作抑菌培养基过程中添加的消毒杀菌剂为 化合物1；含氯化-甲基二(3’-氯烯丙基)铵盐基团的聚环氧丙烷 化合物2含氯化N-甲基-N，N-硫烯丙酰基铵盐基团的聚环氧丙烷 化合物3含氯化N-甲基-N，N-硫氯烯丙酰基铵盐基团的聚环氧丙烷上述三个化合物结构式中n＝30～70；该三个化合物可单独使用或复合使用，当复合使用时，其用量比例为化合物1∶化合物2∶化合物3∶＝0～0.5∶1∶1～3；其添加量为0.01～8g/L
8.如权利要求1所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于制备固体抑菌培养基的工艺为按照培养样品所需要的常规培养基配方，配制加有无机盐、糖、激素和琼脂的混合液，将其加热至琼脂完全熔化，然后添加所选用的一定量的杀菌剂，搅拌均匀后，分装至培养容器中；制备液体抑菌培养基的工艺为按照培养样品所需要的常规培养基配方，配制加无机盐、糖、激素的水溶液，然后添加所选用的一定量的杀菌剂，搅拌均匀后，分装至培养容器中。
9.如权利要求1或7所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于所说的培养容器是用透明无毒材料制备的。
10.如权利要求1所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于所说的接种是在非无菌自然环境条件下将植物组织接种在抑菌培养基中。
11.如权利要求1所述的非无菌条件下的植物组织培养方法，其特征在于将接种后的培养容器置于满足培养材料生长发育的温度、光照条件的房间或设施内在自然环境条件下进行培养。
全文摘要
本发明属于生物技术领域中的植物组织培养技术，具体地说是在非无菌自然环境条件下的植物组织培养方法。其特征在于植物组织培养的全过程是在非无菌自然环境条件下实施的；它包括在培养基中添加消毒杀菌剂，制备抑菌培养基；在非无菌自然环境条件下接种；将培养材料置于满足植物组织培养的温度、光照条件的房间或设施内在自然环境条件下进行培养。本发明可以省略掉占总投资比例较大的消毒灭菌设置、工具、材料以及繁琐的环境和各操作环节的严格消毒灭菌手续，从而形成了一种简单、易行、投资少而且可以在非无菌自然环境和条件下的植物组织培养方法，该方法不但能使植物组织正常生长，而且长势明显优于不使用抑菌培养基的常规培养。
文档编号A01H4/00GK1628507SQ20041002403
公开日2005年6月22日 申请日期2004年4月21日 优先权日2004年4月21日
发明者单文修 申请人:单文修