对黑胫病真菌具有抗性的芸苔属植物的制作方法

专利名称：对黑胫病真菌具有抗性的芸苔属植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及在欧洲油菜(Brassica napus)中控制真菌疾病的领域。提供了欧洲油菜植物和种子，它们在基因组中含有来自芜青(B.rapa)8号染色体的抗黑胫病(blackleg)基因座。也提供基因组中包含至少两个或至少三个定位于不同染色体的抗黑胫病基因座的欧洲油菜植物和种子。进一步提供在欧洲油菜植物、组织或种子中检测一个或多个抗性等位基因存在的检测工具，和向其它芸苔属植物转移一个或多个抗性基因座的方法以及在杂种种子和植物中组合不同抗性基因座的方法。也提供增加抗Leptosphaeria maculans抗性的持久性的方法和本发明的植物、种子、方法和试剂盒的应用。
背景技术：
黑胫病或茎溃疡是欧洲油菜(Brassica napus L.)(油料种子油菜(oilseed rape)或Canola)的主要疾病，导致每年全球范围内主要的经济损失，特别是在欧洲、澳大利亚和北美洲。黑胫病是由真菌病原体Leptosphaeria maculans(Desm.)Ces.&De Not.(无性型黑胫茎点霉(Phoma lingam Tode ex.Fr.))引起的。L.maculans症状可以出现在子叶、叶、英和茎上。在通过风传播的子囊孢子和/或水(通过溅水)传播的分生孢子感染之后发展出叶损伤。茎的症状(或溃疡)可以通过茎的直接感染引起，或通过叶损伤处真菌的系统生长，经维管组织进入茎引起[Hammond等人.(1985)，Plant Pathology 34557-565]。茎的溃疡可能环绕茎，导致植物倒状和植物死亡。较不严重的溃疡可能导致对水和营养成分流动的限制，这反过来会导致种子和英的枯萎。英的感染可能导致成熟前的落荚(pod shattering)和种子感染。
将黑胫病抗性整合进欧洲油菜栽培品种是全世界范围内育种计划的主要目的之一。虽然喷洒杀真菌剂和种植经验都被用于减少黑胫病感染导致的产量损失，但是至今最为可靠的控制方法是遗传抗性。
欧洲油菜(2n＝38，基因组AACC)是双二倍体物种，它起源于芜青(又称芸苔(B.campestris)；2n＝20，AA)和甘蓝(Brassica oleracea L.)(2n＝18，CC)的自发杂交。欧洲油菜含有这两个二倍体基因组的全部染色体组。
黑胫病抗性的评估既可在温室也在田间实验中进行。在一个实施方案中，优选在田间实验中评估黑胫病抗性，并且可以在植物发育的不同阶段评估。在涉及黑胫病抗性时，通常不同类型的抗性根据被评估的植物阶段和组织而被区分，如幼苗抗性(‘早期’抗性)和成年植株抗性(‘晚期’或‘茎’抗性)。进行抗性分析的植物组织例如有子叶、叶和茎基。已报道的对黑胫病的遗传抗性既有单基因(在一个主效基因的控制之下)的，也有多基因(在若干微效基因的控制之下)的。
在欧洲油菜中一些抗性基因座已被绘制了图谱。例如，基于幼苗的伤口接种[Fereirra等人.(1995)，Genetics 85(2)213-217]，被命名为LEM1的单一显性抗性基因座被报导定位于欧洲油菜栽培品种Major的第6连锁群(现在发明者已知其是Sharpe等人术语中的N07染色体(1995，Genome381112-1121))。而spring cv.Cresor成年植物的田间抗性被Dion等人绘图定位于N07染色体[(1995)，TAG 911190-1194]并被命名为LmFr。栽培品种Maluka和Shiralee被报导具有命名为LmR1、定位于N07染色体上的控制幼苗抗性的主基因座[Mayerhofer等人(1997)，Genome 40294-301.]。Rimmer等人[(1999)，Proceeding of the 10thInternationalRapeseed Congress]也报导了命名为RLM、定位于N07染色体上的抗性基因座。
然而欧洲油菜(AACC基因组)缺乏足够的抗性，并且当抗性栽培品种被大范围和长期使用时，存在持继的抗性衰退的危险，这使得育种者和科学家去寻找替代的抗性来源。主要的焦点集中在从相关芸苔属物种(如芜青(AA)、甘蓝(CC)、黑芥(B.nigra)(BB基因组)、芥菜(B.juncea)(AABB基因组)和B.carinata(BBCC))中鉴定和转移抗性等位基因。
黑胫病抗性的一个主要来源是B基因组。Gerdemann-Knorck等人在1994年报道了通过不对称体细胞杂交从黑芥向欧洲油菜引入黑胫病抗性[Gerdemann-Knorck等人(1994)，Plant Breeding 113106-113]。
已有的另一种方法是产生所谓的‘人工’欧洲油菜系，其中将两种二倍体物种(AA和CC基因组)进行种间杂交，随后在体外培育胚，并进行染色体加倍。
通过从野生型芜青(AA基因组)种质(accession)[Crouch等人(1994)，Plant Breeding 112265-278]和野生型B.atlantica(CC基因组)种质[Mithen和Magrath(1992)，Plant Breeding 10860-68，以及Mithen和Herron(1991)，Proceeding of the 8th International Rapeseed Congress]生成人工欧洲油菜植物，已用上述方法将黑胫病抗性引入了欧洲油菜。
6份野生型B.rapa ssp sylvestris种质与芥蓝(B.oleracea ssp alboglabra)杂交以形成一系列人工欧洲油菜系，这些人工欧洲油菜系具有相同的C基因组，但具有不同的A基因组[Crouch等人(1994)，前引文]。在温室测试中发现B.rapa ssp sylvestris#75和#76能够抵抗黑胫病分离物(子叶和叶测试)，而B.rapa ssp sylvestris#29则易感。来自#75或#76和芥蓝的两个人工系，以及它们与油料种子油菜栽培品种的F1杂种在温室实验中表现出对黑胫病的高度抗性。这些系中只有一种在英格兰和澳大利亚的田间实验中也表现出抗性。
Crouch(PhD论文，University of East Anglia，Norwich，UK)描述了与导致田间抗性的基因组区域连锁的RFLP标记物，将这些区域绘制成5个连锁群，定位了在不同组织中有助于抗性的数量性状基因座(QTL)。使用区间分析(interval analysis)鉴定了在来自人工亲本的组1[根据Sharpe等人(1995)，Genome 381112-1121，N7染色体]和来自栽培品种亲本的组3(根据Sharpe等人，N3染色体)中有助于叶抗性的QTL和在组1、组2(根据Sharpe等人，N10染色体)和组5(这一组与Sharpe等人的连锁群的关系还不确定)中有助于茎下部、下胚轴和根的抗性的QTL。区间作图未能鉴定到有助于茎上部抗性的任何QTL。
Crouch和Mithen等人(前引文)描述的人工欧洲油菜系由于含有高水平的芥子油苷、芥子酸，能育性差并具有自交不亲和性[Easton，AustraliaResearch Assembly on Brassicas(2001)]，因此不适宜农业种植。
在2000年春季，Pacific Seeds向澳大利亚市场提供了开放传粉的欧洲油菜品种Surpass 400，它获得了9.0的国家级黑胫病抗性等级，这是已知的最高水平的抗性。Surpass 400的祖先包括人工欧洲油菜，这一人工欧洲油菜来自Sicily的野生型B.rapa ssp sylvestris与芥蓝的种间杂交[Li等人，Australia Research Assembly on Brassicas 2001；Easton前引文]。在幼苗阶段提供黑胫病抗性的主要显性等位基因被报导存在于Surpass 400中[Li等人，Australia Research Assembly on Brassicas 2001]。
Yu等人[(2002)，Can.J.Plant Pathology 2496-97；Plant，Animal&Microbe Genomes Conference January 12-16，(2002)]报道了存在于用品系(breeding line)6270和6279杂交获得的欧洲油菜种群中的两个抗性基因座。位于2号染色体上被命名为LepR1的显性核等位基因，它在6270系中提供对来自病原性群体PG2、PG3和PG4的L.maculans分离菌株的抗性。第二个基因座位于10号染色体，被命名为LepR2，具有不完全显性，提供子叶对PG2和PG3分离菌株的抗性。
Rimmer等人[13th Crucifer Genetics Workshop，March 23-26，(2002)]报道了欧洲油菜中四个抗性基因座的图谱。两个抗性基因座来自欧洲油菜(不是芜青)，被绘制于染色体N7和染色体N8上。另两个基因座来自B.rapa ssp sylvestris，被绘制于染色体2和染色体10上。
在2003年初出现了第一个关于Surpass 400抗性衰退的报导。仅仅3年，似乎已经进化出了一种能够感染Surpass 400的更具毒性的真菌菌株。这一菌株能以多快速度散布到不同的地区还需要观察，但是很清楚，需要增加抗性持久性的新的抗性基因和方法。
由于病原体种群的变化会导致持续存在遗传抗性衰退的威胁，因此需要鉴定新的抗性遗传来源、向具有高农艺表现(agronomic performance)的品种转移这些来源的方法和增加抗性持久性的方法。
本发明(包括在说明书和权利要求中提供的不同实施方案)提供含有新的黑胫病抗性基因(Lem-08-syl)的植物和向其它品系或品种转移Lem-08-syl的方法和手段，以及检测植物中Lem-08-syl存在与否的方法。
发明概述在本发明的一个实施方案中提供了在8号染色体上含有新黑胫病抗性基因的芥菜植物、种子和组织，其中抗性基因来自芜青。在本发明另一实施方案中，提供了含有芜青染色体R08的片段的芥菜植物，其中所述片段含有黑胫病抗性基因。所述的芜青植物可以来自野生型芜青种质(accession)，如B.rapa ssp sylvestris、B.rapa ssp chinensis、B.rapa sspdichotoma、B.rapa ssp japonica、B.rapa ssp narinosa、B.rapa ssp olifeira、B.rapa ssp pekinensis、B.rapa ssp perviridis、B.rapa ssp trilocul。
在本发明一个实施方案中，提供了含有芜青染色体R08的片段的欧洲油菜植物，其中所述片段含有黑胫病抗性基因，其中这些欧洲油菜植物选自含有整合进其基因组的转基因的欧洲油菜植物；含有所述黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物的后代，其中所述后代来自含有所述黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物与Surpass 400植物的杂交；在干燥、脱脂的种子粉中脂肪族芥子油苷水平低于30mmol/g的欧洲油菜植物；其种子的固体成分中3-丁烯基-芥子油苷、4-戊烯基-芥子油苷、3-羟基-3-丁烯基-芥子油苷和2-羟基-4-戊烯基-芥子油苷中任何一种或它们混合物的含量少于30微摩尔/克风干无油固体的欧洲油菜植物；产生的油(粉碎(crush)种子后)中芥子酸的含量少于2％(占油中总脂肪酸的量)的欧洲油菜植物；欧洲油菜春油料种子油菜植物；欧洲油菜冬油料种子油菜植物；在染色体N2上不含有黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物；在染色体N10上不含有黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物；不含有作图在染色体2或染色体10上的抗性基因的欧洲油菜植物，所述抗性基因来自B.rapa ssp sylvestris；含有能引起植物雄性不育的转基因的欧洲油菜植物，所述转基因优选是芽孢杆菌RNA酶基因；含有所述黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物的后代，其中所述后代来自含有所述黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物与以下油料种子油菜品种中任一种的杂交除草剂抗性欧洲油菜品种、种子中具有高油含量的欧洲油菜品种、种子中具有高油酸含量的欧洲油菜品种、种子中具有低亚麻酸含量的欧洲油菜品种、Jet Neuf、Quantum、Maluka、Hyola43、Hyola60、Surpass 400、Surpass402CL、Surpass603CL、Surpass501TT、RoundupReadyTM植物、LibertyLinkTM植物、含有雄性不育转基因的植物、InVigor40、InVigor70、InVigor90、InVigor2573、InVigor2663、InVigor2733、InVigor5020、InVigor5030或InVigor5070。
在本发明另一实施方案中，以上描述的欧洲油菜植物、种子和组织在染色体8含有新的黑胫病抗性基因。
前面段落中的芜青植物可以来自野生型芜青种质，如B.rapa sspsylvestris、B.rapa ssp chinensis、B.rapa ssp dichotoma、B.rapa ssp japonica、B.rapa ssp narinosa、B.rapa ssp olifeira、B.rapa ssp pekinensis、B.rapa sspperviridis、B.rapa ssp trilocul。
在本发明另一实施方案中，已经通过遗传转化将黑胫病抗性基因转移到了所述欧洲油菜或芥菜植物中。
在本发明另一实施方案中，上述黑胫病抗性基因含有这里定义的Lem-08-syl，特别是当Lem-08-syl与选自P34/M48-M283.0、P31/M59-M97.1、E32/M48-M162.7、E31/M61-M237.6、E32/M50-M362.0和E36/M51-M171.1的至少一个AFLP标记物相关时。
在本发明另一实施方案中，提供如AFLP标记物之类的、与来自芜青的黑胫病抗性基因(特别是来自芜青染色体8的黑胫病抗性基因)连锁的一种或多种分子标记物。在特定的实施方案中，本发明使用的分子标记物选自芜青特异性标记物(如E32/M50-M362.0、E36/M51-M171.1或P34/M48-M283)，或选自标记物P31/M59-M97.1、E32/M48-M162.7和E31/M61-M237.6。
在另一实施方案中，提供含有来自芜青染色体R08的黑胫病抗性基因的杂种种子，其中此杂种种子发育成的植物具有本发明概述整个第二段所描述的特征。
也提供以保藏号PTA-5410保藏于ATCC的欧洲油菜种子，和使用这些种子向其它芸苔属品系或品种渐渗入(introgression)位于芜青染色体R08的黑胫病抗性基因的方法，以及来自于这些种子的含有本发明黑胫病抗性基因的欧洲油菜或芥菜植物。
在本发明进一步的实施方案中，提供含有至少两个(优选的为至少3个或4个)黑胫病抗性基因、并且每一基因定位于不同的染色体的欧洲油菜或芥菜植物或种子。这包括含有N08染色体上的黑胫病抗性基因并且进一步含有N07、N10和/或N14染色体上的黑胫病抗性基因，或欧洲油菜栽培品种Jet Neuf、Quantum、Maluka、Hyola60或Surpass400的黑胫病抗性基因的植物。在一个实施方案中提供含有至少两个来自芜青的黑胫病抗性基因座(如位于N08染色体和N10染色体上)的植物。
本发明进一步提供产生杂种种子的方法，其中黑胫病抗性基因座被堆叠(stack)于杂种种子或植物中。此方法包括将含有来自芜青的本发明黑胫病抗性基因的雄性不育亲本植物(优选含有处于绒毡层或雄蕊特异启动子控制下的芽孢杆菌RNA酶基因的植物)与在基因组中含有恢复育性(fertility)的基因的植物(优选的是具有一个或多个在染色体8之外的其它染色体上的黑胫病抗性基因座，如位于N07、N10和/或N14染色体上的黑胫病抗性基因座，或Jet Neuf、Quantum、Maluka、Hyola60或Surpass400的抗性基因的植物)杂交。在另一方法中，雄性不育亲本含有本发明的黑胫病抗性基因和一个或多个额外的黑胫病抗性基因座，如N07、N10和/或N14染色体上的抗性基因座，或Jet Neuf、Quantum、Maluka、Hyola60或Surpass400的抗性基因。将该植物与含有恢复育性的基因的植物杂交。
在一个实施方案中，提供至少含有芜青染色体R08的黑胫病抗性基因的杂种植物和种子。在进一步的实施方案中，提供在其它染色体上也含有黑胫病抗性基因座(如Lem10、Lem7和/或Lem14)的杂种植物和种子。在本发明的一实施方案中，提供含有Lem-08-syl基因的本发明植物与已知品种Hyola60、Hyola43、Surpass501TT、Surpass400、Surpass404CL、Surpass402CL、Surpass603CL，或任何其它具有高黑胫病抗性等级(见如Khangura等人，2003，Department of Agriculture，Western Australia，Farmnote No.6/2003，ISSN 0726-934X)的油料种子油菜品种杂交的后代。
提供向其它芸苔属品系或品种转移Lem-08-syl的方法。在一实施方案中使用标记物辅助的选择来加速转移。
本发明也提供检测芸苔属植物、种子或组织中Lem-08-syl存在与否的方法。
也提供用于检测芸苔属(优选欧洲油菜或芥菜)植物、种子或组织中Lem-08-syl存在与否的检测试剂盒。这里还提供本发明的任一AFLP标记物，特别是E32/M50-M362、E36/M51-M171.1、P34/M48-M283、P31/M59-M97.1、E32/M48-M162.7和E31/M61-M237.6中的任一种，优选的是AFLP标记物E32/M50-M362、E36/M51-M171.1和P34/M48-M283中的任一种。本发明的一个实施方案涉及在欧洲油菜的AFLP分析中使用这些标记物，以及含有这类标记物的欧洲油菜分析用试剂盒。
还提供了本发明植物或种子在种植作物芸苔属油料种子植物(优选的是欧洲油菜植物)中的应用。
在本发明的另一实施方案中，如此处所用，在染色体8上含有新的黑胫病抗性基因(其中所述抗性基因源自芜青)的植物是达到由加拿大Canola Council(http//www.canola-council.org)设定的canola质量标准的欧洲油菜植物。
本发明其它实施方案详细说明于所附的权利要求中。
实施方案详述根据Sharpe等人[(1995)，Genome 381112-1121]和Parkin等人[(1995)，Genome 381122-1131]，欧洲油菜具有19对染色体，在此编号为N01到N19。N01到N10是A-基因组染色体，而N11到N19是C-基因组染色体。芜青(同名芸苔(B.campestris))具有10对染色体(A-基因组)，在此编号为R01到R10，相应于欧洲油菜的N01到N10。由二倍体祖先黑芥和芜青杂交产生的双二倍体物种芥菜具有18对染色体，10对来自芜青(A基因组，这里编号为J01到J10，相应于N01到N10)，8对来自黑芥(B基因组)。
在本发明的一个实施方案中，提供分别于N08或J08染色体上含有携带黑胫病抗性基因(这里命名为Lem-08-syl)的芜青染色体8(R08)片段的欧洲油菜植物或芥菜植物。
这里使用的“品种”(variety)与UPOV公约相一致，指的是处于已知最低等级的单一植物分类中的植物定群(plant grouping)，此定群可以通过表达给定基因型或基因型组合所导致的特征来定义，并可以与表达所述特征中的至少一种特征的任一其它植物定群相区别，并且就其适宜被不发生改变地繁殖而言被认为是一个单位。
这里使用的“Lem-08-syl”指的是位于芜青染色体8上的黑胫病抗性基因，该基因当渐渗入易于感染黑胫病的欧洲油菜或芥菜品种或品系时能够赋于这些植物黑胫病抗性。Lem-08-syl可以例如，从2003年8月22日保藏于ATCC(美国典型培养物保藏中心，10801 University Blvd，Manassas，VA 20110-2209，USA)并且保藏号为PTA-5410的种子中获得。优选的是，Lem-08-syl是来自于芜青的黑胫病抗性基因，并定位于以PTA-5410保藏号保藏的种子的N08染色体上，优选的，此基因与AFLP引物E32/M50-M362和/或P34/M48-M283相关。在本发明的一个实施方案中，“Lem-08-syl”是以PTA-5410保藏号保藏的种子中与距分别约4.7和/或约5.7cM的AFLP标记物E32/M50-M362.0和/或P34/M48-M283.0相关的“黑胫病抗性基因”。
当渐渗入对黑胫病易感的栽培品种如Kristina时，Lem-08-syl把黑胫病抗性从约1.0-2.0的等级增强到约6.0-9.0的等级，其中以1.0到9.0的等级评估黑胫病抗性，并且1.0是最易感的表型，9.0则是最具抗性的表型。应理解的是，环境条件(如位置、气候条件和疾病压力)以及评估疾病症状的人员的个人感受会对黑胫病抗性的分值具有一定的影响。因此，在对比测试中这些因素的变化应当被最小化。本领域已知的任何其它抗性分级都可以依照本发明被用于本发明植物与对照植物的比较，如Khangura等人设定的WA黑胫病抗性分级(2003，Department of Agriculture，WesternAustralia，Farmnote No.6/2003，ISSN 0726-934X)。
在一个实施方案中，渐渗入的包含Lem-08-syl的芜青片段来自野生型芜青亚种，优选的来自sylvestris亚种，但也可来自其它芜青种质，如Song等人[(1990)，TAG 79497-506]描述的野生型欧洲种质或野生型亚洲种质，或来自培育的芜青品种。应理解的是，渐渗入的芜青片段的大小可以变动，只要保留黑胫病抗性基因座即可。可以通过检测与Lem-08-syl连锁的分子标记物或通过检测易感或不具有完全抗性的芸苔属植物与含有Lem-08-syl的植物的杂交后代中黑胫病抗性是否提高来测试Lem-08-syl的存在。优选的是，芜青片段不含有任何不需要的附加基因座，如(但不限于)影响开花时间、春化作用要求(vernalization requirement)、耐冻性等的基因座。
这里所使用的“黑胫病”指的是由真菌病原体Leptosphaeria maculans或黑胫茎点霉(无性型)引起的疾病。此定义包括Tox°和Tox+分离株(isolate)，不管在以后的分类研究中它们是否可能被发现属于不同的物种[Rouxel等人(1995)，BlacklegNews N°4]。
依据与欧洲油菜栽培品种Westar、Galcier和Quinta的特异相互作用，L.maculans分离株可以被分入不同的致病组(pathogenicity groups，PG)[Mengistu等人(1991)，Plant Disease 751279-1282]。PG4分离株在所有三种栽培品种上导致孢子形成损伤，而PG3分离株在Quinta子叶上引起抗性反应，PG2分离株在Quinta和Glacier子叶上引起抗性反应。PG1分离株对于这些宿主是非致病性的。在文献中，PG2、PG3和PG4也被称为是“高侵略性”或“高毒性”或“强烈致病性”分离株，而PG1分离株被称为是“非侵略性”或“非毒性”或“弱致病性”分离株。有时高度侵略性种类也被命名为“A”，而弱侵略性种类被命名为“NA”[Badawy和Hoppe(1989)，J Phytopathology 127146-157]。最近，通过高侵略性种类的毒素产物而将其与弱侵略性种类区分(Tox+分离株相对于Tox°分离株)[Rouxel等人综述，Blackleg News N°4，(1995)]。已发现Tox°分离株会在不出现外部症状的情况下引起髓的坏死，现已有人指出对Tox°分离株导致的产量损失有所低估[Johnson和Lewis(1994)，Plant Pathology 43269-277]。Tox°分离株被进一步分为3类，即NA1、NA2和NA3，并已有人指出NA1分离株在欧洲处于主导地位，而NA2分离株在加拿大更为重要[Gall等人(1995)，Mycol Res 99221-229]。
这里使用的“外源的”，当涉及某一植物属、种或品种中的基因或转基因时，指的是正常并不存在于该属、种或品种的植物中的基因，或使用本领域已知的方法通过基因转化加入到该植物基因组中的基因，或已被化学、放射性诱导或其它植物诱变方式修饰的内源基因。
这里使用的“基因座”是基因在染色体上占有的位置。“黑胫病抗性基因座”指的是“黑胫病抗性基因”定位于染色体上的位置。这一位置可以通过在染色体遗传图谱上进行定位而被鉴定。该定义也包括黑胫病抗性基因所在的染色体的基因组DNA的片段(或区段)。
当指本发明抗性基因(特别是Lem-08-syl)的位置时，这里使用的“染色体8”是根据Sharpe等人(1995，Genome 381112-1121)的命名法的A基因组的第8号染色体。
这里使用的“黑胫病抗性基因”是指与缺乏黑胫病抗性基因或具有此基因的非功能(或无活性)形式的植物相比，增加植物(优选的为欧洲油菜植物)对Leptosphaeria maculans的抗性(或与增加抗性有关的)的DNA序列。“Lem-08-syl”是以保藏号PTA-5410保藏于ATCC的种子中与距分别约4.7和/或约5.7cM的AFLP标记物E32/M50-M362.0和P34/M48-M283.0相关联的“黑胫病抗性基因”。使用例如本发明分子标记物可以将这一抗性基因转移到不同的欧洲油菜品种，甚至转移到如芥菜之类的不同芸苔属植物种中。
来自B.rapa ssp sylvestris的黑胫病抗性被发现作为单一显性基因(Lem-08-syl)分离。使用黑胫病抗性定量测量，将Lem-08-syl绘制在欧洲油菜遗传图谱的N08染色体上，优选地N08染色体末端。通过QTL作图(数量性状基因座作图)验证了Lem-08-syl的位置和效果，其中鉴定的QTL峰与Lem-08-syl在遗传图谱上的位置一致，并且解释了77.8％的黑胫病抗性变化(LOD(优势对数)值为68.12)，表明Lem-08-syl对于黑胫病抗性具有高度显著的作用。
含有某一抗性基因的植物的“增强的抗性”指的是相对于对照植物而言，由真菌感染引起的损害降低。损害可以通过如叶子症状的数量和大小、茎症状的频率和严重程度、由茎的感染导致的植物倒伏等等来评估。特别是，当植物在有疾病压力的田间生长时，损害的减小表现为相对于对照植物产量损失的降低。这类产量损失的降低可以由于例如在具有增强的抗性的植物中真菌的感染、繁殖、传播或生存被降低或阻止所致。增强的抗性也可以指植物具有完全的抗性，即在植物身上没有发现疾病症状，或植物在现有的黑胫病评分或等级分析(如Khangura等人(2003，Department ofAgriculture，Western Australia，Farmnote No.6/2003，ISSN 0726-934X))中获得最高的抗性等级。
增强的抗性也可以通过在受控制的环境(如生长室)中进行的生物试验来评估，但是理想的是在田间实验中进行证实，因为受控环境的评估通常不能反映田间条件。这可能是由于生物试验通常测试少量的单孢子分离株，而在田间病原体群体中存在大得多的变异[见Crouch等人，前引文]。
这里使用的“等位基因”是基因的一系列可相互替换的形式中的一种。在二倍体物种中，一个给定的基因座存在两个等位基因，但在一个群体中对于一个基因座可能存在超过两个的等位基因。如果位于同源染色体相应基因座的两等位基因是相同的，这一基因座就被认为是纯合的。例如由染色体加倍而产生的加倍单倍体(doubled haploid，DH)植物，其所有的基因座都是纯合的。
这里使用的(分子)“标记物”指的是在基因组中具有固定位置的可测量的遗传特征，它通常以孟德尔方式遗传，并可以被用来作图定位目的性状。标记物的性质依赖于使用的分子分析法，并可以在DNA、RNA或蛋白质水平上被检测。可以使用例如，但不限于RFLP(限制性片段长度多性；Botstein等人(1980)，Am J Hum Genet 32314-331；Tanksley等人(1989)，Bio/Technology 7257-263)、RAPD[随机扩增的多态DNA；Williams等人(1990)，NAR 186531-6535]、AFLP[扩增片段长度多态性；Vos等人(1995)NAR234407-4414]、SNP或微卫星[也被命名为SSR’s；Tautz等人(1989)，NAR 176463-6417]的分子标记物进行遗传作图。适当的引物或探针由使用的作图方法而定。
术语“AFLP”(AFLP是荷兰Wageningen KeyGene N.V.的注册商标)、“AFLP分析”和“AFLP标记物”按照标准的术语使用[Vos等人(1995)，NAR 234407-4414；EP0534858]。如这里所使用的，AFLP标记物是具有特定大小的DNA片段，它通过AFLP分析产生并以凝胶上条带观察。每一AFLP标记物通过用于扩增它的引物组合来命名，其后是所扩增DNA片段的近似大小(碱基对)。应理解的是，依赖于使用的实验条件和仪器，这些片段的大小可能轻微地变化。应该了解的是，每当用引物组合和片段的特定大小来提及AFLP标记物时，所述大小都是近似的，包括或旨在于包括在不同实验室观察到的轻微差异。每一AFLP标记物代表基因组中的一个确定的基因座。虽然有些AFLP标记物可以被评定为共显性的(区别纯合和杂合个体，如通过带强度)，但AFLP标记物通常是显性的(不能区别纯合和杂合个体)。
如果标记物与基因或基因座在遗传上比预期的独立分配具有更大的关联性，即标记物与基因座在分离群体中共分离，并定位于同一染色体上，则该分子标记物被认为与该基因或基因座“连锁”。“连锁”是指标记物与基因座(或两个基因座或两个标记物彼此)之间的遗传距离。连锁越紧密，使标记物与基因或基因座分离的重组事件发生的可能性就越小。遗传距离(图谱距离)根据重组频率计算，并以厘摩(cM)表示[Kosambi(1944)，Ann Eugenet.12172-175]。
AFLP标记物可以“偶联相”或“排斥相”与基因或基因座发生连锁。例如与基因或基因座以偶联相连锁的显性AFLP标记物存在于具有该基因或基因座的个体中，不存在于不具有该基因或基因座的个体中，而与基因或基因座以排斥相连锁的显性AFLP标记物不存在于具有该基因或基因座的个体中，存在于不具有该基因或基因座的个体中。与Lem-08-syl连锁的本发明AFLP标记物优选地以偶联相与Lem-08-syl连锁。类似的，与这里描述的其它黑胫病抗性基因或基因座(如Lem-10-syl)连锁的AFLP标记物，优选以与Lem-10-syl偶联的方式连锁。
这里使用的“芜青特异的AFLP标记物”是通常只存在于二倍体芜青植物中，而不存在于异源四倍体芸苔属物种(优选的是不存在于欧洲油菜或芥菜)中的AFLP标记物。在本发明一个实施方案中，芜青特异的AFLP标记物是存在于芜青中但不存在于欧洲油菜中(优选的是不存在于任何一种如下欧洲油菜品种中Surpass400、Tapidor、Doublol、Mohican、Columbus、Aglona、Apache、Falcon、Silex、Kana、Express、Apex、Bristol、Vivol、Polo(W)、Orient、Mandarin、Sh7、Wuhac96.40006、Wuh5365、NAN93-1046、LE043-3、Yu-dal、Wuhan96.40005、Sh97.1020、Monty、Narendra、Drakkar、Kristina、Spok、Acrobat、Cyclone或Stellar)，特别是存在于芜青但不存在于欧洲油菜品种Kristina中的标记物。例如芜青特异的AFLP标记物通常不存在于欧洲油菜DNA或芥菜DNA中(除非从二倍体芜青，特别是从野生型芜青品种渐渗入欧洲油菜或芥菜)。因此，当使用芜青特异的AFLP标记物(使用标记物的特异AFLP引物组合)并使用欧洲油菜和芥菜DNA(不含有渐渗入的芜青片段)，优选以上列出的品种的DNA作为模板DNA，进行AFLP反应时，在AFLP凝胶上，预期的标记物位置不会出现扩增产物(没有条带)，而使用芜青DNA作为模板时就会出现预期大小的条带。与Lem-08-syl连锁的芜青特异的AFLP标记物的例子是E32/M50-M362.0、E36/M51-M171.1或P34/M48-M283.0。芜青特异的AFLP标记物无需在遗传图谱中作图定位于任何芜青染色体上，只要它被发现存在于芜青中而不存在于欧洲油菜(优选的不存在于以上列出的欧洲油菜植物)中，它就被认为是芜青特异的(如这里所使用的)。另外，通过实施如实施例1和实施例2所描述的AFLP分析，也可产生额外的与Lem-08-syl连锁的芜青特异的AFLP标记物。
然而，应当明了，AFLP标记物可以被转换成其它类型的分子标记物。当在本发明中提及特异的AFLP标记物时，应理解此定义包括用于检测如下遗传变异的其它类型的分子标记物，所述遗传变异最初是由所述AFLP标记物鉴定的。例如，如果使用已知的方法将AFLP标记物转换为其它分子标记物，这其它分子标记物就被包括于此定义中。例如，使用Meksem等人[(2001)，Mol Gen Genomics 265(2)207-214]，Negi等人[(2001)，TAG101146-152]，Barret等人[(1989)，TAG 97828-833]，Xu等人[(2001)，Genome 44(1)63-70]，Dussel等人[(2002)，TAG 1051190-1195]或Guo等人[(2003)，TAG 1031011-1017]描述的标准技术，可将AFLP标记物转换成序列特异的标记物，如(但不限于)STS(序列标志位点)或SCAR(序列表征的扩增区域，sequence-characterized-amplified-region)。Dussel等人[(2002)，TAG 1051190-1195]将与抗性连锁的AFLP标记物转换成基于PCR的序列标志位点标记物，如indel(插入/缺失)标记物和CAPS(切割扩增多态序列，cleaved amplifled polymorphic sequence)标记物。
AFLP标记物向STS标记物的转换通常涉及从AFLP凝胶中纯化DNA片段，并对DNA片段进行克隆和测序。可以使用已知的方法[Guo等人，TAG 1031011-1017]，进行AFLP片断(条带)的克隆和测序。基于标记物序列(内部)，可以开发基因座特异的PCR引物[Paran和Michelmore(1993)，TAG 85985-993]，它们扩增不同大小的片段，或在扩增之后PCR产物可以用限制酶切割以呈现多态性。由于内部PCR引物通常不能反映涉及EcoRI、MseI或PstI(或其它酶)限制性位点差异的多态性，因此反向PCR[Hartl和Ochmann(1996)，Harwood A，编辑，Methods in molecularbiology vol58basic DNA and RNA protocols，Humana Press，Totowa NJpp293-301]或PCR步移[Negi等人(2000)，TAG 101146-152；Siebert等人，(1995)，NAR 231087-1088]可以被用于鉴定侧翼序列，所述侧翼序列可以被用来产生简单的、基于PCR的基因座特异的标记物。使用如Sci-Ed(Scientific & Educational Software PO Box 72045，Durham，NC27722-2045 USA)提供的计算机软件程序可以容易的设计引物。可以通过凝胶电泳或如TaqMan技术(Roche Diagnostics)之类的荧光测定试验检测STS标记物的多态性。
使用与Lem-08-syl连锁的标记物的AFLP分析在下文被称为“Lem-08-syl AFLP鉴定方案”。在本发明一个实施方案中，使用芜青特异的AFLP标记物如(但不限于)E32/M50-M362.0或E36/M51-M171.1和/或P34/M48-M283.0，完成Lem-08-syl AFLP鉴定方案。
在本发明一个实施方案中，含有来自芜青染色体R08的新黑胫病抗性基因(优选的是如这里所使用的Lem-08-syl)的植物是芥菜植物。在本发明另一个实施方案中，含有来自芜青染色体R08的新黑胫病抗性基因(优选的是如这里所使用的Lem-08-syl)的植物是欧洲油菜植物，此欧洲油菜植物选自-满足加拿大Canola Council(http//www.canola-council.org)设定的canola质量标准的欧洲油菜植物；-含有整合进其基因组的转基因的欧洲油菜植物；-含有所述黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物的后代，其中所述后代来自含有所述黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物与Surpass400植物的杂交；-在干燥、脱脂的种子粉中含有脂肪族芥子油苷的水平低于30mmol/g的欧洲油菜植物；-其种子的固体成分中3-丁烯基-芥子油苷、4-戊烯基-芥子油苷、3-羟基-3-丁烯基-芥子油苷和2-羟基-4-戊烯基-芥子油苷中任何一种或它们的混合物的含量少于30微摩尔/克空气干燥的无油固体的欧洲油菜植物；-产生的油(粉碎种子后)中芥子酸的含量少于2％(占油中总脂肪酸的量)的欧洲油菜植物；-欧洲油菜春油料种子油菜植物；-欧洲油菜冬油料种子油菜植物；-在N2染色体上不含有黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物；-在N10染色体上不含有黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物；-不含有作图在染色体2或染色体10上的抗性基因的欧洲油菜植物，其中所述抗性基因来自B.rapa ssp sylvestris；-含有能引起植物雄性不育的转基因(优选的是芽孢杆菌RNA酶基因)的欧洲油菜植物；-含有所述黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物的后代，其中所述后代来自含有所述黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物与以下油料种子油菜品种中任一种的杂交除草剂抗性欧洲油菜品种、种子中具有高油含量的欧洲油菜品种、种子中具有高油酸含量(占总脂肪酸的至少70％，优选的至少80％)的欧洲油菜品种、种子中具有低亚麻酸含量(少于总脂肪酸的10％，优选的少于5％)的欧洲油菜品种、Jet Neuf、Quantum、Maluka、Hyola43、Hyola60、Surpass400、Surpass402CL、Surpass603CL、Surpass501TT、RoundupReadyTM植物、LibertyLinkTM植物、含有雄性不育转基因的植物、InVigor40、InVigor70、InVigor90、InVigor2573、InVigor2663、InVigor2733、InVigor5020、InVigor5030或InVigor5070。
在本发明一个实施方案中，提供含有至少一种与黑胫病抗性基因连锁的芜青特异性分子标记物的欧洲油菜植物或芥菜植物。特别是提供含有与Lem-08-syl连锁的AFLP标记物E32/M50-M362.0和/或E36/M51-M171.1和/或P34/M48-M283的欧洲油菜或芥菜植物。
在进一步的实施方案中，提供含有至少一种与Lem-08-syl连锁的AFLP标记物的欧洲油菜植物或芥菜植物。例如，提供含有一种或多种选自P34/M48-M283.0、P31/M59-M97.1、E32/M48-M162.7、E31/M61-M237.6、E32/M50-M362.0和/或E36/M51-M171.1的AFLP标记物的植物。可以通过已知的方法鉴定额外的与Lem-08-syl连锁的AFLP标记物，所述方法为例如QTL作图、集群分离子分析[Bulk SegregantAnalysis，BSA；Michelmore等人PNAS 889828-9832]结合AFLP分析，参见实施例1和2中描述。为了鉴定更为紧密连锁的AFLP标记物，如实施例中所描述的，使用已知的方法通过AFLP分析法对更多的植物个体和更多的AFLP引物组合进行分析，并且将这些标记物定位于遗传连锁图谱上。优选地，AFLP标记物与含有Lem-08-syl的基因座之间的连锁是紧密连锁，即优选地少于约6cM，更优选地少于或等于5.7cM，更优选地少于5cM，少于或等于4.7cM，最优选地少于4cM。在本发明的一个实施方案中，Lem-08-syl侧翼是两个显性AFLP标记物如E32/M50-M362.0和P34/M48-M283.0，它们分别以距Lem-08-syl约4.7和约5.7cM的距离与Lem-08-syl偶联连锁。
与Lem-08-syl连锁的ALFP标记物可以被用于标记辅助选择(markerassisted selection，MAS)或Lem-08-syl的作图克隆。MAS涉及筛选具有或不具有连锁标记物的植物。特别是筛选其中存在位于所连锁的基因或基因座侧翼的标记物的植物。在育种过程中基于是否具有标记物来选择或淘汰植物。MAS能够显著的加速育种过程和特定基因向另一遗传背景的渐渗，也能减少与基因型x环境相互作用相关的问题。MAS也可以用于在一种植物中联合不同的黑胫病抗性基因座。通过使用如Lem-08-syl AFLP鉴定方案可以从与Lem-08-syl连锁的ALFP标记物的存在或缺失，推断Lem-08-syl的存在或缺失。例如，来自以保藏号PTA-5410保藏于ATCC的种子的植物可与其它欧洲油菜植物杂交，然后筛选具有一个或多个与Lem-08-syl连锁的ALFP标记物的杂交后代。可以使用例如紧密连锁的AFLP标记物(如(但不限于)E32/M50-M362.0和/或P34/M48-M283.0)实施AFLP分析。与Lem-10-syl连锁的标记物可以被用于在一个植物系中组合Lem-08-syl和Lem-10-syl，并用于开发含有来自芜青的两个抗性基因座的新品种。
育种方法(如杂交、自交、回交)是本领域所熟知的[见Allard RW(1960)Principles of Plant Breeding.John Wiley&Sons，New York，和Fehr WR(1987)Principles of Cultivar Development，Volume 1，Theory andTechniques，Collier Macmillan Publishers，London.ISBN 0-02-949920-8]。既可以仅使用传统的育种方法，也可以与MAS联用将Lem-08-syl转移进其它品系或品种。在传统的育种方法中，在田间或受控环境试验中评估黑胫病抗性表型，以选择或淘汰含有或缺乏Lem-08-syl的植物。可以使用不同的杂交将Lem-08-syl转移进欧洲油菜系或品种或芥菜系或品种。可以通过欧洲油菜与芥菜的种间杂交将Lem-08-syl转移进芥菜的A基因组[Roy(1984)，Euphytica 295-303]。育种程序可以包括杂交产生F1(第一子代)，随后是若干代的自交(产生F2、F3等等)。育种程序也可以包括回交(BC)步骤，其中后代与亲本系之一(称为回归亲本)回交。育种者筛选农艺上重要的性状，如高产量、高油含量、油分布图(oil profile)、开花时间、植株高度、疾病抗性、抗落荚等等，并由此发展原种品系(具有良好农艺性状的系)。此外，培育植物以符合质量标准，如“canola”质量(脱油的粉中芥子油苷水平低于30μmol/g，油中芥子酸的含量少于2％重量，如见US 6,303,849B1中的芥菜canola质量)。
在本发明另一实施方案中，来自芜青(特别是来自芜青染色体8)的黑胫病抗性基因，优选是Lem-08-syl被转移入其它芸苔属品系或品种中，这是通过用来自本发明植物(优选的是来自以保藏号PTA-5410保藏于ATCC的植物)的Lem-08-syl基因转化这些系或品种来实现的。
“Lem-08-syl AFLP鉴定方案”是指从叶组织或种子之类的植物组织抽提DNA，进行一个或多个连锁的AFLP标记物的AFLP分析。Lem-08-sylAFLP鉴定方案可以在来自个体植物的DNA或来自植物集群(或库)的DNA上进行。在一个实施方案中，提供了检测欧洲油菜或芥菜DNA中Lem-08-syl存在的试剂盒。此试剂盒至少含有一对能够扩增与Lem-08-syl连锁的DNA标记物的PCR引物。试剂盒可以含有一个或多个以下引物对E32/M50、P34/M48、P31/M59、E32/M48、E31/M61或E36/M51，它们分别能够扩增约362bp、283bp、97bp、162bp、237bp或171bp的DNA片段。特别是，试剂盒包括E32/M50和/或P34/M48。试剂盒可以进一步包括能够被用作阳性或阴性对照的样品和用于AFLP分析的其它试剂，见实施例1的描述。样品可以是组织样品或DNA样品。例如，作为阳性对照可以包括以保藏号PTA-5410保藏于ATCC的种子或源自其的种子。作为阴性对照可以包括栽培品种Kristina或Stellar的种子。
在本发明一个实施方案中，提供含有Lem-08-syl的杂种欧洲油菜植物和种子。通过两近交亲本系的杂交获得杂种种子，其中一个近交亲本系在N08染色体上含有Lem-08-syl。为了产生纯杂种种子，有一个亲本系是雄性不育的，用另一亲本系的花粉授粉。通过成行种植亲本系，并仅收获雄性不育亲本的F1种子，从而产生纯杂种种子。为了产生雄性不育亲本系，可以使用EP 0,344,029或US 6,509,516中描述的系统，其中编码植物毒性蛋白(芽孢杆菌RNA酶)的基因在绒毡层特异性启动子(如TA29)的控制之下表达，从而确保选择性破坏绒毡层细胞。用嵌合基因pTA29芽孢杆菌RNA酶转化植物导致植物的花粉形成被完全阻止[Mariani等人(1990)，Nature 347737-741]。De Block和De Brouwer描述了对含有嵌合pA29芽孢杆菌RNA酶基因的欧洲油菜植物的花药发育的细胞化学和组织化学分析[(1993)，Planta 189218-225]。为了恢复雄性不育植物后代的育性，雄性不育植物(MS亲本)与带有育性恢复基因的转基因植物(RF亲本)杂交，该育性恢复基因表达后能够抑制或阻止雄性不育基因的活性[U.S.Pat.Nos.5,689,041；5,792,929；De Block和De Brouwer，前引文]。WO96/26283描述了使用共调节基因产生雄性不育植物，可以提高具有良好农艺性状的转化体的频率。通常，当不育DNA编码芽孢杆菌RNA酶时，共调节DNA将编码芽孢杆菌RNA酶抑制剂，优选使用如出版的PCT专利申请WO98/10081中所述的优化的芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因。应理解的是，不同的启动子可以被用于驱动芽孢杆菌RNA酶表达，以引起植物雄性不育。同样，芽孢杆菌RNA酶抑制剂可以与不同的启动子可操作性连接，如来自花椰菜花叶病毒的35S。
雄性不育植物也可以用其它技术产生，如胞质雄性不育/恢复系系统[如Ogura系统、出版的US专利申请20020032916、US 6,229,072、WO97/02737、US 5,789,566或US 6,365,798的Polima系统、WO98/54340或WO95/09910的Kosena系统、US 5,644,066]。
MS亲本或RF亲本或两者都可以在N08染色体上含有Lem-08-syl。这可以通过使用已知方法，将Lem-08-syl渐渗入原种欧洲油菜系，然后用pTA29-芽孢杆菌RNA酶或用pNOS-芽孢杆菌RNA酶抑制剂转化这一系来完成。另选的是，可以通过含有Lem-08-syl的植物与MS亲本或RF-亲本杂交，而将Lem-08-syl直接渗入转基因MS或RF亲本系。由此，产生自MS和RF亲本杂交的F1杂种种子将含有Lem-08-syl。
转基因植物可以额外的含有赋予除草剂抗性的内源基因或转基因，如赋予草铵膦(Liberty或Basta)抗性的bar或pat基因[EP 0 242 236和EP 0 242 246，作为参考文献引入]；或任何修饰的EPSPS基因，如来自玉米的2mEPSPS基因[EP 0 508 909和EP 0 507 698，作为参考文献引入]，它们赋予草甘膦(RoundupReady)抗性。
在另一的实施方案中，本发明提供在单一植物系或品种，特别是在杂种种子和杂种植物中堆叠(或累积)黑胫病抗性基因座的方法。虽然植物能展现的黑胫病抗性具有最大水平(完全或接近完全抵抗)，堆积黑胫病抗性基因座仍然是有利的。首先，不同的抗性基因座可能具有不同的作用模式。这具有使病原体群体较不可能克服抗性或至少较不可能在短期内克服抗性的效果。虽然(如通过突变或遗传重组)可能进化出能克服一种作用模式的病原体分离株，但是不太可能发展出能克服若干作用模式的单一分离株。此外，不同的抗性基因座可能在植物发育不同阶段提供抗性。例如，一个基因座可能在子叶阶段赋予抗性，另一个基因座针对成熟的叶子，再一基因座针对茎感染。在含有堆积的抗性基因座的植物中，黑胫病抗性的持久性被增加，这意味着如果植物在许多地点被大面积种植，抗性将不会衰退(或抗性的衰退会显著晚于只含有一个主效抗性基因座的植物)。本发明提供将如(但不限于)Lem-10-syl(位于染色体N10上，A-基因组)、Lem-07(位于染色体N07上，A-基因组)、Lem-14(位于染色体N14上，C-基因组)之类的额外黑胫病抗性基因座与染色体N08上的黑胫病抗性基因Lem-08-syl堆叠在一起的方法和手段。特别提供了含有至少两个来自野生型芜青种质的黑胫病抗性基因(如Lem-08-syl和Lem-10-syl)的植物。
为了在单一的植物系或品种或在杂种种子和杂种植物中堆叠抗性基因座，可以通过一般的杂交和选择方法将基因座组合起来。
除非在实施例中另有说明，所有的重组DNA技术根据Sambrook和Russell(2001)Molecular CloningA Laboratory Manual，Third Edition。Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，和Ausubel等人(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA的卷1和卷2，和Brown(1998)Molecular Biology LabFax，Second Edition，Academic Press(UK)中卷I和卷II的标准方案进行。用于植物分子工作的标准材料和方法被R.D.D.Croy描述于Plant Molecular Biology LabFax(1993)，由BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publication，UK联合出版。用于聚合酶链式反应的标准材料和方法可见于Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR PrimerA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press和McPherson等人(2000)PCR-BasicsFrom Backgroundto Bench，First Edition，Springer Verlag，Germany。标准的AFLP分析方法描述于Vos等人(1995，NAR 234407-4414)和出版的EP专利申请EP534858。
应当明白的是前文仅仅是本发明特定实施方案的详细描述，在不背离本发明精神和范围的情况下，可以根据这里所公开的内容对公开的实施方案进行许多改变。不管是先前的描述还是以下的实施例，都不意味着对本发明范围的限制。本发明的范围只被附带的权利要求和它们的等同方案所决定。
以下是所附序列表中的序列，在本发明的一般描述或实施例中有所涉及SEQ ID NO1Msel-衔接子序列5’-3’SEQ ID NO2Msel-衔接子序列3’-5’SEQ ID NO3EcoRI-衔接子序列5’-3’SEQ ID NO4EcoRI-衔接子序列3’-5’SEQ ID NO5PstI-衔接子序列5’-3’SEQ ID NO6PstI-衔接子序列3’-5’SEQ ID NO7AFLP引物E01SEQ ID NO8AFLP引物M01SEQ ID NO9AFLP引物M02
SEQ ID NO10AFLP引物P01SEQ ID NO11AFLP引物E31SEQ ID NO12AFLP引物E32SEQ ID NO13AFLP引物E36SEQ ID NO14AFLP引物M48SEQ ID NO15AFLP引物M50SEQ ID NO16AFLP引物M51SEQ ID NO17AFLP引物M59SEQ ID NO18AFLP引物M61SEQ ID NO19AFLP引物P31SEQ ID NO20AFLP引物P34实施例实施例1通过AFLP分析对Lem-08-syl作图BC3和DH作图群体的产生Kristina是易于感染黑胫病(blackleg)的春油料种子油菜(springoilseed rape，SOSR)品种。RFM292是人工欧洲油菜(B.napus)系。RFM292如Crouch等人所描述(1994)的由来自Sicily的野生型B.rapa ssp sylvestris(#75)[Crouch等人(1994)]与来自Tunisia的野生型B.atlantica(#25)[Mithen和Magrath(1992)]杂交、拯救胚和用秋水仙素处理使染色体加倍而产生。Kristina与RFM292杂交。来自这一杂交的F1植物再与Kristina回交，产生BC1种群，该种群自交产生BC1S1植物。在田间试验中测试BC1S1植物的抗性，选择抗性系进一步自交，产生BC1S3植物。为了选择用于自交的植物，测试它们对各种黑胫病分离株(加拿大、澳大利亚、英国分离株)的抗性。然后抗性BC1S3系与Kristina回交两次产生BC2和BC3种群。300株BC3植物在生长室试验中被测试黑胫病抗性。通过如下描述的AFLP集群分离子分析(Bulk Segregant Analysis，BSA)[Michelmore等人PNAS 889828-9832]分析抗性BC3植物库和敏感BC3植物库，以鉴定与黑胫病抗性连锁的AFLP标记物。此外，如下描述的，对300株BC3植物进行AFLP分析以对黑胫病抗性作图。
进一步的，通过小孢子培养[Mollers等人(1994)，Euphytica 7595-104]获得来自Kristina与BC1S3杂交的F1(BC2个体)的加倍单倍体(DH)种群。DH种群被用于验证多表型分型(multiple phenotyping)、得自BC3分析的作图结果以及AFLP标记物与黑胫病抗性基因Lem-08-syl的连锁。
扩增片段长度多态性(AFLP)分析DNA提取使用经修正的CTAB方案从亲本系、对照系、BC3植物和DH植物提取DNA。每样品取10个叶圆盘(直径0.8cm)，用液氮冷冻，用研钵和杵将其离析并转移到Eppendorf管。向每样品加入1ml CTAB缓冲液(100ml＝10ml 1M Tris-HCl pH7.5，28ml 5M NaCl，4ml 0.5M EDTA，1g CTAB，水)，Eppendorf管在65℃被孵育90分钟，并在孵育的过程中颠倒数次。短暂离心后加入500μl氯仿/异戊醇(24/1)，样品被匀浆5分钟。然后以7000rpm离心Eppendorf管10分钟，将上清转移到干净的Eppendorf管。通过加入1ml异丙醇，并在13000rpm离心10分钟沉淀DNA。用500μl洗涤液(76％EtOH、0.2M NaOAc)洗涤沉淀20分钟，然后是第二次洗涤(76％EtOH，0.01M NH4Oac)10分钟。将沉淀风干并溶解于100μl TE(1M Tris-HCl pH8，5M EDTA)。(CTAB＝溴化十六烷基三甲基铵)AFLP分析AFLP分析改编自Vos等人(1995)。使用限制酶MseI和EcoRI或用MseI和PstI限制性处理基因组DNA，将衔接子(adapter)(Proligo)与限制性处理的片段连接(衔接子序列被描述于Vos等人(1995)，EP0534858和US 6,045,994)。
衔接子序列MseI-衔接子5’GACGATGAGTCCTGAG3’ (SEQ ID NO1)3’TACTCAGGACTCAT 5’ (SEQ ID NO2)EcoRI-衔接子5’CTCGTAGACTGCGTACC 3’ (SEQ ID NO3)3’CTGACGCATGGTTAA 5’ (SEQ ID NO4)PstI-衔接子5’CTCGTAGACTGCGTACATGCA 3’ (SEQ ID NO5)3’CATCTGACGCATGT 5’ (SEQ ID NO6)通过向DNA样品(30μl体积)中加入10μl限制性消化混合物(5UEcoRI、5U MseI、4μl OPA-缓冲液，用水补到10μl体积)和10μl衔接子连接混合物(50pMole MseI衔接子、50pMole EcoRI衔接子、1μl 10mMATP、1μl OPA-缓冲液、5U T4连接酶，用水补到10μl体积)，然后在37℃孵育4小时，在微滴定平板上在单反应中完成限制性消化和衔接子连接。用TE 0.1(10mM Tris-HCl pH8，0.1mM EDTA)将样品稀释10倍。
AFLP引物序列对应于Vos等人(1995)、EP 0534858和US 6,045,994(Proligo)。使用Hybaid Omnigene PCR循环仪[循环194℃中30秒(变性)、65℃中30秒(退火)、72℃中60秒(延伸)；循环2-13每循环的退火温度降低0.7℃；循环14-3694℃中30秒、56℃中30秒、72℃中60秒]，在微滴定平板(Biozyme)中利用+1引物(具有1碱基的选择性延伸(extension))进行预扩增。预扩增混合物由5μl 10倍稀释的DNA模板、25μl引物/dNTP混合物(10x＝750ngμl的每种引物、20μl 5mMdNTPs、200μl水)，20μl Taq聚合酶/缓冲液混合物(10x＝50μl 10×PCR缓冲液、2μl Taq聚合酶(5U/μl)、148μl水)组成，并被覆盖50μl矿物油。对于选择性的限制性片段扩增(使用预扩增的DNA作为模板)，使用了+3引物(具有3个碱基的选择性延伸)。
+1引物5’-GAC TGC GTA CCA ATT C|A-3’ E01(SEQ ID NO7)5’-GAT GAG TCC TGA GTA A|A-3’ M01(SEQ ID NO8)5’-GAT GAG TCC TGA GTA A|C-3’ M02(SEQ ID NO9)5’-GAC TGC GTA CAT GCA G|A-3’ P01(SEQ ID NO10)+3引物5’-GAC TGC GTA CCA ATT C|AA A-3’E31(SEQ ID NO11)5’-GAC TGC GTA CCA ATT C|AA C-3’E32(SEQ ID NO12)5’-GAC TGC GTA CCA ATT C|AC C-3’E36(SEQ ID NO13)5’-GAT GAG TCC TGA GTA A|CA C-3’M48(SEQ ID NO14)5’-GAT GAG TCC TGA GTA A|CA T-3’M50(SEQ ID NO15)5’-GAT GAG TCC TGA GTA A|CC A-3’M51(SEQ ID NO16)5’-GAT GAG TCC TGA GTA A|CT A-3’M59(SEQ ID NO17)5’-GAT GAG TCC TGA GTA A|CT G-3’M61(SEQ ID NO18)5’-GAC TGC GTA CAT GCA G|AA A-3’P31(SEQ ID NO19)5’-GAC TGC GTA CAT GCA G|AA T-3’P34(SEQ ID NO20)用γ33P-ATP标记EcoRI或PstI引物。反应混合物由5μl模板DNA(10x稀释的预扩增产物)、5μl引物/dNTP混合物(10x＝50ng标记的引物、300ng未标记引物、8μl 5mM dNTP，用水补到50μl)、10μl Taq聚合酶/缓冲液混合物(10x＝20μl 10×PCR缓冲液、0.8μl Taq聚合酶、水补到100μl)以及20μl矿物油组成。10×PCR缓冲液由100mM Tris pH8.3、15mMMgCl2、500mM KCl组成。PCR循环与用于预扩增的一样。
在4.5％的变性聚丙烯酰胺凝胶(2.5h、110W)上分离PCR产物，同时使用10-bp DNA梯度的序列标记(sequamark)。干燥的胶被暴光过夜(Fujifilm，BAS-MS 2040 screens)并在Fuji BAS-2500扫描仪上扫描。使用AFLP-Quantar PRO软件(KeyGene)分析数字凝胶图像。
记录多态性条带(标记物)，并且基于与用来产生多态性条带的特异+3引物组合来对AFLP标记物命名，其后是多态性条带的近似分子量(通过与10bp梯度的比较而估计)。例如，E32/M50-M362.0是指大小约为362碱基对、通过使用引物对E32和M50进行的选择性限制片段扩增而产生的条带。单态性标记物(即存在于所有植物中的具有确定大小的条带)不予记录。
在生长室实验中BC3植物的表型分型(phenotyping)300株BC3植物在生长室试验中被测试黑胫病抗性。实验中还包括一些对照系，如栽培品种Kristina、Stellar、Surpass400和RFM292系(每系约40-50株植物)。
单孢子L.maculans(黑胫茎点霉)分离株Leroy1被用于疾病抗性实验。Leroy1是一种加拿大分离株。此真菌分离株在25℃，黑暗中于V8琼脂平板(1升＝800ml水、200ml V8液、0.75g CaCO3、15g Difco琼脂、40mgRose Bengal和用于阻止细菌生长的100mg/l链霉素硫酸盐)上生长1-2周，随后在20℃于紫外光(14/10小时光/黑暗)下生长1-2周。用5ml无菌蒸馏水覆盖平板，并用无菌玻璃棒释放(losening)孢子，从而收集器孢子。孢子经尼龙网(45μm)过滤，在3500rpm下离心10分钟，再悬浮于无菌蒸馏水。使用血球计测量孢子浓度，并且用无菌蒸馏水调节到107孢子/ml。孢子悬浮液被储存于-20℃。
欧洲油菜植物的种子被表面灭菌，并播种于多罐盘中的标准土壤中，3周后再转移到直径为10厘米的罐中。植物在18-20℃(day)、14h/10h(光/暗)、70％相对湿度的条件下于生长室生长约2.5周，直到3片真叶出现。通过用针损伤最老的叶子接近茎的叶柄(约0.5cm的两个伤口)，和用针在接近叶轴的茎上施加小且浅的一刺，而进行接种。10μl孢子悬浮液(107孢子/ml)被施用于损伤的茎。生长室的湿度持续3天保持100％rh。
9周后评估茎的症状。外部和内部的症状都被评分。外部症状的评分是通过测量围绕损伤(circumventing lesion)(环绕(girdling))(A)来进行的。内部症状的评分是通过用剪刀(水平方向)剪断茎的基部，评定表现出疾病症状的茎直径的百分数(B)，和通过测量内部损伤的长度(沿纵轴切开茎)(C)来进行的。所有关于茎的评分都是按照0(没有症状)到5(最严重的症状，如完全环绕)的等级进行的。总体疾病分值被计算如下总茎分值＝1×A+2×B+2×C。总茎分值从0到25变化。敏感型对照(如Kristina)始终具有25的分值。
植物表现出不同的表型，并且可以根据总茎分值以12.5为临界值被分为不同的类型。有147株植物对黑胫病是抗性(R)的，140株是敏感的(S)。因此，基于茎的抗性和敏感性以1∶1的比例(Chi2＝0.17)分离，这表明单一的显性黑胫病抗性基因在BC3种群中发生分离，此基因被命名为“Lem-08-syl”。
集群分离子分析(BSA)为了鉴定与Lem-08-syl连锁的AFLP标记物，根据Michelmore等人[(1991)，PNAS 889828-9823]的描述进行BSA。在以上生长室实验中所测试的300株BC3植物的表型数据被用于选择用于BSA的最具抗性和最具敏感性的株系。产生了四个(每库5个个体)抗性个体库和六个(每库5个个体)敏感性个体库。通过集合等量的预扩增产物而产生DNA库。然后通过使用47个(+3)AFLP引物组合的AFLP分析测试DNA库。
评价只在抗性库中存在，而在(多数)敏感库中不存在的多态性AFLP片段(标记物)。仅对以偶联(coupling)的方式(即来自供体亲本)与抗性连锁的AFLP标记物进行记录。对与敏感性(即排斥方式，来自回归亲本)连锁的标记物不予记录。发现有41个AFLP标记物在抗性和敏感性库之间存在(部分)差别。选取了12个最佳的AFLP标记物(基于型式(pattern)的质量和在抗性和敏感性库之间区别的最佳能力)来首先筛选BC3群体的以上集群中的43株植物个体(20株抗性和23株敏感性个体)，以便分析标记物的连锁。
使用12个AFLP标记物和表型标记物(Lem-08-syl)，并使用JoinMapVersion 3.0[Van Ooijen和Vorrip，(2001)，JoinMap Version 3.0，遗传连锁图谱计算软件，Plant Research International，Wageningen，TheNetherlands]进行连锁分析。使用JoinMap Version 3.0的默认参数，并使用Kosambi算法[Kosambi(1994)，Ann.Eugenet.12172-175]计算连锁群中的标记物之间的成对重组频率。也使用JoinMap Version 3.0的默认设置计算了相对标记物次序和标记物之间的距离。
连锁分析将4个显性AFLP标记物和Lem-08-syl分类在一个连锁群上。另外7个AFLP标记物被分类于另一个隔离的组中，没有被进一步考虑。存在于抗性植物库而不存在于敏感植物库的这四个连锁的AFLP标记物是E32/M50-M362.0*、E32/M48-M162.7、E31/M61-M237.6和E36/M51-M171.1*。其中有两个标记物(标有*)是芜青(B.rapa)特异的标记物，意味着在栽培作物欧洲油菜的相应位置没有发现条带，而该标记物则存在于二倍体芜青物种。这表明Lem-08-syl是从野生型芜青种质渐渗的。此两标记物定位于内部(in-house)芜青染色体R08图谱上。因为R08相应于欧洲油菜中的N08，所以该欧洲油菜连锁群被命名为N08[根据Sharpe等人(1995)，Genome 381112-1121]。
Lem-08-syl因此在欧洲油菜的图谱上被作图于染色体8(N08)末端，如下所示N08基于 43株BC3植物259株BC3植物E32/M50-M362.0*0.0 0.0Lem-08-syl4.7 6.6E32/M48-M162.710.8 14.4E31/M61-M237.613.2 19.1E36/M51-M171.1*15.5 23.2*芜青特异的AFLP标记物基因座之间的遗传距离以厘摩(cM)表示。
芜青特异的AFLP标记物E32/M50-M362.0和E36/M51-M171.1位于Lem-08-syl侧翼，确认了Lem-08-syl定位于从B.rapa ssp sylvestris渐渗的DNA片段上。
实施例2更紧密连锁的AFLP标记物的产生为了产生与Lem-08-syl更为紧密连锁的AFLP标记物，对BC3植物的附加库(addition pools)进行BSA分析(如上描述)。使用+3 PstI/MseIAFLP引物组合产生并筛选新的抗性和敏感库。鉴定了两个额外的与Lem-08-syl连锁的标记物P34/M48-M283.0和P31/M59-M97.1。P34/M48-M283.0还未在芜青中作图，但是发现其存在于芜青中而不存在于欧洲油菜中，因此提供了另一芜青特异的标记物。
实施例3使用259株BC3植物个体制作连锁图谱使用如上鉴定的6个AFLP引物组合(即E32/M50、P34/M48、P31/M59、E32/M48、E31/M61和E36/M51)对300株BC3植物中的259株进行AFLP分析。利用生长室实验中所测试的300株BC3植物的表型数据(如上描述)和这些AFLP数据，使用JoinMap V3.0进行连锁分析。
产生了以下遗传图谱N08E32/M47-M178.40.0E32/M50-M362.07.5Lem-08-syl12.2P34/M48-M283.017.9P31/M59-M97.1 19.3E32/M48-M162.721.4E31/M61-M237.626.0E36/M51-M171.129.3两个已作图的芜青特异的AFLP标记物位于一个约21cM的区域的两侧，其在内部芜青图谱上被确认。
使用同样的AFLP数据和300株BC3植物的总体黑胫病分值(定量分值)还进行了QTL作图(区间作图(interval mapping))。鉴定的QTL峰与Lem-08-syl在遗传图谱上的位置对应，并且解释了77.8％的黑胫病抗性变化(LOD值为68.12，LOD阈值为3.0)(见


图1)。
总之，鉴定了6个与Lem-08-syl连锁的AFLP标记物。最紧密连锁的AFLP标记物是E32/M50-M362.0和P34/M48-M283.0。
实施例4在DH作图群体中确证连锁的AFLP标记物为了确证在AFLP标记物E32/M50-M362.0和P34/M48-M283.0的存在(或缺乏)与Lem-08-syl抗性的存在(或缺乏)之间具有完全相关(perfectcorrelation)，于2001年在加拿大和澳大利亚的田间试验中分析了DH系(描述于实施例1)的黑胫病抗性。
DH系也被筛选AFLP标记物E32/M50-M362.0和P34/M48-M283.0的存在。从每个DH系的两个叶盘提取DNA，使用E32/M50和P34/M48引物组合进行AFLP分析(如上描述)。对于PC(引物组合)E32/M50和PC P34/M48分别出现约362bp或283bp的条带被记录为正号(+)。使用了来自欧洲油菜栽培品种Kristina和Stellar的DNA作为阴性对照。同时，已知不含有Lem-08-syl的BC1S3系(34B)也被包含作为阴性对照。阳性对照包含已知含有Lem-08-syl的BC1S3-45B系。根据AFLP分析，对植物系是否含有Lem-08-syl，以及是否抵抗黑胫病感染进行了预测。预测被以下田间试验所确证。
AFLP分析结果


R＝黑胫病抗性，S＝黑胫病易感性，1＝基于标记物的存在/缺乏含有两个侧翼AFLP标记物的DH系被预测含有Lem-08-syl，因此也被预测具有黑胫病抗性。为了测试这些DH系的黑胫病抗性，进行了田间试验。
在加拿大的田间试验在加拿大，DH系的种子以单行形式播种并作两个重复。计算两个重复的平均黑胫病分值，并示于下表。同时包括如Kristina、Stellar、Westar、Quantum、Dunkeld和/或Oscar之类的对照系。在成熟时以1到9的等级(采纳自NIAB)评估每行的黑胫病抗性。
黑胫病分值1＝大部分植物死亡2-3＝有显著比例的植物已死亡或将死4-6＝大部分植物在茎的基部发生溃疡，但是少有植物死亡7-8＝在茎的基部有少量溃疡，少有或没有植物死亡9＝没有外部的茎溃疡症状，没有植物死亡


R＝黑胫病抗性，S＝黑胫病敏感性，(1)＝基于标记物的存在/缺失如上表所示，根据Lem-08-syl两侧AFLP标记物的存在所预测的黑胫病抗性表型被加拿大田间试验所确证。
在澳大利亚的田间试验选择的DH系和各种对照系的种子被播种于澳大利亚的两个地点。两个地点都在商业Canola作物的茬地中进行播种，以提供高水平的疾病压力。
在两个地点，以3米的单行形式播种，进行两个重复。在每一地点，黑胫病感染被评估两次，一次在开花时，一次在成熟时。以1到9的等级，对每一行的抗性进行视觉评估。计算两个重复的平均值。
黑胫病分值1＝大部分植物死亡2-3＝有显著比例的植物已死亡或将死4-6＝大部分植物在茎的基部发生溃疡，但是少有植物死亡7-8＝在茎的基部有少量溃疡，少有或没有植物死亡9＝没有外部的茎溃疡症状，没有植物死亡如下表所示，含有连锁的AFLP标记物并被预测具有黑胫病抗性的DH系在田间在开花时也被观测到了对黑胫病感染的抗性。一个例外是DH系77-3-6，它具有统计学不显著的高于平均值的抗性，被归为“中间体”。


S＝易感性，R＝抗性，I＝中间体，1＝基于连锁AFLP标记物的存在/缺乏*＝显著低于平均值的抗性***＝显著高于平均值的抗性如下表所示，所有含有连锁的AFLP标记物并被预测具有黑胫病抗性的株系在田间成熟时期也能抵抗黑胫病感染(DH系77-3-6再次成为例外)，虽然抗性水平在成熟时(即接近生长季节结束时)低于开花时期(星号的意义如上)。


总之，田间试验的数据表明只要DNA中存在位于Lem-08-syl侧翼的这两个AFLP标记物，植物就能抵抗黑胫病感染。数据因此确证AFLP标记物与Lem-08-syl连锁，并且它们可以被用于预测植物表型。
在基因组中含有Lem-08-syl和连锁的AFLP标记物(包括芜青特异的标记物)的DH系77-3-12的种子在2003年8月22日由Bayer BioScienceN.V.以保藏号PTA-5410保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801University Blvd，Manassas，VA 20110-2209，USA)(种子的存活于2003年8月29日被确认)。
实施例5“Lem-08-syl AFLP鉴定方案”表明在商业可获得的欧洲油菜栽培作物中缺乏Lem-08-syl使用与Lem-08-syl连锁的标记物的AFLP分析(如实施例1所描述的)在下文称为“Lem-08-syl AFLP鉴定方案”。在本发明一个实施方案中，使用如(但不限于)E32/M50-M362.0或E36/M51-M171.1之类的芜青特异的AFLP标记物和/或连锁的欧洲油菜标记物(例如P34/M48-M283.0)实施Lem-08-syl AFLP鉴定方案。
为了确证在一系列可获得的欧洲油菜栽培作物中缺乏Lem-08-syl，使用引物组合(PC)E32/M50、PC E36/M51和PC P34/M48进行Lem-08-sylAFLP鉴定方案(见实施例1的描述)。
此方案对于合并的植物组的结果为

注释正号(+)＝出现预期大小的片段(条带)负号(-)＝没有出现预期大小的片段(条带)
ND未做POOL1Tapidor+Doubol+MohicanPOOL2Columbus+Aglona+ApachePOOL3Falcon+Silex+KanaPOOL4Express+Apex+BristolPOOL5Vivol+Polo(W)+OrientPOOL6Mandarin+Sh7+Wuhac96.40006POOL7Wuh5365+NAN93-1046+LE043-3POOL8Yu-dal+Wuhan96.40005+Sh97.1020POOL9Monty+Narendra+DrakkarPOOL10Kristina+SpokPOOL11Acrobat+Cyclone+Stellar此外，还使用AFLP标记物E32/M50-M362.0、P34/M48-M283、E36/M51-M171.1对以下品种Surpass400、Hyola60、Hyola50、Apex、Excel、Maluka、Quantum进行AFLP分析，确证了在其它植物品种中缺乏Lem-08-syl。在这一分析中，阳性对照品种(包括上述含有Lem-08-syl的DH系)如预期的表现出此抗性基因的存在。
以上结果表明商业冬油料种子油菜(WOSR)栽培品种和春油料种子油菜(SOSR)栽培品种(如Surpass400、Hyola60、Hyola50等等)不含有芜青特异的AFLP标记物E32/M50-M362.0和E36/M51-M171.1，这确证了这些栽培品种缺乏芜青染色体8上的包含Lem-08-syl的特异DNA片段。
实施例6绘制Surpass400黑胫病抗性基因座的图谱为了对存在于Surpass400中的抗性基因座作图，通过黑胫病感染易感性加拿大欧洲油菜品系与Surpass400(Pacific Seeds(Advanta)的商业黑胫病抗性栽培品种)的杂交产生了一个DH群体。Surpass400的黑胫病抗性明显来自B.rapa ssp sylvestris与B.Oleracea ssp alboglabra的杂交[Li等人(2001，前引文)]。此DH群体的抗性于2002年在澳大利亚的田间试验中被评估。开展AFLP分析以对黑胫病抗性作图。
通过QTL分析可以绘制出3个抗性基因座的图谱-一个主效基因座，定位于染色体N10上(A基因组)，这里称为Lem-10-syl，-一个基因座，定位于染色体N07上(A基因组)，这里称为Lem-07，-一个基因座，定位于染色体N14上(C基因组)，这里称为Lem-14。
在染色体N08上没有发现抗性基因座。这些数据确证了Lem-08-syl并不存在于Surpass400中，虽然根据出版的信息，Surpass400也明显含有来自野生型B.rapa ssp sylvestris的黑胫病抗性。
在所有3个基因座具有来自Surpass400亲本的抗性等位基因的植物具有7-8的黑胫病抗性分值(基于以上描述的1-9的等级)，因此是抗性的。在所有3个基因座具有加拿大亲本的等位基因的植物具有3-4的黑胫病抗性分值，因此是易感的。
有可能黑胫病抗性基因座Lem-10-syl来自B.rapa ssp sylvestris(这将证实Rimmer等人的数据)，而Lem-07和Lem-14更可能来自欧洲油菜。有趣的是，没有在染色体N02上发现抗性基因座，虽然Yu等人[Plant，Animal&Microbe Genomes Jan 12-16，2002，Poster 460]描述了在染色体N02上存在来自芜青的黑胫病抗性基因座。
实施例7Lem-08-syl与其它黑胫病抗性基因座的累积为了产生具有强烈和持久的黑胫病抗性的植物，不同的抗性基因座和抗性等位基因被组合于单个植株中(称作抗性的堆叠(stack)或累积(pyramid))。在这一实施例中，Lem-08-syl与存在于Surpass400的抗性基因座(即Lem-10-syl、Lem-07和Lem-14)组合。
(a)开发含有Lem-08-syl抗性和Surpass400抗性的种群若干Surpass400植物被人工去雄，并与来自F2种群99-AN13的4-5株植物的花粉杂交。该99-AN13种群是具有Lem-08-syl的分离种群(segregating population)。
(b)种群的进一步发展少量的F1植物于2001年于高疾病压力下生长。两株表现出抗性表型的植物被自交和选择。进一步的，F2和F3植物被自交，进行单植株选择。只选取表现出抗性表型的植物。
为了确定观测到的田间抗性是否是由于Lem-08-syl与一个或多个Surpass400抗性基因座的联合存在所致，用与不同基因座连锁的分子标记物(即例如与Lem-08-syl连锁的标记物和与Lem-10-syl连锁的标记物)筛选植物。选择含有期望的抗性基因座组合的各单植株，而其它植物则被抛弃。
实施例8杂种种子生产方法以不同方式开发含有堆叠的黑胫病抗性的杂种欧洲油菜种子。
方案1抗性基因座在杂种种子中堆叠开发雄性不育(MS)雌性亲本，该亲本具有整合进其基因组的处于绒毡层特异启动子pTA29控制下的芽孢杆菌RNA酶基因，并进一步在染色体N08上含有Lem-08-syl。为了开发这一雌性亲本，用含有可操作地连接于芽孢杆菌RNA酶基因的pTA29的嵌合基因转化含有Lem-08-syl的植物，或者含有可操作地连接于芽孢杆菌RNA酶基因的pTA29的雄性不育转基因植物与含有Lem-08-syl的植物杂交。
开发雄性亲本(RF)，在其基因组中含有pTA29-芽孢杆菌RNA酶抑制剂，以及Lem-10-syl和/或其它黑胫病抗性基因座。
为了开发杂种种子，将MS亲本与RF亲本杂交，从雌性亲本中收获杂种种子。从这些种子生长起来的植物具有完全的育性，并在其基因组中含有Lem-08-syl和/或其它抗性基因座。
方案2在雌性亲本(MS)中堆叠抗性基因座开发雄性不育(MS)的雌性亲本，该亲本具有整合进其基因组的处于绒毡层特异启动子pTA29控制下的芽孢杆菌RNA酶基因，并进一步在其基因组中含有几个黑胫病抗性基因座，如位于染色体N08的Lem-08-syl、位于染色体10的Lem-10-syl和/或其它基因座。为了开发这一雌性亲本，用含有可操作连接于芽孢杆菌RNA酶基因的pTA29的嵌合基因转化含有几个黑胫病抗性基因座的植物，或者含有可操作连接于芽孢杆菌RNA酶基因的pTA29的雄性不育转基因植物与在其基因组中含有几个黑胫病抗性基因座的植物杂交。
开发在其基因组中含有pTA29-芽孢杆菌RNA酶抑制剂的雄性亲本(RF)。
为了开发杂种种子，将MS亲本与RF亲本杂交，从雌性亲本中收获杂种种子。从这些种子生长起来的植物具有完全的育性，并在其基因组中含有Lem-08-syl以及Lem-10-syl或其它抗性基因座。
此外，还开发出另两个方案，这些方案是1)除以下不同点与上述方案1一致的方案，不同点在于Lem-08-syl抗性基因存在于RF植物中，和2)除以下不同点与上述方案2一致的方案，不同点在于Lem-08-syl抗性基因存在于RF植物中。
所有的方案被用于发展纯杂种，所述杂种在它们的基因组中含有若干黑胫病抗性基因座。
相似的，可以发展仅含有Lem-08-syl的杂种种子。
实施例9Lem-08-syl向其它芸苔属原种系的转移通过以下方法将Lem-08-syl转移到其它原种品系。含有Lem-08-syl的植物(供体植物，如来自以保藏号PTA-5410保藏于ATCC的种子的植物)与缺乏Lem-08-syl的原种欧洲油菜系(原种亲本/回归亲本)或品种杂交。使用以下的渐渗方案(Lem-08-syl被缩写为N08)起始杂交 N08/N08(供体植物)×wt/wt(原种亲本)F1植物N08/wtBC1杂交 N08/wt×wt/wt(回归亲本)
BC1植物 50％N08/wt和50％wt/wt使用与Lem-08-syl连锁的AFLP标记物选择此50％的N08/wtBC2杂交 N08/wt(BC1植物)×wt/wt(回归亲本)BC2植物 50％N08/wt和50％wt/wt使用与Lem-08-syl连锁的AFLP标记物选择此50％的N08/wt反复回交直到BC6BC6植物 50％N08/wt和50％wt/wt使用与Lem-08-syl连锁的AFLP标记物选择此50％的N08/wtBC6 S1杂交 N08/wt×N08/wtBC6 S1植物 25％N08/N08和50％N08/wt和25％wt/wt使用与Lem-08-syl连锁的AFLP标记物选择含有N08的植物来自个体BC6 S1植物的后代待测种子被测试Lem-08-syl的分离，以筛选Lem-08-syl纯合的(N08/N08)BC6 S1植物。这些植物之后被用于生产种子。
在上述渐渗方案中，在每一代测试回交材料中与Lem-08-syl连锁的AFLP标记物的存在，并选择含有Lem-08-syl的株系。可以在田间试验中测试植物的黑胫病抗性，并可以选择具有高抗性的植物，以代替用连锁的AFLP标记物测试Lem-08-syl的存在。然而，只有当Lem-08-syl将要渐渗入的原种系未含有高水平的黑胫病抗性时，这才是可行的。例如，如果原种系是具有非常高黑胫病抗性的Surpass400，则需要进行针对Lem-08-syl的标记物辅助的选择(标记物辅助的育种)，因为在田间选择含有期望的抗性基因座组合的材料极其困难。而如果原种亲本是易感系，或至少抗性不如含有Lem-08-syl的株系，则上述方案中的MAS(分子辅助的选择)可以被高黑胫病压力下的田间选择所替代。
序列表<110>拜尔生物科学公司(Bayer BioScience N.V.)<120>对Leptosphaeria maculans(黑胫病)真菌具有抗性的芸苔属植物<130>BCS 03-2006<160>20<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MseI-衔接子序列5′-3′<400>1gacgatgagt cctgag16<210>2<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>MseI-衔接子序列3′-5′<400>2tactcaggac tcat 14<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EcoRI-衔接子序列5′-3′<400>3ctcgtagact gcgtacc 17<210>4<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EcoRI-衔接子序列3′-5′<400>4ctgacgcatg gttaa 15
<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PstI-衔接子序列5′-3′<400>5ctcgtagact gcgtacatgc a 21<210>6<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PstI-衔接子序列3′-5′<400>6catctgacgc atgt 14<210>7<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AFLP引物E01<400>7gactgcgtac caattca17<210>8<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>AFLP引物M02<400>9gatgagtcct gagtaac17
<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AFLP引物P01<400>10gactgcgtac atgcaga 17<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AFLP引物E31<400>11gactgcgtac caattcaaa 19<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AFLP引物E32<400>12gactgcgtac caattcaac 19<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AFLP引物E36<400>13gactgcgtac caattcacc 19<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AFLP引物M48<400>14gatgagtcct gagtaacac 19
<210>15<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AFLP引物M50<400>15gatgagtcct gagtaacat 19<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AFLP引物M51<400>16gatgagtcct gagtaacca 19<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AFLP引物M59<400>17gatgagtcct gagtaacta 19<210>18<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AFLP引物M61<400>18gatgagtcct gagtaactg 19<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AFLP引物P31<400>19gactgcgtac atgcagaaa 19
<210>20<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AFLP引物P34<400>20gactgcgtac atgcagaat19
权利要求
1.在染色体8上含有芜青染色体片段的芥菜植物，其中所述片段包含黑胫病抗性基因。
2.含有芜青染色体R08的片段的芥菜植物，其中所述片段包含黑胫病抗性基因。
3.在染色体8上含有芜青染色体片段的欧洲油菜植物，其中所述片段含有黑胫病抗性基因，并且其中所述欧洲油菜植物选自-含有整合进其基因组的转基因的欧洲油菜植物；-含有所述黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物的后代，其中所述后代来自含有所述黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物与Surpass400植物的杂交；-在干燥、脱脂的种子粉中含有的脂肪族芥子油苷的水平低于30mmol/g的欧洲油菜植物；-其种子的固体成分中3-丁烯基-芥子油苷、4-戊烯基-芥子油苷、3-羟基-3-丁烯基-芥子油苷和2-羟基-4-戊烯基-芥子油苷之任何一种或任何混合物的含量少于30微摩尔/克风干无油固体的欧洲油菜植物；-产生的油(粉碎种子后)中芥子酸的含量少于油中总脂肪酸的2％的欧洲油菜植物；-欧洲油菜春油料种子油菜植物；-欧洲油菜冬油料种子油菜植物；-在N2染色体上不含有黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物；-在N10染色体上不含有黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物；-不含有作图于染色体2和染色体10上的抗性基因的欧洲油菜植物，其中所述抗性基因来自B.rapa ssp sylvestris；-含有能引起植物雄性不育的转基因，优选芽孢杆菌RNA酶基因的欧洲油菜植物；-含有所述黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物的后代，其中所述后代来自含有所述黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物与以下油料种子油菜品种中任一种的杂交除草剂抗性欧洲油菜品种、种子中具有高油含量的欧洲油菜品种、种子中具有高油酸含量的欧洲油菜品种、种子中具有低亚麻酸含量的欧洲油菜品种、Jet Neuf、Quantum、Maluka、Hyola43、Hyola60、Surpass400、Surpass402CL、Surpass603CL、Surpass501TT、RoundupReadyTM植物、LibertyLinkTM植物、含有雄性不育转基因的植物、InVigor40、InVigor70、InVigor90、InVigor2573、InVigor2663、InVigor2733、InVigor5020、InVigor5030或InVigor5070。
4.含有芜青染色体R08的片段的欧洲油菜植物，其中所述片段含有黑胫病抗性基因，并且其中所述欧洲油菜植物选自-含有整合进其基因组的转基因的欧洲油菜植物；-含有所述黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物的后代，其中所述后代来自含有所述黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物与Surpass400植物的杂交；-在干燥、脱脂的种子粉中含有的脂肪族芥子油苷的水平低于30mmol/g的欧洲油菜植物；-其种子的固体成分中3-丁烯基-芥子油苷、4-戊烯基-芥子油苷、3-羟基-3-丁烯基-芥子油苷和2-羟基-4-戊烯基-芥子油苷之任何一种或任何混合物的含量少于30微摩尔/克风干无油固体的欧洲油菜植物；-产生的油(粉碎种子后)中芥子酸的含量少于油中总脂肪酸的2％的欧洲油菜植物；-欧洲油菜春油料种子油菜植物；-欧洲油菜冬油料种子油菜植物；-在N2染色体上不含有黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物；-在N10染色体上不含有黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物；-不含有作图于染色体2和染色体10上的抗性基因的欧洲油菜植物，其中所述抗性基因来自B.rapa ssp sylvestris；-含有能引起植物雄性不育的转基因，优选芽孢杆菌RNA酶基因的欧洲油菜植物；-含有所述黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物的后代，其中所述后代来自含有所述黑胫病抗性基因的欧洲油菜植物与以下油料种子油菜品种中任一种的杂交除草剂抗性欧洲油菜品种、种子中具有高油含量的欧洲油菜品种、种子中具有高油酸含量的欧洲油菜品种、种子中具有低亚麻酸含量的欧洲油菜品种、Jet Neuf、Quantum、Maluka、Hyola43、Hyola60、Surpass400、Surpass402CL、Surpass603CL、Surpass501TT、RoundupReadyTM植物、LibertyLinkTM植物、含有雄性不育转基因的植物、InVigor40、InVigor70、InVigor90、InVigor2573、InVigor2663、InVigor2733、InVigor5020、InVigor5030或InVigor5070。
5.权利要求1-4中任一项的植物，其中所述黑胫病抗性基因已经通过遗传转化转移到所述植物中。
6.权利要求1-5中任一项的植物，其中所述芜青是B.rapa ssp.sylvestris。
7.权利要求1-6中任一项的植物，其中所述抗性基因包含Lem-08-syl。
8.权利要求7的植物，其中所述Lem-08-syl与至少一种选自P34/M48-M283.0、P31/M59-M97.1、E32/M48-M162.7、E31/M61-M237.6、E32/M50-M362.0和E36/M51-M171.1的AFLP标记物相关联。
9.权利要求8的植物，其中所述Lem-08-syl与AFLP标记物E32/M50-M362.0或AFLP标记物E36/M51-M171.1相关联。
10.权利要求7的植物，其中所述Lem-08-syl与至少一种选自P34/M48-M283.0、P31/M59-M97.1、E32/M48-M162.7和E31/M61-M237.6的AFLP标记物相关联。
11.来自以保藏号PTA-5410保藏于ATCC的种子的欧洲油菜植物。
12.权利要求1-11中任一项的植物，进一步在其基因组中包含位于不同染色体上的至少一个额外的黑胫病抗性基因。
13.权利要求12的植物，其中所述额外的抗性基因位于染色体N10、N14和/或N7上，或所述额外的抗性基因来自以下任一种欧洲油菜栽培品种Jet Neuf、Quantum、Maluka、Hyola60和Surpass400。
14.权利要求12或13的植物，其中所述额外的黑胫病抗性基因座来自芜青。
15.权利要求1-14中任一项的植物，其中所述植物在其基因组中还含有处于绒毡层特异启动子控制下的芽孢杆菌RNA酶基因。
16.权利要求1-15中任一项的植物的种子，其含有所述黑胫病抗性基因。
17.权利要求16的种子，其中所述种子是杂种种子。
18.以保藏号PTA-5410保藏于ATCC的种子。
19.产生在基因组中含有几个抗性基因座的杂种欧洲油菜种子的方法，包括-用欧洲油菜植物的花粉对雄性不育的权利要求1-15中任一项的植物授粉，其中所述欧洲油菜植物(a)在其基因组中含有处于绒毡层特异的启动子控制下的芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因，和(b)在染色体N10、N07和N14中任一染色体上含有黑胫病抗性基因，和-从所述雄性不育植物收获杂种种子。
20.产生杂种欧洲油菜种子的方法，包括-用在其基因组中含有处于绒毡层特异的启动子控制下的芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因的欧洲油菜植物的花粉对雄性不育的权利要求1-15中任一项的植物授粉，和-从所述雄性不育植物收获杂种种子。
21.含有芜青染色体R08的片段的杂种欧洲油菜种子，其中所述片段包含黑胫病抗性基因座，其中所述杂种欧洲油菜种子发育成植株，所述种子的固体成分中3-丁烯基-芥子油苷、4-戊烯基-芥子油苷、3-羟基-3-丁烯基-芥子油苷和2-羟基-4-戊烯基-芥子油苷之任何一种或任何混合物的含量少于30微摩尔/克风干无油固体。
22.权利要求21的杂种种子，其中所述黑胫病抗性基因位于染色体N08上。
23.来自权利要求21或22的杂种种子的植物。
24.增加黑胫病抗性持久性的方法，包括在欧洲油菜植物基因组中组合至少两个，优选至少3个黑胫病抗性基因座，其中所述抗性基因座是Lem-08-syl和Lem-10-syl或Lem-07。
25.权利要求24的方法，其中所述基因组是A基因组。
26.将权利要求3或4的黑胫病抗性基因转移进其它欧洲油菜植物中的方法，包括将权利要求3或4的植物与其它欧洲油菜植物杂交，收集来自所述杂交的F1杂种种子，将来自所述F1种子的F1植物自交或杂交一代或多代，并筛选来自所述自交或杂交的植物是否存在所述的芜青染色体片段，以及选择含有所述片段的植物。
27.权利要求26的方法，其中所述筛选是利用与所述黑胫病抗性基因座连锁的分子标记物进行的。
28.权利要求27的方法，其中所述筛选根据Lem-08-syl AFLP鉴定方案进行。
29.检测Lem-08-syl在欧洲油菜或芥菜组织或种子的DNA中存在与否的方法，包括实施Lem-08-syl AFLP鉴定方案。
30.用于在欧洲油菜或芥菜DNA样品中检测Lem-08-syl的试剂盒，其中所述试剂盒含有一个或多个能够扩增与Lem-08-syl连锁的DNA标记物的PCR引物对。
31.权利要求30的试剂盒，其中所述PCR引物对选自引物对E32/M50、P34/M48、P31/M59、E32/M48、E31/M61和E36/M51。
32.权利要求31的试剂盒，其中所述引物对能够分别扩增约362bp、283bp、97bp、162bp、237bp或171bp的DNA片段。
33.权利要求30到32中任一项的试剂盒，其还包含种子或组织，其中提取自所述种子或组织的DNA可以被用作阳性或阴性对照。
34.用于欧洲油菜的AFLP标记物，其选自E32/M50-M362、E36/M51-M171.1、P34/M48-M283。
35.AFLP标记物E32/M50-M362、E36/M51-M171.1、P34/M48-M283、P31/M59-M97.1、E32/M48-M162.7和E31/M61-M237.6中任一种在监测Lem-08-syl在芸苔属油料种子植物中的渐渗中的用途或在芸苔属油料种子植物的AFLP分析中的用途。
36.AFLP标记物E32/M50-M362、E36/M51-M171.1或P34/M48-M283在监测Lem-08-syl在欧洲油菜中的渐渗中的用途。
37.来自以保藏号PTA-5410保藏的种子的植物细胞，此植物细胞在适当的培养基中体外培养后产生在染色体N08上具有黑胫病抗性基因的植物，所述抗性基因来自芜青。
38.权利要求1-15中任一项的植物在生产油料种子菜籽油或油料种子菜籽饼中的用途。
39.权利要求1-15中任一项的植物在生产染色体8上具有黑胫病抗性基因的种子中的用途，其中所述抗性基因来自芜青。
40.权利要求1-15中任一项的植物在生产染色体8上具有黑胫病抗性基因的油料种子油菜作物中的用途，其中所述抗性基因来自芜青。
41.权利要求19、20和24到28中任一项的方法，其还包括选自如下的步骤获得在染色体8上含有黑胫病抗性基因的加倍单倍体植物、体外栽培、克隆或无性繁殖。
全文摘要
本发明涉及真菌疾病抗性，特别是针对由Leptosphaeria maculans引起的黑胫病疾病的抗性。提供基因组中含有野生型芜青种质染色体8的片段的芸苔属植物和种子，其中此片段含有黑胫病抗性基因座。进一步提供与所述黑胫病抗性基因座连锁的分子标记物和使用这些标记物的方法。还提供具有堆叠的黑胫病抗性基因座的芸苔属植物和种子。
文档编号A01H5/10GK1653883SQ200410102880
公开日2005年8月17日 申请日期2004年12月24日 优先权日2003年12月24日
发明者E·迪德里克森, B·拉加, J·博特曼 申请人:拜尔生物科学公司