专利名称：人工杂交灵芝的生产及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人工杂交灵芝的生产及应用，人工杂交灵芝由松杉灵芝种属栽培种和灵芝的野外种源分离株进行原生质体融合而成，这种生物工艺育种的杂交菌株称为“半岛灵芝-创意一号”。
背景技术：
灵芝是一组药用真菌，包括灵芝、松杉灵芝和紫芝。各物种间不能相互杂交，而且核核糖体DNA序列和线粒体的核糖体DNA基因序列也各不相同。灵芝生长的温度范围比松杉灵芝广。有人发现这些药用真菌可显示出不同的药效，它们的生化成分包括多糖和萜烯。天然灵芝在不同的地带生长并固守着自己的领土。
当前的研究中，人工引进另一野生灵芝种属的种质，运用原生质体融合技术将两个基因组带入同一胞浆内，从而扩大灵芝栽培品种的温度生长范围。生长温度范围的扩展能促进全年的商业产量，降低季节性气候地区的投资成本。原生质体融合生物技术有利于引进一个或多个多基因遗传的性状以及未知遗传机制的性状，和跨越两个生物物种间的繁殖屏障。该技术的成功仍然离不开以“适者生存”为基础的自然选择框架。对幸存者进行人工的精挑细选后，分离出优化的灵芝改良品种。原生质体融合蘑菇的技术虽然在实验室已经开展起来，但其实际应用尚无报道。这就可能反映实验室菌种的弊端，例如，不能开发营养突变体商品，和/或低质量人工杂交种，如不育、生长不良和/或结实率低，或杂交失败。
此发明通过引进野生灵芝的种质，扩大灵芝的生长温度范围，以提高灵芝品种的质量，结果，人工杂交使生产灵芝的结果时间缩减了三分之一，而且繁殖出了大量的灵芝蘑菇和灵芝担孢子。
发明内容
本发明讲述了有结实能力的蘑菇杂交种的育种方法，这种杂交种可源自两个或以上的种属为亲代。(a)两个或以上的灵芝品种通过原生质体融合法产生杂交种；(b)筛选具有性繁殖能力的杂交种。
本发明为一个以上物种间培育出性质稳定、具有性繁殖能力的蘑菇杂交菌株提供了解决途径。在蘑菇种植中，多个孢子可参与生成蘑菇种植的接种培养物。没有设备和培养技术的蘑菇种植者都进行这种“多孢子”接种方法。他们采集蘑菇作为多孢子接种方法的原料。但此方法只限于种内杂交。更重要的是，此种“多孢子”栽培的产量不稳定。因此，蘑菇种植的趋势仍然是单一栽培。将两种或更多种的原生质体悬浮液混合起来不会阻碍原生质体融合，但优化品种的筛选成功与否会受到亲代品种遺傅差異的影响。种内杂交(所有物种均相同)并不难，然而在种内杂交技术中也可采纳传统的育种方法。
具体来说，本发明为两个蘑菇种属间培育有结实能力的杂交种提供了一种目标驱动法，此方法包括两个步骤(a)用松杉灵芝菌株和灵芝菌株制备原生质体融合液，(b)在存活分离菌株中筛选出具有性繁殖力的优化杂交种。
这里的目标驱动法用于描述这样一种情况，即用种植计划所设定的目标来指导设计和试验程序。目标是指要培育的人工杂交种的理想特性或改良特性。如果关系到一种以上的特性，那么首先确定其在目标中的重要性，然后规定试验工作中按筛选标准确定需优先使用的特性。因此，此方法为目标驱动法。
例如，本研究包含许多物种特征，期望杂交种是具有稳定的商品开发能力的菌株；一种温度生长范围宽、长势快、有结实能力的灵芝。杂交种的高低温耐受值的扩展显著降低了蘑菇生产的投资及经营成本(通过节能)。于是，扩展生长温度范围就成了最重要的目标。温度筛选简单易行，这种方法为识别生长温度范围广的特种杂交种提供了有力的平台，而生长迅速的杂交种的识别是通过半定量方法选出筛选培养基中的最大菌落。结实质量及其稳固的能力为下一步的挑选标准。
应用原生质体融合蘑菇的技术虽然在实验室已经开展起来，但其实际应用尚无报道。这就可能反映出实验室分离技术的弊端，例如，不能开发营养突变体商品，和/或低质量人工杂交种，如不育、生长不良和/结实少，或杂交失败。
特别是，无人尝试用灵芝和松杉灵芝做原生质体融合。
图形1具体描述了此方法。更具体地说，此方法还包括筛选出的杂交种所具有的分子分类法的基因序列和DNA指纹图特征。以及营养和结实生长时期的形态分类学描述。
图2具体阐明了本发明的筛选过程。
本发明还提出了在上述方法中如何选择杂交种。具体是指杂交种的长势迅速，并指杂交种能在较广的温度范围内生长，其生长的温度范围为5℃至37℃。
筛选出的杂交种称为半岛灵芝菌株创意一号，按照国际认可的关于专利程序的微生物保存的布达佩斯条约中的规定，于2004年8月24日保藏，保藏编号为CGMCC No.1208。菌种为半岛灵芝创意一号，分类命名为灵芝(ganoderma lucidum)保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址在中国北京市海淀区中关村北-条13号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100080。
本发明还通过筛选的杂交菌株，培育出灵芝菇和灵芝担孢子。
本发明还包括用筛选出的杂交菌株制备提取物、浓缩液、破壁孢子制剂、蘑菇片、菌丝体粉、多糖制剂、孢子油、萜烯制剂、茶、灵芝菇或孢子所酿的酒。
最后，本发明介绍了杂交菌株、灵芝菇或杂交菌株释放的灵芝担孢子的不同用途，包括饮食或药用。
图1两物种间人工杂交过程中，运用目标驱动法进行菌株改良。
图2优化品种的分离方法的筛选原则。
图3杂交菌株的生长温度和速度。在完全培养基中，于特定温度下进行5天避光真菌培养，然后根据菌落半径的增长大小测量生长速度。对5项重复实验中的资料作平均数和标准差。在30℃的最佳温度下，杂交菌株的生长速度是亲代栽培种的二倍。与亲代栽培种不同，杂交菌株在18℃和37℃时也在生长，但40℃时两者都会死亡。杂交菌株符号，▲。亲代栽培种符号，■。
图4应用随机引物的随机扩谱多形性DNA标记法制作的杂交菌株和亲代的DNA指纹图。随机引物PP4L，PS3L，PS1L，POM和UK。Lane M，GeneRulerTM100bp DNA LadderPlus，(MBI Fermentas)；H，杂交菌株；C，栽培种亲代；W，野生种亲代。
图5杂交菌株核核糖体DNA基因的核苷序列(序列号1)。
图6杂交菌株线粒体核糖体DNA基因的核苷序列(序列号2)。
图7相差光镜照片显示杂交菌株的营养菌丝体在相邻管丝细胞隔膜处产生一个锁状连合。具有较厚细胞壁的厚垣孢子位于末端或中间位置(在两细胞之间)。
图8灵芝杂交菌株的子实体(菇)。(a)杆状原基。(b)生有中央或侧茎的菌盖具同心鲜红色环。(c)完全成熟的蘑菇被释放出的褐色担孢子覆盖而失去外表的光泽。
图9杂交菌株的担孢子。(a)两个担子的电子扫描显微图片，每个担子产生四个担孢子。(b)光镜照片显示双层细胞壁的、褐色的、椭圆形的担孢子。(c)电子扫描显微图片显示某些担孢子的细胞外壁薄弱出现“孔”状。
下面例证能帮你更好地了解本发明。生物工艺工作者根據下面详尽的方法和结果的讨论很容易意识例证的描述闡明了本发明。
具体实施例方式松杉灵芝和灵芝通过原生质体融合法的人工杂交。
(a)两个亲本为营养菌丝体，将其培育在完全培养基(CM)肉汤中，成份包括MgSO4·7H2O，0.5；KH2PO4，0.46；K2HPO4，1；peptone，2；D-glucose，20(g/L)，避光、温度为28℃、转速为120rpm条件下培养，并记录时间。采用无菌技术收获生长活跃的菌丝体，用直径为1毫米的镍网过滤，并用渗透缓冲液冲洗(0.6M的蔗糖溶液)。然后，将菌丝体培养在每毫升含10毫克溶壁酶(中国广东微生物学院)的渗透缓冲液中1至3小时，用酶将真菌细胞壁溶解掉。采用相差光镜照像法对生成的原生质体用血球计计算数量。
等到释放出足够的原生质体后，用一个塞着玻璃棉柱的注射器将未消化的菌丝体过滤出来，在2000xg的转速下，离心浓缩10分钟。取原生质体的上清液，与细胞碎片分离；在6000xg的转速下离心15分钟，获得浓缩的原生质体小球。两次获得的原生质体都重新加入渗透缓冲液中，与30％聚氧乙烯(MW 4,000；w/v)在0.01M的氯化钙溶液中混合，避光28℃条件下放置一小时。然后，将原生质体混合液和再生培养基放入渗透型缓冲液中进行细胞壁修复，此培养基包含D-葡萄糖，4；酵母提取物，4；麦精，10；和琼脂，15(g/L)。在避光28℃条件下培养5天后，将100个肉眼可见菌落作为纯化的分离菌株取出并转移到完全培养基中。
在两个极端的生长温度(18和35℃)下，将纯化的分离菌株在完全培养基上培养5天，完成理想杂交种的筛选。两个亲本同时经过平行检测。作5项重复实验。选择能在两个极端温度下存活并且生长速度超过其亲代品种的杂交菌株(如图3中的演示)。取5个筛选出的分离菌株，在蘑菇种植厂中测试有性繁殖(结实)的能力和产量，香港中文大学(CUHK)和半岛创意有限公司分别重复试验三次。香港中文大学的试验中每分离菌株共产30袋，而在半岛创意有限公司的工作坊则为大批量生产(每分离菌株种180袋)。
结实测试在高压蒸汽灭菌的塑料袋中进行，每个袋中包括500克的培养物，培养物中成份含有锯屑，60；粉碎的椰子纤维，20；小麦麸，14；蔗糖，5；和石灰，1。在香港中文大学生物学学系的蘑菇养殖厂，菌丝体在避光28℃的条件下培育。而在半岛创意有限公司的工作坊中，在10到33℃的室温下培育，未对温度加以控制。当菌种生长完全覆盖培养物时(根据分离菌株性能通常需要25至45天)，就会被转移到蘑菇种植厂的结实环境舱中。灵芝菇的生长条件为12小时光照和12小时避光的光周期，85％或更高的相对湿度、温度为28℃。工作坊的结实试验的光周期为自然光周期，温度波动在15到33℃之间，相对湿度为80％或更高。选出一个高产、结实能力稳定的纯种菌株。
(b)生物工艺杂交菌株的特征■通过随机扩增多态性DNA标记法标记的DNA指纹图用液氮冷藏上述的肉汤培养基的菌丝体，从中提取和纯化基因组DNA。DNA样品的浓缩纯化液经分光光度法测量，其OD260∶OD280吸收率比值应超过1.8，同时要采用溴化乙啶着色法，通过琼脂糖胶电泳进一步检测其浓度和纯度。
下面为5对随机引物的序列UK5’-CAATTTCAATGTTCCGGACC-3’(SEQ ID No.3)(序列号，3)3’-CAGTTGGTGGAAGGAAAGGA-5’(SEQ ID No.4)(序列号，4)PS3L5’-GAGCAGGGCAAGCGTTATAG-3’(SEQ ID No.5)(序列号，5)3’-CTATTCGAAACGCGGACAAT-5’(SEQ ID No.6)(序列号，6)PS1L5’-GAATGCGGTGCTTCCTACTG-3’(SEQ ID No.7)(序列号，7)3’-CCGACAGCTAAAGCGGGTAT-5’(SEQ ID No.8)(序列号，8)POM5’-AGCCGTATCTTTGCCTCAGA-3’(SEQ ID No.9)(序列号，9)3’-ATCGTCTCGAGCGAACAAGT-5’(SEQ ID No.10)(序列号，10)PP4L5’-GTCGAAATTCATGGCAAGGT-3’(SEQ ID No.11)(序列号，11)3’-CAGTATTGCGACGGTCTCAG-5’(SEQ ID No.12)(序列号，12)反应液中含有1x聚合酶链反应缓冲液II(普金埃尔莫希特斯公司)，3.5mM氯化镁，四种核甘酸各200mM(普金埃尔莫希特斯公司)，1M引物和2.5U的TaqDNA多聚酶(宝灵曼公司)，25ng(纳克)的基因组DNA(威尔士和麦克莱伦，1990；威廉等，1990；赵等，1993，1996)。加热程序为36个严格的循环周期，每个周期包括，94℃2分钟，45℃1分钟，72℃2分钟，最后一个循环后72℃延迟10分钟。
以没有DNA的对照标准同时进行平行检测和重复试验以確定实验结果的一致性和控制性。用琼脂糖胶电泳做出DNA指纹图，并通过凝胶成像系统捕捉图像(BIO-RAD凝胶扫描仪，1000型)。
图4表明，与原生质体融合法中使用的亲代品种的DNA指纹图相比，杂交菌株的DNA指纹图有所不同。
■特殊的聚合酶链反应(PCR)和DNA序列真菌特异性引物ITS(核糖体内转录间隔区)4和ITS5用于扩增核核糖体DNA区(ITS1，5.8S和ITS2)，另一对引物用于线粒体核糖体DNA扩增，反应在PTC-100TM型热循环仪上进行(MJ科研公司)。核引物序列如下分别为5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(序列号，13)和5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’(序列号，14)。线粒体引物序列如下5’CAGCAGTCAAGAATATTAGTCAATG-3’(序列号，15)and 5’-GCGGATTATCGAATTAAATAAC-3’(序列号，16)。总量为10微升的反应液包括1X反应缓冲液VI，2.5mM氯化镁，四种核甘酸各10mM，每个引物为10pM，2U的Thermoprime plus Taq DNA聚合酶(AB基因)以及大约100纳克的基因组DNA。PCR的程序包括95℃1分钟；60℃1分钟；70℃1分钟，进行39个周期，最后一个循环后70℃延迟10分钟。
PCR扩增片段将进一步用GENECLEANII KIT核酸纯化系统进行纯化。在加入玻璃牛奶悬浮液之前，将三份碘化钠储备溶液加入PCR混合液中，充分混合5分钟，离心15秒形成玻璃牛奶/DNA化合物小球。然后，用20微升的New Wash溶液洗涤三次并真空干燥。用8微升超纯净水重新溶解干燥后的小球，进行离心前将混合液放置5分钟。收集纯DNA上清液进入循环，用不同的荧光染料标记扩增的DNA，此过程在DNA测序仪上进行(PE应用生物系统公司)。混合液包括2微升纯DNA模板；目标基因的正向引物2微升；dRhodamine Terminator 4微升(PE应用生物系统公司)和超净化水，总量为10微升。加热程序如下共36个周期，95℃30秒进行DNA变性，然后退至50℃，共30s，最后在70℃时延长1分钟。
然后，放入70％乙醇(含0.5mM的氯化镁)沉淀DNA产物，温度为-20℃，共2-3小时。14000xg转速下离心15分钟，接着用冷藏的70％乙醇洗涤离心后的小球并进行真空干燥，然后加入12微升的模板抑制剂(PE生物系统)，将干燥后的小球再悬浮起来。简单离心后，收集浓缩后的样本。然后将样本悬浮于ABI Prism 310型基因分析仪中(PE生物系统)，用序列分析软件3.0版进行处理(PE生物系统)。
图5和图6显示的是杂交菌株的核苷酸序列。经过验证的人工杂交菌株存放在中国香港中文大学的生物系。这种灵芝分离菌株是一种双核体(即高等生物的双倍体)，不是通过原生质化过程产生的单倍体，并具有锁状连合(图7)。与栽培种亲代品种相比，其结实时间只需一个半月，将生产周期迅速降低。杂交菌株具备正常的有性繁殖(结实)能力，还能产生担孢子(图8和图9)。
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<221>Unsure<222>(1)..(22)<400>16gcggattatc gaattaaata ac 2权利要求
1一种制备可结实蘑菇杂交种的人工方法，亲代为两种或两种以上的物种，其特征在于，包括以下步骤a)融合制备的松杉灵芝和灵芝的原生质体，然后培养原生质体混合物成可存活的分离菌株；b)从可存活的分离菌株中筛选出可结实杂交种。
2权利要求1所述的方法，是目标驱动法，其中的设计和试验程序都是由种植程序的目标指导的。
3权利要求1所述的方法，具体步骤列在图1中。
4权利要求1所述的方法，进一步的特征是，筛选出的杂交种具有分子分类法的基因序列和DNA指纹图谱特征，以及营养和结实生长时期的形态分类学描述。
5权利要求1所述的方法，其中杂交种的筛选过程由图2列出。
6用权利要求1所述的方法筛选的杂交菌株。
7权利要求6的杂交菌株，其特征在于，生长快速，生长温度范围广。
8权利要求6的杂交菌株，为半岛灵芝菌株创意一号，保藏编号为CGMCC No.1208。
9由权利要求6-8任一项的杂交菌株产生的灵芝菇或灵芝担孢子。
10权利要求9的灵芝菇或灵芝担孢子的产物，提取物、浓缩液、破壁孢子制剂、蘑菇片、菌丝体粉、多糖制剂、孢子油、萜烯制剂、茶、酿酒产物。
全文摘要
本发明涉及一种人工杂交灵芝的生产及应用，人工杂交灵芝由工艺种植的松杉灵芝种属(栽培种)(Ganoderma tsugae)和灵芝(Ganoderma lucidum)的野外种源分离株进行原生质体融合而成，这株生物工艺育种的杂交菌株称为“半岛灵芝”，菌株号为“创意一号”。在锯屑－椰子纤维培养基上，此杂交菌株可在一个半月内繁殖产生灵芝菇和担孢子，在18℃和37℃都可生长，通过随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA markers，RAPD；随机复制多型性DNA)标记技术，此杂交菌株显示了其独特的DNA指纹图，标记中使用的随机引物(primer，引子、引信)包括PP4L，PS3L，PS1L，POM和UK，此外其核核糖体DNA基因序列和线粒体核糖体DNA基因序列不同于亲代栽培种的序列。
文档编号A01G1/04GK1742555SQ20041007408
公开日2006年3月8日 申请日期2004年9月3日 优先权日2004年9月1日
发明者赵绍惠 申请人:赵绍惠