专利名称：无公害高效能寡聚糖高产酶复合动物微生态制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种无公害高效能寡聚糖高产酶复合动物微生态制剂及其制备方法。
背景技术：
饲用微生物添加剂是九十年代开始发展起来的新型饲料添加剂，由于它在防病、提高饲料转化率、促进动物生长和生产性能等方面具有抗生素所不具备的优点，日益受到重视。益生素作为替代抗生素的第一代产品，尽管在克服抗生素的副作用和促进动物生长以及生产性能等方面发挥了较好的作用，但单一的益生素仍存在诸多不足之处。一是动物消化道中原生菌的优生作用使活菌剂很难在短时间内定植、完成续生或大量繁殖，从而使益生菌在动物肠道中附着、定植的数量有限。二是动物肠道中原生菌优势和肠道中的营养素限制，使益生素的应用效果受到影响。因为活菌制剂均有其特定的微生态环境，如果无法在肠道中长久供应外源活菌制剂的营养素，它也将死亡而失效。三是产酶能力不高，使益生素的作用效果受到限制。四是活菌制剂必须耐受饲料制粒过程中的高温以及胃肠道中消化酶、酸碱环境。然而实验表明在65℃以上时，益生菌将被大量杀灭，同时酸、碱、氧等不良环境也将造成益生菌的失活。以上不足之处，直接影响着益生素作用的发挥，使其作用效果不够充分和稳定，作用仍受到许多限制。
发明内容
本发明解决的技术问题设计一种无公害高效能寡聚糖高产酶复合动物微生态制剂及其制备方法，在益生素的基础上，通过对益生素组方的调整、重组以及寡聚糖、高产霉菌的合理添加与组合配伍，以达到益生菌、益生元、高产酶技术的集成和三效合一的效果。使各菌种协同作用，使双歧因子等有益菌的作用充分体现，高产酶的作用有效发挥，优化了养殖生态环境，是一种无污染、无公害的高效绿色环保型饲料添加剂。
本发明的技术解决方案科学研究表明，寡聚糖是一种重要的双歧杆菌等有益菌促生长因子(BF)，它能被有益菌发酵，有效地促进肠道内双歧杆菌的生长、繁殖，具有提高免疫力，降低肠道内PH值，抑制肠道内有害菌生长，产生B族维生素，促进动物肠道蠕动及蛋白吸收等多种功能。且低热、稳定、安全无毒。寡聚糖作为有益菌的基质，与益生素合成应用，使二者功能得到相辅相成的发挥，一是二者都能从不同角度提高肠道内有益菌的定植。即寡聚糖可提供双歧杆菌增殖的营养环境，而益生素中细菌的繁殖则提供了双歧杆菌的厌氧环境，从而形成功能互补作用。二是二者均可竞争性排斥大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌在着位点上的定值，而益生素还可分泌细菌类物质，直接抑制有害菌的定植，从而产生了功能相辅叠加的强化效应。经对比试验，在众多双歧杆菌增殖低聚糖中，低聚异麦芽糖具有口感好、热稳定性强、不易变化，能很好地被双歧杆菌利用，且生产原料众多，生产工艺较为成熟，成为本发明配伍的理想选择。
针对益生素产酶能力不强，酶活性不高的缺点，选用高产酶生物工程菌株，即对筛选出的菌株进行耐高温、耐热性、耐药性、热灭活、包被等特殊的技术处理，保证菌株特定的性能要求。一是可消除消化障碍，参与动物体内的各种反应，提高反应速度，有效促进营养物的吸收利用；二是补充内源酶的不足，达到比动物本身消化更好的效果。它与产品中的低聚糖、益生素有益菌协同作用，最大限度地分解、消化饲料。
本发明不是单纯追求营养的平衡和提升生产性能的设计。而是一方面注重对环境的保护，把提高饲料转化率，减少养分损失，控制药物残留，改善和控制动物排泄物的臭味及氮、磷、氨对环境的污染，力求性能与环保统一。
本发明由下述重量百分比的原料组成蜡状芽孢杆菌10～15枯草芽孢杆菌10～15地衣芽孢杆菌10～15酿酒酵母1～5热带假丝酵母1～5光合细菌1～5植物乳杆菌 0.5～3嗜酸乳杆菌 0.5～3青春双歧杆菌1～3所述的寡聚糖是低聚异麦芽糖。所述的载体是麦饭石。
本发明的制备方法①将所述的芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌、曲霉菌菌种进行耐高温驯化、耐药驯化后保藏，并对保藏的菌种传代；
②对保藏的菌种进行活化、发酵后微胶囊包被，并对包被后的菌种干燥；③将干燥后的菌种粉碎并与寡聚糖、载体按比例混合均匀。
所述耐高温驯化过程为第一步，先将所述的光合细菌稀释液分别置于45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃水浴中加热5′、10′、15′，用平板计数法测热处理后的各类细菌活菌数，计算存活率；再将所述的酵母菌稀释液分别置于55℃、60℃、65℃、70℃、75℃水浴中加热5′、10′、15′，用平板计数法测热处理后的各类细菌活菌数，计算存活率；最后将所述的曲霉菌稀释液分别置于55℃、60℃、65℃、70℃、75℃水浴中加热5′、10′、15′，前后分别接种于适宜培养皿上，30℃培养24～48h，观察有无菌丝长出，并视其生长状况确定其成活率；第二步，每种菌种选择耐较高温度相对较长时间的菌株为初发菌株，并对该菌株进行纯化、复壮、鉴定、扩大培养；第三步，采用紫外线照射法进行诱变，将所选初发菌株暴露于紫外灯下分别照射30′、60′、90′，取不同照射时间的菌株进行增殖培养、稀释分离，获得单菌落，然后挑选菌落，做种菌鉴定，对符合性状的菌株测定其耐高温活性，筛选出各类耐高温菌株，并且要验证筛选出的耐高温菌株均具有良好的可遗传能力。
所述耐药驯化过程为首先用琼脂纸片扩散培养法确定各菌种的最高耐药浓度，再以此浓度为基础逐渐增加药物浓度进行耐药性强化培养，筛选出耐最高浓度的菌株进行增殖培养、稀释分离，获得单菌落，然后挑选菌落，做种菌鉴定，对符合要求的菌株要验证其耐药性状具有良好的可遗传能力；不符合要求的菌株采用紫外线照射法进行诱变。
所述微胶囊包被过程为将发酵终止的的菌液离心后取菌泥，用生理盐水将菌泥稀释成所需浓度，做活菌计数；分别制备4.5％～5.5％阿拉伯胶水溶液和9％～11％明胶水溶液，45℃保温备用；将菌液与4.5％～5.5％阿拉伯胶水溶液按体积比1.8～2.2∶1比例混合后迅速振荡混匀，调PH值至4.2～4.6，并迅速降温至19.5～20.5℃制成混合液，在混合液中按体积比1.8～2.2∶1比例加入9％～11％明胶水溶液，继续搅拌，并迅速降温至4℃以下，调PH值至2.0后继续搅拌30min，干燥后测活菌数。
所述的耐药性强化培养采用平皿浓度梯度法进行，具体过程根据菌株所耐受的浓度将耐受药品稀释到一定浓度制成药液，然后先在灭菌空培养皿内加入一定量的药液，再倾入15-20ml冷却至50-60℃的琼脂培养基，迅速混匀后摆成斜面，培养皿与水平面夹角25-35°，做成平皿斜面；冷却后再倾入等量的同等条件培养基，摆成平面、冷却备用，将目的菌株均匀涂布于该平皿上，适宜条件培养，选出耐高浓度药物菌株，重复上述过程，筛选耐更高浓度的菌株。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果1、本发明使益生菌、益生元、高产酶菌功能互补，三效合一协同作用，活性高。活菌总数可达27亿。内源菌的增殖和外源菌的添加能有机结合，以双歧杆菌的增殖为例，可由采食该产品前的17％迅速达到82％，增殖4-5倍，且定殖力强，能长期稳定地发挥作用。
2、本发明选用高产酶菌株，并对筛选出的菌株进行耐高温、耐热性、耐药性、热灭活、包被等特殊的技术处理，与普通菌株相比具有极强的产纤维素、半纤维素等多种消化、诱食等酶类的能力，还具有一定的抗菌谱特性，可替代酶制剂。
3、本发明耐热性强、耐药性好、稳定性高。本发明经耐高温驯化后可耐受90-100℃高温10分钟，存活率达80％。本发明经耐药性驯化后可耐受包括沙星类在内的20种饲用抗生素正常剂量药物的影响。本发明经热灭活处理、双胶囊包被后提高了菌种的耐热稳定性、耐酸碱稳定性及产酶稳定性，有效贮存期达18个月。
具体实施例方式
本发明实施例1原料组成(协力2000)蜡状芽孢杆菌 15％枯草芽孢杆菌 10％地衣芽孢杆菌 15％酿酒酵母 3％热带假丝酵母 2％光合细菌 5％植物乳杆菌 0.5％嗜酸乳杆菌 0.5％青春双歧杆菌 1％黑曲霉 0.5％米曲霉 1％绿色木霉 0.5％低聚异麦芽糖 6％
麦饭石 40％制备方法(一)将所述的芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌、曲霉菌菌种进行耐高温驯化、耐药驯化后保藏，并对保藏的菌种传代；1.耐高温驯化1.1菌种种类、来源及驯化前耐受温度。(详见表1)表1菌种种类、来源及驯化前耐受温度
1.2因芽孢杆菌成芽孢后均能耐受100℃高温，无需再做驯化筛选1.3耐高温驯化过程。
第一步，先将所述的光合细菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌稀释液分别置于45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃水浴中加热5′、10′、15′，用平板计数法测热处理后的各类细菌活菌数，计算存活率；再将所述的酿酒酵母、热带假丝酵母稀释液分别置于55℃、60℃、65℃、70℃、75℃水浴中加热5′、10′、15′，用平板计数法测热处理后的各类细菌活菌数，计算存活率；最后将所述的黑曲霉、米曲霉、绿色木霉稀释液分别置于55℃、60℃、65℃、70℃、75℃水浴中加热5′、10′、15′，前后分别接种于适宜培养皿上，30℃培养24～48h，观察有无菌丝长出，并视其生长状况确定其成活率；第二步，每种菌种选择耐较高温度相对较长时间的菌株为初发菌株，并对该菌株进行纯化、复壮、鉴定、扩大培养；结果见表2。
表2初发菌株
第三步，采用紫外线照射法进行诱变，将所选初发菌株暴露于紫外灯下(照射强度40w，距离20cm)分别照射30′、60′、90′，取不同照射时间的菌株进行增殖培养、稀释分离，获得单菌落，然后挑选菌落，做种菌鉴定，对符合性状的菌株测定其耐高温活性，筛选出各类耐高温菌株，并且要验证筛选出的耐高温菌株均具有良好的可遗传能力。
1.4通过紫外线诱变及耐高温筛选，成功筛选出各类耐高温菌株。(详见表3)
表3耐高温菌株
2.耐药驯化2.1几种常用药物的通常使用浓度表4
2.2按表4中药物的平均浓度做成纸片，用“琼脂纸片扩散法”对不同菌种进行药敏试验。测定和细分各菌种对各种药物的适应、耐受程度，按抑菌圈直径大小为不敏、低敏、较敏、极敏等级别。结果详见表5。
表5药敏试验结果
注不敏-+；低敏+；较敏++；极敏+++++2.2耐药性强化培养。所有真菌对上述药物均不敏感，可直接应用。低敏、较敏、极敏的细菌，以此浓度为基础逐渐增加药物浓度采用平皿浓度梯度法进行耐药性强化培养，具体过程根据菌株所耐受的浓度将耐受药品稀释到一定浓度制成药液，然后先在灭菌空培养皿内加入一定量的药液，再倾入18ml冷却至55℃的琼脂培养基，迅速混匀后摆成斜面，培养皿与水平面夹角30°，做成平皿斜面；冷却后再倾入等量的同等条件培养基，摆成平面、冷却备用，将目的菌株均匀涂布于该平皿上，适宜条件培养，选出耐高浓度药物菌株，重复上述过程，筛选耐更高浓度的菌株。对筛选出的菌株进行增殖培养、稀释分离，获得单菌落，然后挑选菌落，做种菌鉴定，对符合要求的菌株要验证其耐药性状具有良好的可遗传能力；不符合要求的菌株采用紫外线照射法进行诱变。
2.3采用紫外线照射法进行诱变，将不符合要求的菌株暴露于紫外灯下(照射强度40w，距离20cm)分别照射30′、60′、90′，取不同照射时间的菌株进行增殖培养、稀释分离，获得单菌落，然后挑选菌落，做种菌鉴定，对符合性状的菌株测定其耐药性，筛选出各类耐药菌株，并且要验证筛选出的耐药菌株均具有良好的可遗传能力。
2.4通过对菌株进行耐药驯化、诱变和纯化鉴定，成功筛选出了耐受部分抗生素的有益菌株，且这些菌株均具有较强的广谱耐药性。结果详见表6。
表6诱变后最终药敏实验结果
(二)对保藏的菌种进行活化、发酵后微胶囊包被，并对包被后的菌种干燥；1.微胶囊包被。将发酵终止的的菌液离心后取菌泥，用生理盐水将菌泥稀释成所需浓度，做活菌计数；分别制备5％阿拉伯胶水溶液和10％明胶水溶液，45℃保温备用；将菌液与5％阿拉伯胶水溶液按体积比2∶1比例混合后迅速振荡混匀，调PH值至4.6，并迅速降温至20℃制成混合液，在混合液中按体积比2∶1比例加入10％明胶水溶液，继续搅拌，并迅速降温至4℃以下，调PH值至2.0后继续搅拌30min，干燥后测活菌数。
2.相关技术指标2.1微胶囊形态、大小取混合液做革兰氏染色，镜检(16×40倍)，清晰可见视野中双层微胶囊，直径50μm~200μm，每个微胶囊包含20～50个细菌。
2.2耐高温、酸、碱性检验取一定量微胶囊液分别进行如下处理①85℃10min②37℃pH＝2H℃L溶液30min③37℃ pH＝13 NaOH溶液30min然后，离心取沉淀物染色镜检，其破壁率分别为0、8％、12％2.3包被与未包被菌液干燥后成活率对比2.3.1检验方法平板计数法2.3.2模拟肠胃环境体外破壁液的配制1号液稀盐酸溶液pH调为2.0+酸性蛋白酶(本公司自制)适量2号液取1号液750ml加250ml 0.2mol/L硫酸钠溶液，调pH至6.82.3.3双层微胶囊破壁精确称量一定量的干燥样品置一定体积的1号液中，37℃水浴保温30min，调pH至6.8，加入等体积的2号液，37℃保温30min。离心，取沉淀物，镜检破壁率。
2.3.4对2.3.3沉淀物做平板计数并与未包被干燥样品比较活菌数。结果如下与未包被菌液相比，包被后的干燥样品与未包被的干燥样品有益菌平均存活率分别为95％，50％。
3.结论3.1该项技术首次将微胶囊包被技术应用于动物微生态领域，并且针对动物的消化道生理特性，设计了两种不同性质的囊材，以保证其在动物胃肠道有层次的降解，顺利释放出有益菌。
3.2双层微胶囊具有抗热、耐酸、碱等特性。抗逆性差的微生物(尤其是专性厌氧的双歧杆菌、兼性厌氧的乳酸菌、光合菌等)经双层微胶囊包被后可极大提高其抗热。耐氧、酸、碱等特性。该项技术在动物微生态制剂上的应用可大大提高产品性能。
3.3该项技术所用材料、器皿均为普通工业实验用品，其操作方法简便实用。
(三)将干燥后的菌种粉碎并与低聚异麦芽糖、麦饭石按比例混合均匀，包装，入库。
本发明实施例2原料组成(协力3000)蜡状芽孢杆菌14％
枯草芽孢杆菌13％地衣芽孢杆菌14％酿酒酵母3％热带假丝酵母2％光合细菌4.5％植物乳杆菌 1％嗜酸乳杆菌 1％青春双歧杆菌1.5％黑曲霉 0.5％米曲霉 1％绿色木霉0.5％低聚异麦芽糖6％麦饭石 38％制备方法与实施例1基本相同。
权利要求
1.一种无公害高效能寡聚糖高产酶复合动物微生态制剂，其特征是所述制剂的原料组成的重量百分比为蜡状芽孢杆菌10～15枯草芽孢杆菌10～15地衣芽孢杆菌10～15酿酒酵母1～5热带假丝酵母1～5光合细菌1～5植物乳杆菌 0.5～3嗜酸乳杆菌 0.5～3青春双歧杆菌1～3黑曲霉 0.5～3米曲霉 0.5～3绿色木霉0.5～3寡聚糖 5～10载体30～50
2.根据权利要求1所述的无公害高效能寡聚糖高产酶复合动物微生态制剂，其特征是所述的寡聚糖是低聚异麦芽糖。
3.根据权利要求1所述的无公害高效能寡聚糖高产酶复合动物微生态制剂，其特征是所述的载体是麦饭石。
4.一种无公害高效能寡聚糖高产酶复合动物微生态制剂的制备方法，其特征是①将所述菌种进行耐高温驯化、耐药驯化后保藏，并对保藏的菌种传代；②对保藏的菌种进行活化、发酵后微胶囊包被，并对包被后的菌种干燥；③将干燥后的菌种粉碎并与寡聚糖、载体按比例混合均匀。
5.根据权利要求4所述的无公害高效能寡聚糖高产酶复合动物微生态制剂的制备方法，其特征是所述耐高温驯化过程为第一步，先将所述的光合细菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌稀释液分别置于45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃水浴中加热5′、10′、15′，用平板计数法测热处理后的各类细菌活菌数，计算存活率；再将所述的酿酒酵母、热带假丝酵母稀释液分别置于55℃、60℃、65℃、70℃、75℃水浴中加热5′、10′、15′，用平板计数法测热处理后的各类细菌活菌数，计算存活率；最后将所述的黑曲霉、米曲霉、绿色木霉稀释液分别置于55℃、60℃、65℃、70℃、75℃水浴中加热5′、10′、15′，前后分别接种于适宜培养皿上，30℃培养24～48h，观察有无菌丝长出，并视其生长状况确定其成活率；第二步，每种菌种选择耐较高温度相对较长时间的菌株为初发菌株，并对该菌株进行纯化、复壮、鉴定、扩大培养；第三步，采用紫外线照射法进行诱变，将所选初发菌株暴露于紫外灯下分别照射30′、60′、90′，取不同照射时间的菌株进行增殖培养、稀释分离，获得单菌落，然后挑选菌落，做种菌鉴定，对符合性状的菌株测定其耐高温活性，筛选出各类耐高温菌株，并且要验证筛选出的耐高温菌株均具有良好的可遗传能力。
6.根据权利要求4所述的无公害高效能寡聚糖高产酶复合动物微生态制剂的制备方法，其特征是所述耐药驯化过程为首先用琼脂纸片扩散培养法确定各菌种的最高耐药浓度，再以此浓度为基础逐渐增加药物浓度进行耐药性强化培养，筛选出耐最高浓度的菌株进行增殖培养、稀释分离，获得单菌落，然后挑选菌落，做种菌鉴定，对符合要求的菌株要验证其耐药性状具有良好的可遗传能力；不符合要求的菌株采用紫外线照射法进行诱变。
7.根据权利要求4所述的无公害高效能寡聚糖高产酶复合动物微生态制剂的制备方法，其特征是所述微胶囊包被过程为将发酵终止的的菌液离心后取菌泥，用生理盐水将菌泥稀释成所需浓度，做活菌计数；分别制备4.5％～5.5％阿拉伯胶水溶液和9％～11％明胶水溶液，45℃保温备用；将菌液与4.5％～5.5％阿拉伯胶水溶液按体积比1.8～2.2∶1比例混合后迅速振荡混匀，调PH值至4.2～4.6，并迅速降温至19.5～20.5℃制成混合液，在混合液中按体积比1.8～2.2∶1比例加入9％～11％明胶水溶液，继续搅拌，并迅速降温至4℃以下，调PH值至2.0后继续搅拌30min，干燥后测活菌数。
8.根据权利要求6所述的无公害高效能寡聚糖高产酶复合动物微生态制剂的制备方法，其特征是采用平皿浓度梯度法进行耐药性强化培养，具体过程根据菌株所耐受的浓度将耐受药品稀释到一定浓度制成药液，然后先在灭菌空培养皿内加入一定量的药液，再倾入15-20ml冷却至50-60℃的琼脂培养基，迅速混匀后摆成斜面，培养皿与水平面夹角25-35°，做成平皿斜面；冷却后再倾入等量的同等条件培养基，摆成平面、冷却备用，将目的菌株均匀涂布于该平皿上，适宜条件培养，选出耐高浓度药物菌株，重复上述过程，筛选耐更高浓度的菌株。
全文摘要
一种无公害高效能寡聚糖高产酶复合动物微生态制剂，由下述重量百分比的原料组成蜡状芽孢杆菌10～15，枯草芽孢杆菌10～15，地衣芽孢杆菌10～15，酿酒酵母1～5，热带假丝酵母1～5，光合细菌1～5，植物乳杆菌0.5～3，嗜酸乳杆菌0.5～3，青春双歧杆菌1～3，黑曲霉0.5～3，米曲霉0.5～3，绿色木霉0.5～3，寡聚糖5～10，载体30～50。制备方法①将所述菌种进行耐高温驯化、耐药驯化后保藏，并对保藏的菌种传代；②对保藏的菌种进行活化、发酵后微胶囊包被，并对包被后的菌种干燥；③将干燥后的菌种粉碎并与寡聚糖、载体按比例混合均匀。本发明通过对益生素组方的调整、重组以及寡聚糖、高产霉菌的合理添加与组合配伍，使各菌种协同作用，使双歧因子等有益菌的作用充分体现，高产酶的作用有效发挥，优化了养殖生态环境，是一种无污染、无公害的高效绿色环保型饲料添加剂。
文档编号A23K1/16GK1653932SQ20041007341
公开日2005年8月17日 申请日期2004年12月10日 优先权日2004年12月10日
发明者王刚, 豆晓梅, 王平, 刘丽 申请人:宝鸡市星星协力生物有限公司