具有改变的生长特性的植物及其生产方法

专利名称：具有改变的生长特性的植物及其生产方法
技术领域：
本申请涉及一种改变植物的生长特性的方法。更为具体地说，本发明涉及通过改变植物中编码TAD蛋白的核酸序列的表达和/或TAD蛋白的活性来增加产量。本发明还涉及具有编码TAD蛋白核酸序列表达的改变和/或TAD蛋白活性改变的植物，该植物相对于相应的野生型植物具有增加的产量。
背景技术：
AAA蛋白家族(ATPases Associated with various cellularActivities，Kunau等人，Biochimie 75，209-224，1993)代表了一大组共有大约230个氨基酸的高度保守的ATP结合结构域的蛋白，表现出ATPase活性(Neuwald等人，Genome Research 9，27-43，1999；Vale，J.Cell Biol.150，F13-F19，2000)。AAA蛋白分布广泛，且已经在古细菌(Archaea)、真细菌(Eubacteria)和所有的真核界中被鉴定。AAA结构域是蛋白功能所必需的，以六聚体环组织，在ATP水解时发生构象改变。这种依赖于ATP水解的构象改变给结合蛋白质施加了压力，这一机械活动使相关蛋白打开折叠、蛋白-蛋白分离等等。结果，AAA蛋白在不同的细胞过程中发挥重要作用，包括细胞周期、细胞器合成、线粒体功能、囊泡运输、蛋白折叠、细胞骨架的调节和细胞内运动。因此，AAA蛋白可能代表了许多种类的机械酶(mechanoenzymes)，涉及在许多不同生物环境中利用实质上类似的构象改变的独特的方式，但是与其目标蛋白相互作用的基础仍然是需要思考的问题(Vale，2000)。到目前为止，大多的研究努力集中于解析AAA ATPases的分子结构和功能，而人们对它们在宏观水平的功能，例如植物生长或产量，一无所知。
基于不断增长的世界人口，提高农业效率和增加植物园艺学的多样性仍然是农业研究的一个主要目标。农作物和园艺提高的传统方式采用选择性育种技术来识别具有需要的特性的植物。然而，这种选择性育种技术具有几个缺点，即，这些技术通常是劳动密集型的，并且导致经常含有异质性遗传组分的植物，这导致所需的特性不能总是从亲本植物传给下代。分子生物学的进步已经允许人类操纵动物和植物的生殖质。植物的遗传工程学使分离和操纵遗传材料(通常以DNA或RNA的形式)以及随后将遗传材料导入植物成为可能。这种技术已经导致具有多种改良的经济学、农艺学或园艺学性质的植物的产生。一种具有特别经济利益的特性为较高的产量。
发明详述发明人惊奇地发现改变植物中编码来源于TOB3样蛋白的ATPase结构域(此后命名为TOB3 ATPase结构域，TAD)的核酸序列的表达导致相对于相应的野生型植物具有增加的产量。
因此，根据本发明的第一个具体实施方式
，提供了与相应的野生型植物相比，增加植物的产量的方法，包括改变植物中分离的编码TAD蛋白或其同源物、衍生物或活性片段的核酸序列的表达和/或改变植物中TAD蛋白、其同源物、衍生物或活性片段的活性。
这里所定义的术语TAD编码核酸/基因指任意的编码来源于TOB3样蛋白的ATPase结构域的核酸或其互补序列。该核酸可以从任何来源获得(直接或间接(如果随后进行修饰))，只要该序列在植物中表达时，导致TAD核酸/基因表达的改变。该核酸可以从微生物来源分离，例如细菌、古细菌(archaea)、酵母或真菌，或来自植物、藻类或动物来源。与其原始的形式相比，通过精密的人工操作，该核酸的组成和/或基因组环境可以充分地改变，该核酸分子优选同源性的核酸分子，即结构和/或功能相关的核酸分子，优选来自植物，无论来自相同或不同的植物品种。该核酸分子可以从双子叶植物中分离，优选来自茄科(Solanaceae)，进一步优选来自烟草(Nicotiana tabacum)，更加优选该核酸是SEQ ID NO1所代表的核酸或其一部分，或能够与其杂交的核酸，该杂交分子编码具有TAD(ATP结合和/或ATP水解)活性的蛋白质，即与SEQ ID NO1具有类似的生物学活性；或该核酸编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列或编码其同源物、衍生物或活性片段。术语TAD编码核酸/基因也包括根据遗传密码的简并性编码TAD的核酸的变异体；编码TAD的核酸的等位基因变异体；编码TAD的核酸的不同的剪接变异体及被一个或多个插入序列中断的变异体。
这里所定义的术语TAD指含有来源于TOB3样蛋白的ATPase结构域的蛋白。TAD优选来自烟草，更加优选TAD蛋白是由SEQ ID NO2所示的蛋白，或其同源物、衍生物或活性片段，该同源物、衍生物或活性片段与SEQ ID NO2具有相似的生物活性。检测ATP结合或检测ATPase活性的方法在现有技术中广为人知。
根据本发明的方法可以方便地采用SEQ ID NO1所代表的序列的一部分进行，或通过采用与SEQ ID NO1杂交(优选在严格条件下)的序列进行，该杂交序列与SEQ ID NO1发挥同样的生物学功能(即编码具有TAD活性的蛋白)，或通过采用编码SEQ ID NO 2的序列的同源物、衍生物或其活性片段的核酸进行。
SEQ ID NO 2的同源物可以在多种原核和真核生物体中找到。然而最接近的同源物通常在植物界中发现。合适的SEQ ID NO2的同源物包括其它在蛋白中出现的TAD结构域，例如在GenBank中登录号NP_565435、NP_195376、AAL87170、BAD08048、NP_186956、BAD07862、NP_197195或PIR登录号A84563或T51548中所示的。
搜索和识别TAD同源物的方法完全在本领域熟练技术人员所掌握的技术范围内。这种方法包括用计算机可读形式的SEQ ID NO 1或2代表的序列与可以在公共数据库中得到的序列进行对比，例如MIPS(http//mips.gsf.de/)、GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)或EMBL核酸序列数据库(http//www.ebi.ac.uk/embl/index.html)，采用现有技术中已知的序列比对或比较的运算法则，例如，GAP(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48，443-453(1970))、BESTFIT(使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics 2，482-489(1981)))、BLAST(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.& Lipman，D.J.，J.Mol.Biol.215，403-410(1990))、FASTA和TFASTA(W.R.Pearson和D.J.Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，2444-2448(1988))。公众可以通过美国国立生物技术信息中心获得进行BLAST分析的软件。
上述为了计算序列同源性的分析可以采用全长查询序列或这种序列的一定区域，例如采用保守结构域。识别TAD家族成员(如下定义)或确定TAD和同源物(如下定义)的序列一致性的百分比也可以通过采用这些保守序列进行。对蛋白序列中这种结构域的识别，也完全在本领域技术人员的技术领域内，并涉及本发明采用的计算机可读形式的核酸、比对软件程序的应用和蛋白质结构域、保守基序和盒的公开信息的应用。综合搜索可以采用INTERPRO数据库(Mulder等，(2003)Nucl.Acids Res.31，315-318，http//www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)进行，该数据库将关于蛋白质家族、结构域和功能位点的几个数据库结合起来，例如PRODOM(Servant等人，(2002)Briefings in Bioinformatics 3，246-251，http//prodes.toulouse.inra.fr/prodom/2002.1/html/home.php)、PIR(Huang等人，(2003)Nucl.Acids Res.31，390-392，http//pir.georgetown.edu/)或Pfam(Bateman等人，(2002)Nucl.Acids Res.30，276-280，http//pfam.wustl.edu/)数据库。为基序搜索而设计的序列分析程序可以用于识别上述的保守片段、区域和结构域。为这一目标的合适的计算机程序包括，例如MEME(Bailey和Elkan(1994)Proceedings of the Second InternationalConference on Intelligent Systems for Molecular Biology，pp.28-36，AAAI Press，Menlo Park，California，http//meme.sdsc.edu/meme/website/intro.html)。
术语TAD包括SEQ ID NO 2代表的蛋白的蛋白同源物，TAD蛋白的“同源物”包括相对于未改变的蛋白具有氨基酸取代、缺失和/或插入的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，且具有与它们衍生自的未改变蛋白类似的生物学和功能活性。为生产这种同源物，蛋白质的氨基酸可以被其他具有类似性质(例如类似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或打破α-螺旋结构或β-片层结构的倾向性)的氨基酸替代。现有技术中熟知保守替代表(例如参见Creighton(1984)Proteins，W.H.Freeman and Company)。
当采用例如GAP的比对程序，缺口罚分为10和延伸罚分(extendpenalty)为0.5以及BLOSUM62矩阵，可用于本发明的方法的同源物在其与SEQ ID NO 2相应的蛋白质序列的部分中，与SEQ ID NO 2具有至少70％的序列一致性。通常同源物与SEQ ID NO 2具有至少80％的序列一致性或相似性，优选至少85％的序列一致性或相似性，进一步优选与SEQ ID NO 2具有至少90％的序列一致性或相似性，最优选与SEQ ID NO 2具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性或相似性。相似性的百分比也可以采用例如GAP的比对程序计算。
另外，可用于本发明的方法的同源物也可以定义为具有ATP结合活性和/或ATPase活性、且包括22个连续氨基酸残基的序列，该序列与SEQ ID NO 2中的相应序列具有至少90％的一致性。
同源物蛋白可以被分组为“蛋白家族”，一个蛋白家族可以采用例如Clustal W的程序通过功能和序列相似性分析而定义。由ClustalW程序产生的SEQ ID NO 2的同源性蛋白的邻近关系树给出了它们的结构和祖先关系的良好的概括。这些家族成员可以方便地用于本发明的方法中。
两种特殊类型的同源物，直向同系物(orthologous)和平行进化同源物(paralogues)是用来描述基因的祖先关系的进化概念。术语“平行进化同源物”涉及来自物种的基因组内的一个或多个基因副本的同源性基因。术语直向同系物涉及在不同的有机体中根据祖先关系确定的同源性基因。这里采用的术语“同源物”也包括了可用于本发明的方法的蛋白的平行进化同源物和直向同系物。直向同系物基因可以通过用感兴趣的目的基因查询一个或多个数据库而识别，采用诸如BLAST的程序，从搜索中得到的最高级别的目标基因接着再进行BLAST分析，只有那些与查询基因再次匹配的目标基因被保留为真正的直向同系物基因。例如，为了找到拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因的水稻直向同系物(orthologues)，可以对水稻数据库进行BLASTN或TBLASTX分析，(例如(但并不限于)在NCBI网站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)可获得的水稻(Oryza sativa)Nipponbare数据库，或水稻的基因组序列(栽培种indica或japonica)。下一步，得到的水稻序列被用来用拟南芥数据库进行反向BLAST分析。当得到的序列用ClustalW分析并在邻近关系树状图中显示时，结果可以被进一步精确。该方法可以用来识别从其它许多不同物种得到的直向同系物。
蛋白质的“取代变异体”指那些氨基酸序列中至少一个残基被去除且一个不同的残基插入该位置的变异体。氨基酸的取代通常为单个残基，但可以根据多肽的功能限制而成簇取代。氨基酸取代优选包括保守氨基酸的取代。蛋白质的“插入变异体”为那些在所述蛋白质的预先确定的位置插入了一个或多个氨基酸残基的蛋白质。插入可以包括氨基端和/或羧基端的融合以及序列内单个或多个氨基酸的插入。通常在氨基酸序列内的插入比氨基或羧基端的融合小1到10个残基的级别。氨基端或羧基端融合蛋白或肽的例子包括在酵母双杂交系统采用的转录活化剂的结合结构域或活性结构域、噬菌体包膜蛋白，(组氨酸)6-标签，谷胱甘肽S转移酶标签，蛋白A，麦芽糖结合蛋白，二氢叶酸还原酶，标签·100抗原决定簇，c-myc抗原决定簇，FLAG-抗原决定簇，lacZ，CMP(钙调蛋白(calmodulin)结合肽)，HA抗原决定簇，蛋白C抗原决定簇和VSV抗原决定簇。蛋白的“缺失变异体”以从蛋白中去除一个或多个氨基酸为特征，缺失通常在大约1-20个残基的范围内。蛋白的氨基酸变异体可以容易地用现有技术中已知的肽合成技术制成，例如固相肽合成以及类似的技术，或通过重组DNA操作。现有技术中熟知操作DNA序列来产生蛋白的取代、插入或缺失变异体的方法。例如，在DNA中预先确定的位点产生取代突变的技术为本领域技术人员熟知，包括M13诱变，T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)，QuickChange定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)，PCR-介导的定点诱变或其它定点诱变方案。
术语“衍生物”指肽，寡肽，多肽，蛋白和酶，与蛋白的天然形式的氨基酸序列，例如SEQ ID NO2所列的蛋白相比，它们可以含有天然或非天然发生氨基酸残基的取代、缺失或添加。TAD的“衍生物”包含肽，寡肽，多肽，蛋白和酶，其中可以含有天然产生的改变，糖基化，酰基化或与多肽的天然形式的氨基酸序列相比非天然发生的氨基酸残基。与其来源的氨基酸序列相比，衍生物也可以包括一个或多个非氨基酸的取代，例如，与氨基酸序列共价或非共价结合并促进其检测的报告分子或其它配体，以及相对于天然发生蛋白的氨基酸序列的非天然发生的氨基酸残基。TAD蛋白的“活性片段”包括蛋白质的至少5个邻近的氨基酸残基，该残基保留了与天然发生的蛋白质类似的生物学和/或功能活性。
本发明的方法也可以方便地采用DNA或核酸分子的一部分实施，该部分保留了TAD活性，即与SEQ ID NO2相似的生物学功能。DNA分子的一部分指从原始(较大的)DNA分子得来或制备的DNA片段，当该DNA部分在植物中表达时，使植物具有改变的生长特性。该部分可以包括许多基因，含有或不含另外的调控元件，或可以只包括间隔序列。
本发明也包括能够与编码TAD蛋白的核酸分子杂交的核酸分子，本发明的方法也可以采用这些核酸分子施行。这里定义的术语“杂交”是同源性互补核苷酸序列充分地相互退火的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即，互补核酸都在溶液中。依赖于这一过程的分子生物学工具包括聚合酶链反应(PCR；以及所有以此为基础的方法)、差减杂交、随机引物延伸、核酸酶S 1作图、引物延伸、反转录、cDNA合成、RNAs差异显示、以及DNA序列确定。杂交过程的发生也可以其中一个互补核酸固定于基质，例如磁珠、琼脂糖凝胶或任何其它树脂。依赖于这一过程的分子生物学工具包括分离poly(A+)mRNA。此外，杂交过程的发生可以其中一个互补核酸固定于固体支持物，例如硝酸纤维素或尼龙膜，或者用如光刻法的方式固定于例如硅玻璃支持物(后者已知为核酸阵列或微阵列或核酸芯片)。依赖于这一过程的分子生物学工具包括RNA和DNA凝胶印迹分析、菌落杂交、蚀斑杂交、原位杂交和微阵列杂交。为了允许杂交的发生，核酸分子通常被加热或用化学方法变性从而由双链熔解为两条单链和/或从单链中去除发卡结构或其它的二级结构。例如温度、盐浓度和杂交缓冲液成分的条件影响着杂交的严格性。
对于需要较高的选择性的应用，通常需要采用相对严格的条件来形成杂交，例如，将选择较低的盐浓度和/或较高的温度，如由大约0.02M到大约0.15M NaCl在大约50℃到大约70℃提供的。因此杂交的高度严格性条件包括较高的温度和/或低盐浓度(包括NaCl和柠檬酸钠的盐)，但杂交缓冲液中甲酰胺的存在和/或降低杂交缓冲液中例如SDS(十二烷基硫酸钠)的化合物的浓度和/或从杂交缓冲液中排除硫酸葡聚糖或聚乙二醇(提高分子拥挤度)等化合物也可以影响杂交的严格性。特别优选足够低的杂交严格度条件来分离与本发明先前定义的DNA序列同源的核酸。导致同源性的因素包括等位性、遗传密码简并性和优选密码子应用的不同等。
在核酸杂交试验，例如Southern和Northern杂交的情形下，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”取决于序列，在不同的环境参数下也不同。例如，较长的序列在较高的温度下特异性地杂交。Tm是在预定的离子强度和pH下，50％的目标序列与完全匹配的探针杂交的温度。特异性通常是杂交后洗涤的函数，这种洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度。通常，选择的严格条件比在定义的离子强度和pH下特异性序列的热熔点Tm低大约50℃。Tm是在定义的离子强度和pH下，50％的目标序列与完全匹配的探针杂交的温度。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成，可以用下列等式计算Tm＝79.8℃+(18.5xlog[Na+])+(58.4℃x％[G+C])-(820x(双链中的#bp)-1)-(0.5x％甲酰胺)更加优选的严格条件为当温度低于Tm20℃时，最优选的严格条件为当温度低于Tm10℃时。也可以采用一些已知技术的任意一种来控制非特异性结合，例如用含有蛋白质的溶液封闭膜，向杂交缓冲液中加入异源性RNA、DNA，以及SDS，以及用Rnase处理。洗涤条件通常在杂交严格度条件或低于杂交严格度条件实行。通常，核酸杂交分析的适宜严格度条件或基因扩增检测的程序如上所述，可选择严格度更高或更低的条件。
为了确定严格度的水平，可以方便地参考Sambrook等人(2001)分子克隆实验室手册，第3版，冷泉港实验室出版社，CSH，纽约，或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)。低严格度条件的例子为4-6xSSC/0.1-0.5％w/vSDS，37-45℃，2-3小时。根据杂交中核酸的来源和浓度，可以采用其它的严格度条件，例如中等严格度条件。中等严格度条件的例子包括1-4xSSC/0.25％w/vSDS，≥45℃，2-3小时。高严格度条件的例子包括0.1-1xSSC/0.1％w/vSDS，60℃，1-3小时。熟练技术人员知道杂交及冲洗期间可以改变的多种参数，以及维持或改变严格度条件的参数。例如，另一严格杂交条件是在4xSSC，65°杂交，然后在0.1xSSC中，65℃洗涤大约1小时。另外，可效仿的严格杂交条件为在50％的甲酰胺，4xSSC中，42℃。另一严格条件的例子包括在62℃，6xSSC、0.05xBLOTTO中杂交和在2xSSC、0.1％w/v SDS中，62℃洗涤。
本发明的方法也可应用编码TAD蛋白的核酸分子的可变剪接变异体实行。这里应用的术语“可变剪接变异体”包括选择的内含子和/或外显子已经被切除、替代或加入的核酸序列的变异体。这种变异体可以是其中的蛋白的活性保持不受影响的变异体，可以通过选择性地保留蛋白的功能片段而实现。这种剪接变异体可以在自然界中发现或人工制造。现有技术中众所周知制造该剪接变异体的方法。因此本发明也包括改变植物的生长特性，特别是提高产量的方法，包括改变植物中编码TAD的核酸分子的可变剪接变异体的表达和/或改变由可变剪接变异体编码的TAD的活性和/或水平。该剪接变异体优选SEQ IDNO1所示序列的剪接变异体。
本发明的方法也可方便地采用编码TAD的核酸分子的等位基因变异体施行，优选SEQ ID NO1所示的序列的等位基因变异体。自然界中存在等位基因变异体，本发明的方法包括使用这些天然等位基因。等位基因变异体也进一步定义为包括单核苷酸多态性(SNPs)，以及小插入/缺失多态性(INDELs；INDELs的大小通常小于100bp)。在多数有机体的自然发生的多态系中，SNPs和INDELs组成了最大一组的序列变异体。它们有助于基因作图和发现基因和基因功能。它们另外还有助于识别基因位点，例如植物基因，涉及生长率、植物大小和植物产量、植物活力、抗病性、应激耐受等等的确定过程。现在可以获得识别SNPs和/或INDELs的许多技术，包括(i)PCR，然后进行高效液相变性色谱(DHPLC；例如Cho等人(1999)Nature Genet.23，203-207)；(ii)连续变性毛细管电泳(CDCE)与高保真PCR结合(例如，Li-Sucholeiki等人(1999)Electrophoresis 20，1224-1232)；(iii)变性梯度凝胶电泳(Fischer和Lerman(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，1579-1583)；(iv)基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF MS；例如，Ross等人(2000)Biotechniques 29，620-629)；(v)实时荧光监测PCR分析(Tapp等人，(2000)Biotechniques 28，732-738)；(vi)AcryditeTM凝胶技术(Kenney等人，(1998)Biotechniques 25，516-521)；(vii)循环双脱氧指纹识别(CddF；Langemeier等人，(1994)Biotechniques 17，484-490)；(viii)单链构象多态性(SSCP)分析(Vidal-Puig和Moller(1994)Biotechniques 17，490-496)以及(ix)迷你测序引物延伸反应(Syvanen(1999)Hum.Mutat.13，1-10)。基因组靶向诱导位点损伤技术(TILLING；McCallum等人，(2000)Nat.Biotechnol.18，455-457；Plant Physiol.123，439-442)是上述(i)的变体，也可以用于迅速地在例如表现出感兴趣表型的化学诱变的植物个体中识别改变的基因。
在特定的常规育种程序中，例如在标志物辅助育种中，上述的等位基因变异体的运用也包含在本发明内；这可以是它们在本发明的方法中另外的应用。这种育种程序有时要求通过对植物进行诱变处理向植物中引入等位基因变异体。一种合适的诱变方法为EMS诱变，接着通过例如PCR的方法来识别等位基因变异体，之后为选择步骤，来选择讨论序列[命名蛋白]的更好的等位基因变异体，该变异体可以使植物中生长特性发生改变。选择通常通过监控含有不同的所讨论序列的等位基因变异体的植物的生长表现进行，例如，SEQ ID NO1的不同等位基因变异体。监控生长表现可以在温室或田野中进行。另外可选择的步骤包括将其中识别了优良等位基因变异体的植物与其它植物杂交，这可以被用于将感兴趣表型特性组合起来等等。因此，由于TAD基因中的突变可以天然发生，它们可以构成选择表现出高产量的植物的基础。
本发明的方法也可以通过向植物中至少导入染色体的一部分(自然的或人工的)(例如细菌人工染色体(BAC))来施行，该染色体含有编码TAD(例如SEQ ID NO1)的至少一种基因/核酸，优选与来自同一物种或来自同一基因家族的一个或多个相关基因，和/或编码TAD表达和/或活性的调控蛋白的核酸分子同时导入。因此，本发明也包括了一种通过向植物中导入含有至少一个编码TAD的基因/核酸的染色体的一部分来改变植物的生长特性，特别是提高产量的方法，该编码TAD的基因/核酸在种子优先启动子的控制下，且人工染色体也优选包括来自同一物种的一个或多个相关基因，和/或编码TAD表达和/或活性的调控蛋白的核酸序列。
根据本发明的一个优选方面，设想与相应的野生型植物对比使核酸过表达(或表达提高)，提高或降低编码TAD蛋白的核酸的表达(或调节表达)包括在整个生物体或在特定的细胞或组织中改变表达。可以通过例如化学手段和/或重组手段来实现改变基因的表达。调节TAD基因的表达可以直接实现(即通过调节所述TAD编码基因本身的表达)。在直接方法中，调节的表达可以由改变内源性TAD基因的表达而产生和/或可以由改变预先导入植物的TAD编码核酸的表达而产生。另外或可选地，上述的表达的调节可以以间接方式达到，例如作为降低或增加调控TAD基因表达的因子的水平和/或活性的结果。改变的表达理解为当与相应的野生型植物的相应的TAD蛋白的表达对比时的改变。
可以方便地通过化学手段改变编码TAD蛋白核酸的表达和/或改变TAD蛋白本身的水平和/或活性，即通过外源性应用一种或多种能够改变TAD基因(该基因可以是一种内源性基因或导入植物的转基因)的表达的化合物或元件。术语“外源性应用”在其广义的含义包括用合适的化合物或元件接触或给予细胞、组织、器官或生物体。该化合物可以以适合植物摄入的方式外源性地应用于植物(例如通过施用到土壤中通过根来吸收，或直接施用于叶子，如通过喷雾)。适合外源性应用的化合物或元件包括编码TAD的核酸或与其杂交的核酸。另外或可选地，用基因的相互作用蛋白或用抑制剂或活化剂接触或给予细胞、组织、器官或生物体提供了调控编码TAD的核酸的表达的另一外源性方式。编码TAD的核酸的表达调控也可以作为直接或间接活化或灭活TAD蛋白的因子的水平改变的结果而实现。
而且，植物、种子或其它植物材料可以用诱变物质进行处理。诱导突变的化学物质包括N-亚硝基-N-乙脲、吖丙啶、乙基甲烷磺酸酯和二乙基硫酸酯。作为选择，离子放射，例如X线或γ线也可以同样良好地使用。引入突变和检测突变效果的方法(例如改变的基因表达和/或改变的蛋白活性)是现有技术中已知的。诱变包括利用化学突变剂，以及物理突变剂，例如放射。TAD蛋白的任何特性均可以通过诱变而改变，例如这些突变可以是TAD编码基因调控改变的原因，导致基因预期的表达水平或表达模式。特别是，这些突变可以导致TAD主要限于种子的过表达。可选地和/或另外地可以调节蛋白的活性或底物特异性，或可以调节对辅因子的亲和性。根据本发明的一个优选方面，所述的诱变导致TAD蛋白在植物种子中表达和/或活性和/或水平的增加。
另外或作为选择，根据本发明的一个优选实施方式，调节编码TAD蛋白的核酸的表达和/或改变TAD蛋白本身的水平和/或活性可以通过重组手段实现。这种重组手段可以包括直接或间接途径来调节核酸的表达。
例如，一种间接途径可以包括向植物中导入一种能够调节目的蛋白(TAD蛋白)水平和/或活性和/或能够改变目的基因(编码TAD蛋白的基因)表达的核酸。这些能被导入植物中的核酸的例子包括编码与TAD基因启动子结合或与TAD蛋白相互作用的转录因子、活化剂、抑制剂或其它配体的核酸。检测这些类型的相互作用的方法和分离编码这种相互作用物的核酸的方法包括酵母单杂交或酵母双杂交筛查等。TAD基因或TAD蛋白可以是野生型，即天然或内源性核酸或多肽。可选地，它可以是来自同一或另一物种的核酸，例如通过转化将该基因作为转基因导入。该转基因可以相对于其最初的形式在组成和/或基因组环境上通过精密的人工操作充分地改变。还包括一种调节TAD基因表达的间接途径，即抑制或刺激调控序列，或提供驱动编码TAD的天然基因或编码TAD的转基因表达的调控序列。这种调控序列可以被导入植物，例如，被导入植物的调控序列可以是能够驱动内源性TAD基因表达的启动子。
一种调节TAD基因表达的直接和优选的途径包括向植物中导入编码TAD蛋白或其同源物、衍生物或其活性片段的核酸分子。该核酸可以被导入植物，例如通过转化。
一种更加优选的途径包括向植物中导入SEQ ID NO 1所示的TAD基因。最优选的途径包括向植物中导入以有义方向与种子优先启动子偶联的TAD编码基因。
现有技术中已经有许多文件记载了获得提高或增加的基因表达或基因产物的方法，包括通过合适的启动子驱动的过表达以及转录增强子或翻译增强子的应用。这里采用的术语“过表达”一词表示相对于原初野生型表达水平增加的任意形式的表达。相对于它所可操作地连接的启动子，优选引入植物的核酸和/或在植物中过表达的核酸为有义方向。过表达的核酸优选编码TAD蛋白，更加优选植物来源的TAD蛋白，该编码TAD蛋白的核酸分子更加优选来自双子叶植物，优选来自茄科(Solanaceae)，更加优选分离于烟草。该核酸序列最优选SED IDNO1所示的核酸序列或其一部分，或编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列或编码其同源物、衍生物或活性片段。然而，必须注意本发明的应用并非仅限于SEQ ID NO1所示的核酸的应用，也不仅限于编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的核酸分子，而其它编码SED ID NO2的同源物、衍生物或活性片段的核酸分子或SEQ ID NO1的部分，或与SEQ ID NO1杂交的序列均可应用于本发明的方法中。
根据本发明的另一方面，设想核酸序列表达下降。改变基因的表达(通过直接或间接方法)包括改变基因的转录水平。改变转录水平可能足够诱发一定的表型效应，例如通过共抑制机理。这里过表达转基因的总体效应是，细胞中的与引入的转基因有同族关系的天然基因编码的蛋白质具有较小的活性，其它降低表达的例子在现有技术中已经有许多文件说明，包括，例如通过反义技术、共抑制技术、RNAi技术、小干扰RNAs(siRNAs)和微RNA(miRNA)、核酶的应用等等下调表达。因此根据本发明的一个特定方面，提供了改变植物生长特性的方法，包括基于反义转录物(与TAD基因片段的mRNA互补)的合成、或基于RNA干扰的技术。本发明的方法可以方便地通过下调编码TAD的核酸序列来施行。具有改变的生长特性的植物可以通过以有义或反义方向表达编码TAD的核酸序列而获得。下调技术是现有技术中众所周知的。这里采用的术语表达的“基因静默”或“下调”指降低基因表达的水平和/或活性基因产物的水平和/或基因产物的活性的水平。这种表达的降低可以伴随着有义方向的编码序列或其部分的增加等等(如果需要共抑制)。因此，根据本发明的一个方面，可以通过向植物中导入另外拷贝的(全长或部分)宿主植物中已经存在的TAD基因的片段而改变植物的生长。加入的基因将使内源性基因静默，产生已知为共抑制的现象。
以基因表达静默为目的的遗传构建体可以包括编码TAD的核酸序列，例如相对于启动子序列的有义和/或反义方向的SEQ ID NO1所示的核酸序列(或其中一个或多个部分)，本发明的方法中也可以利用正向或反向重复形式的内源基因的至少一部分的有义或反义拷贝。植物的生长特性也可以通过向植物中引入SEQ ID NO1等所示的核酸序列的反义形式的至少一部分而改变。应当清楚核酸的局部(一部分)可以达到需要的结果。来自同样植物物种的相应的基因的反义序列优于来自同样或其它植物物种的同源性基因的反义序列。
另一个下调基因表达或基因静默的方法包括采用核酶，如Atkins等人1994(WO94/00012)，Lenee等人1995(WO95/03404)，Lutziger等人2000(WO00/00619)，Prinsen等人1997(WO97/3865)以及Scott等人1997(WO97/38116)所描述的。
基因静默也可以通过插入诱变而达到(例如，T-DNA插入或转座子插入)，或通过Angell和Baulcombe 1998(WO98/36083)，Lowe等人1989(WO98/53083)，Lederer等人1999(WO99/15682)或Wang等人1999(WO99/53050)所描述的基因静默策略。如果内源性基因含有突变，则内源性基因的表达也可以下调，为了得到具有改良的生长特性的植物，这样的突变基因可以被分离并引入同样或不同的植物物种。
TAD蛋白的过表达优选首先在植物的种子中实现，更加优选在种子的胚乳中。可选地，过表达在植物的幼苗中实现，本发明的方法的实行可以方便地导致植物具有多种改变的生长特性，这些生长特性包括相对于相应的野生型植物改变的产量或生物量。改变的生长特性优选为改善的生长特性，包括相对于相应的野生型植物增加的产量或生物量。
“产量”指单位面积生产的收获物的量，术语“增加的产量”包括相对于相应的野生型植物的生物量而言植物的一个或多个部分的生物量的提高。依赖于农作物，植物的收获部分可能为植物的不同部分或组织，例如种子(如水稻、高梁或为获取种子而种植的玉米)；总的地上生物量(如，用作饲料的玉米、甘蔗)、根(如甜菜)、果实(如番茄)、棉纤维，或具有经济价值的植物的任意其它部分。例如，本发明的方法用于提高水稻和玉米的种子产量，或在总的地上生物量和能量含量方面提高饲料玉米的产量。产量的增加包括种子产量的增加，包括种子的总生物量(总种子重量)的增加和/或饱满种子(filled seed)数的增加和/或总种子数的增加。产量的增加也表现在收获指数的增加，其中收获指数表示为种子等可收获部分的产量和总生物量的比例。
因此，提供了一种相对于相应的野生型植物而言提高植物产量，特别是种子产量的方法，包括主要在该植物的种子中导入和过表达编码TAD蛋白，其同源物、衍生物或活性片段的核酸序列，其中产量的提高包括相对于相应的野生型植物增加的总种子重量、增加的饱满种子数、或增加的收获指数的至少其中之一。
产量本身为一种复杂的参数，其中总产量取决于一些产量成分。农作物增加的产量的参数为本领域的技术人员熟知。例如，农作物的关键产量参数包括每公顷或亩的植物数量，每株植物的抽穗数量，每穗的行数(种子)，每行的谷粒数，每千粒重量。根据本发明的方法获得的产量的提高可以作为这些产量参数的一个或多个的结果而获得。例如，水稻的关键产量参数为每公顷或每亩的植物数量、每株植物的散穗(panicle)数目、每散穗的小穗(spikelet)数目、种子饱满率以及每千粒重量。根据本发明的方法获得的产量的提高可以作为这些产量参数的一个或多个的结果而获得。产量的提高优选通过主要基于提高每散穗花的数目以及提高种子饱满率而获得。
根据本发明的一个优选的性质，本发明的方法的完成导致植物具有改变的产量。改变的产量优选为种子产量增加，且包括散穗数目、每散穗的小穗数目、总种子数目、饱满种子数、总种子重量、千粒重以及收获指数中的至少一种的增加，每种均相对于对照植物而言。因此，根据本发明，提供了一种提高植物的种子总重、饱满种子数和/或收获指数的方法，该方法包括以种子优先的方式，调节植物中编码TAD蛋白的核酸分子的表达和/或调节TAD本身的活性，优选其中TAD蛋白由SEQ ID NO1或其一部分或由能够与其杂交的序列编码，或其中TAD如SEQ ID NO2所示或为其同源物、衍生物或活性片段。
根据本发明的另一具体实施方式
，提供了用来帮助用于本发明的方法的核酸序列的导入和/或表达的遗传构建体和载体，因此根据本发明的第二种具体实施方式
，提供了一种基因构建体，包括a.一种能够调节编码TAD蛋白的核酸的表达和/或TAD蛋白的水平和/或活性的核酸序列；b.能够驱动(a)所述核酸序列表达的一种或多种调控序列；c.转录终止序列。
用于本发明的方法的构建体可以用本领域技术人员熟知的重组DNA技术建立。该基因构建体可以被插入载体，载体可以购买得到，适合于转化入植物并适合感兴趣基因在转化细胞的表达。遗传构建体可以为表达载体，其中核酸分子可操作性地与一种或多种调控序列连接，使其在原核和/或真核宿主细胞中表达。
根据本发明的一个优选的具体实施方式
，遗传构建体可以为表达载体，设计用于过表达核酸分子；特别为主要在种子中获得过表达，更特别在植物种子的胚乳中过表达。另外地和/或可选地，设计的表达载体用于在幼苗阶段过表达核酸。能够调节编码TAD蛋白的核酸分子的表达的核酸分子优选为编码TAD或其同源物、衍生物或活性片段的核酸分子，例如这里前述的任意的核酸分子。优选的核酸分子为SEQID NO1所示的序列或其一部分，或能够与其杂交的序列，或编码SEQID NO2所示的序列或编码其同源物、衍生物或活性片段的核酸分子。该核酸优选相对于它操作性连接的调控序列以有义的方向克隆。
用含有感兴趣序列(即编码TAD蛋白的核酸分子)的载体转化植物，该序列与一个或多个调控序列(至少一个启动子)可操作地连接。术语“调控元件”、“调控序列”、“控制序列”和“启动子”这里可互换使用和在广泛的情形下使用，指能够影响它们所连接的序列的表达的调节核酸，被前述术语包括的为来源于经典的真核基因组基因的转录调节序列(包括精确的转录起始所必需的TATA盒，具有或不具有CCAAT盒序列)以及附加的调控元件(即，上游活化序列，增强子，静默子)，该序列根据发育和/或外部刺激而改变基因的表达，或以组织特异性的方式表达。经典的原核基因的转录调控序列也包含在该术语范围内，在该情形下，它可以包括一个-35盒序列和/或-10盒转录调节序列。术语“调控序列”也包含赋予、活化或增强细胞、组织或器官中核酸分子表达的合成融合分子或衍生物，这里采用的术语“可操作性连接”指在启动子序列和感兴趣基因之间的功能性连接，从而使启动子序列能够起始感兴趣基因的转录。
为了获得需要的改变的生长特性，感兴趣基因以合适的水平和以空间和发育的适宜模式表达很重要。编码TAD蛋白的核酸分子优选与种子优先启动子可操作地连接。这里定义的“种子优先”启动子指在一个或多个种子组织中占绝对优势表达的启动子，该种子优先启动子优选为胚乳优先启动子，更优选GenBank中登录号为X65064所示的启动子(从核苷酸1到672的序列，这里以后命名为PRO0090)，或类似强度和/或类似表达模式的启动子。因此，本发明也提供了一种改变植物的生长特性，特别是产量的方法，包括增加植物中编码TAD蛋白的核酸的表达，其中增加的表达主要在种子中获得。该表达优选在种子优先的启动子的控制下实现，种子优先启动子更加优选为胚乳优先启动子，种子优先启动子最优选PRO0090。然而，应当注意该PRO0090启动子在幼苗中也有活性，因此本发明的方法也可以采用幼苗优先启动子实行。因此，本发明也提供了一种改变植物的生长特性，特别是产量的方法，包括增加植物中编码TAD蛋白的核酸的表达，其中增加的表达主要在幼苗中获得。
启动子的强度和/或表达模式可以通过例如将该启动子与报告基因连接并检测报告基因在不同的植物组织中的表达来分析。一个本领域技术人员熟知的合适的报告基因为β葡糖醛酸酶，接着启动子的强度和/或表达模式可以与充分鉴定的参考启动子比较，例如CaMV 35S启动子或种子优先的水稻谷醇溶蛋白NRP33启动子。非限制性的其它种子优先启动子的例子列于表1中，这些启动子或其衍生物也可以用于本发明的方法中。
表1.本发明的实行中示例性的种子优先启动子
在导入植物的构建体中可以任意地采用一个或多个终止子序列。术语“终止子”包括为转录单位末端的DNA序列的控制序列，它给予初级转录本的3’端处理和聚腺苷酸化的信号和转录终止的信号。其它调控元件可以包括转录和翻译增强子。本领域技术人员已知适合用于本发明的终止子和增强子序列，本领域技术人员可以知道并容易得到这种序列。
本发明的基因构建体可以进一步包括序列复制起点，它是在特定细胞类型中保持和/或复制所必需的。一个例子是当基因构建体在细菌细胞中作为游离体(episomal)遗传元件(如，质粒或粘粒分子)需要保持的时候。优选的复制起点包括，但并不限于f1-ori和colE1。
该遗传构建体可以任意地包括可选择标记基因，这里采用的术语“可选择标记基因”包括赋予它所表达的细胞表型的任意基因，以协助识别和/或选择用本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。合适的标记可以选自导致抗生素或除草剂抗性的标记，引入新的新陈代谢特性或允许视觉选择的标记。可选择标记蛋白的例子包括，导致对抗生素(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII，或能够磷酸化潮霉素的hpt)，对除草剂(例如bar，提供Basta抗性；aroA或gox，提供草甘膦抗性)产生抗性的蛋白，或提供新陈代谢特性的基因(如manA，允许植物利用甘露糖作为唯一的碳来源)。可见的标记基因导致颜色的形成(例如β葡糖醛酸酶，GUS)，发光(例如荧光素酶)或荧光(绿色荧光蛋白，GFP，和其衍生物)。
在一个优选的具体实施方式
中，上述的遗传构建体包括以有义方向与启动子偶联的TAD，该启动子优选为种子优先和/或幼苗优先启动子，例如PRO0090启动子。因此，本发明的另一方面为一种含有本质上与SEQ ID NO 3相同的表达盒的载体构建体，含有PRO0090启动子，烟草TAD基因以及T-玉米醇溶蛋白+T-rubisco转录终止子序列。一个与SEQ ID NO 3本质上相同的序列包括编码SEQ ID NO 2的同源性蛋白或与SEQ ID NO 1杂交的第一核酸序列，该第一核酸与PRO0090启动子或一个有相似表达模式和水平的启动子操作性地连接，该第一核酸任意地与转录终止序列连接。
本发明还包括通过本发明的方法得到的植物，本发明因此提供通过本发明的方法所得到的植物，该植物具有增加的产量，特别是具有增加的总种子重量、增加的总种子数目、增加的饱满种子数和/或增加的收获指数，且该植物具有改变的编码TAD蛋白的核酸序列的表达和/或改变的TAD蛋白活性。与相应的野生型植物对比，改变的表达和/或活性优选主要在种子和/或幼苗中实现。与相应的野生型植物对比，改变的表达和/或活性优选为增加的表达和/或活性。
更加具体的，本发明提供了一种生产具有改变的生长特性的转基因植物的方法，该方法包括(i)向植物或植物细胞中导入编码TAD蛋白或其同源物、衍生物或活性片段的核酸分子或其一部分；(ii)在促进再生和成熟植物生长的条件下培养植物细胞。
蛋白本身和/或核酸本身可以被直接导入植物细胞或植物本身(包括导入植物的组织、器官或任意其它部位)。根据本发明的一个优选性质，核酸优选通过转化导入植物。核酸优选为SEQ ID NO1所示的核酸或其一部分或能够与其杂交的序列，或编码SEQ ID NO2的氨基酸序列或其同源物、衍生物或活性片段的核酸。核酸序列优选在种子/幼苗优先的启动子的控制下，更优选PRO0090启动子。
这里涉及的术语“转化”包括将外源性多核苷酸转移到宿主细胞中，而不考虑用来转移的方法。能够随后进行无性繁殖的植物组织，无论通过器官形成或胚形成，都可以用本发明的基因构建体来转化，整株植物从那里再生。选择的特定组织将根据可利用的无性繁殖系统而变化，且最好适合于被转化的特定物种。代表性的目标组织包括叶片、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子体、胼胝体组织、现存的分生组织(例如，顶端分裂组织，叶腋芽，以及根部分裂组织)，和诱导的分裂组织(例如，子叶分裂组织和下胚轴分裂组织)。多核苷酸可以被瞬时或稳定导入宿主细胞并可以非整合保持，例如，作为质粒。可选地，它可以整合入宿主基因组，获得的转化植物细胞可以用于以本领域技术人员已知的方式使转化植物再生。
目前植物物种的转化是一种相当常规的技术，可以方便的采用几种转化方法的任意一种来将感兴趣核酸导入一种合适的祖先细胞。转化方法包括运用脂质体、电穿孔、增加自由DNA摄入的化学物质、向植物中直接注射DNA、粒子枪轰击、用病毒或花粉转化或显微发射。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生质体的电穿孔(Shillito R.D.等，1985Bio/Technol 3，1099-1102)；向植物材料微注射(Crossway A.等，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；DNA或RNA-包被粒子轰击(Klein T.M.等，1987，Nature 327，70)用病毒及类似物感染(非整合的)。一种本发明优选的水稻转化方法为Hiei等(Plant J.6，271-282，1994)的方案。优选的高效转化玉米的方法为Ishida等(1996，Nat Biotechnol.14，745-50)以及Frame等(2002，PlantPhysiol.129，13-22)描述的方案，该公开在这里作为参考引用，如同全部列出一样。
通常转化后，筛选植物细胞或细胞组一个或多个标记的存在，该标记被与感兴趣基因共转移的植物可表达的基因编码，接着转化材料再生为完整的植株。
DNA转移和再生后，可以测定推定被转化植物的感兴趣基因的存在、拷贝数和/或基因组组成，例如运用Southern分析，可选地或附加地，新导入的DNA表达水平可以用Northern和/或Western分析，两种技术都为本领域普通技术人员所熟知。
在选择的下一步骤，评估转化植物的需要的表型。本领域技术人员，如植物分子生物学家已知，植物中转基因的表达，以及因此由于该转基因表达导致的表型效应在不同的独立获得的转基因品系中和其后代中可能不同。在不同的独立获得的转基因植物中存在的转基因基于染色体插入位点和插入该位点的转基因拷贝的数目以及该位点的这些转基因的结构而彼此不同。表达水平的不同可以描述为受转基因的染色体环境的影响(所谓的位置效应)或由一定的转基因构象引发的静默机制(例如，内向面对串联插入的转基因倾向于在转录或转录后水平静默)产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过无性繁殖或传统培育技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以自花受精产生纯合子的第二代(或T2)转化子，T2植物进一步通过经典培育技术繁殖。
产生的转化有机体可以采取多种形式，例如它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；无性繁殖转化体(例如，所有的转化细胞含有表达盒)；转化和非转化组织的嫁接体(例如，在植物中，将转化的根茎嫁接到未转化的幼芽上)。
本发明无疑延伸至这里描述的任意方法所产生的任意植物细胞或植物及其所有的植物部分、种子和繁殖体。本发明进一步延伸，包含了由任意的前述方法产生的初级转化和转染的细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一的要求为后代表现出与通过本发明的方法在亲本中产生同样的基因型和表型特征。本发明也包括含有编码TAD蛋白的分离核酸分子的宿主细胞。根据本发明优选的宿主细胞是植物细胞。本发明也扩展到本发明植物的可收获部分，例如但并不限于种子、叶、果实、花、茎或茎培养物、根茎、根、块茎和鳞茎。
这里采用的术语“植物”包括整株植物、植物的原种和后代和植物部分，包括种子、果实、花、芽、叶、茎、根(包括块茎)、以及植物细胞、组织和器官。术语“植物”也包括悬浮培养物、胚、分生组织区域、骈胝组织、配子体、孢子体、花粉、以及小孢子。本发明的方法中特别有用的植物包括藻类、蕨类植物以及所有属于Viridiplantae的植物，特别是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或草料豆类、装饰植物、食品农作物、树木、或灌木，从包括下列的植物中选择烟草属(Abelmoschus spp.)，槭树属(Acer spp.)、猕猴桃属(Actinidia spp.)，Agropyron spp.，葱属(Allium spp.)，苋属(Amaranthus spp.)，菠萝(Ananas comosus)，番荔枝属(Annonaapp).，旱芹(Apium graveolens)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)，落花生属(Arachis spp.)，波萝属(Artocarpus spp.)，石刁柏(Asparagus officinalis)，燕麦(Avena sativa)，阳桃(Averrhoacarambola)，冬瓜(Benincasa hispida)，Bertholletia excelsea，红柄添菜(Beta vulgaris)，芸苔属(Brassica spp.)，Cadabafarinosa，大叶茶(Camellia sinensis)，美人蕉(Canna indica)，辣椒属(Capsicum spp.)，番木瓜(Carica papaya)，大花假虎刺(Carissa macrocarpa)，红花(Carthamus tinctorius)，核桃木(Carya spp.)，板栗属(Castanea spp.)，莴苣叶(Cichoriumendivia)，香樟属(Cinnamomum spp)，西瓜(Citrullus lanatus)，柑橘属(Citrus spp.)，椰子属(Cocos spp.)，咖啡属(Coffea spp.)，Cola spp.，芋(Colocasia esculenta)，榛属(Corylus spp.)，山楂属(Crataegsu spp.)，香瓜属(Cucumis spp.)，南瓜属(Cucurbitaspp.)，蓟属(Cynara spp.)，胡萝卜(Daucus carota)，角丝鼓藻属(Desmodium spp.)，龙眼(Dimocarpus longan)，山药属(Dioscorea spp.)，柿树属(Diospyros spp.)，稗属(Echinochloaspp.)，移子(Eleusine coracana)，枇杷(Eriobotrya japonica)，红果仔(Eugenia uniflora)，荞麦属(Fagopyrum spp.)，水青属(Fagus spp.)，无花果(Ficus carica)，金柑属(Fortunella spp.)，草莓属(Fragaria spp.)，银杏(Ginkgo biloba)，大豆属(Glycinespp.)，陆地棉(Gossypium hirsutum)，向日葵(Helianthus spp.)，木楼属(Hibiscus spp.)，大麦属(Hordeum spp.)，甘薯(Ipomoeabatatas)，核桃属(Juglans spp.)，莴苣(Lactuca sativa)，香碗豆属(Lathyrus spp.)，浮萍属(Lemna spp.)，兵豆(Lensculinaris)，亚麻(Linum usitatissimum)，荔枝(Litchichinensis)，百脉根属(Lotus spp.)，棱角丝瓜(Luffaacutangula)，羽扇豆属(Lupinus spp.)，Macrotyloma spp.，Malpighia emarginata，苹果属(Malus spp.)，满梅果(Mammeaamericana)，杧果(Mangifera indica)，木薯属(Manihot spp.)，人心果(Manilkara zapota)，紫苜蓿(Medicago sativa)，草木樨属(Melilotus spp.)，薄荷属(Mentha spp.)，Momordica spp.，黑桑(Morus nigra)，香蕉属(Musa spp.)，烟草属(Nicotiana spp.)，Olea spp.，仙人掌属(Opumtia spp.)，Ornithopus spp.，野生稻属(Oryza spp.)，黍(Panicum miliaceum)，西番莲(Passifloraedulis)，美洲防风(Pastinaca sativa)，酪梨属(Persea spp.)，欧芹(Petroselinum crispum)，菜豆属(Phaseolus spp.)，海枣(Phoenix spp.)，酸浆属(Physalis spp.)，松属(Pinus spp.)，开心果(Pistacia vera)，豌豆属(Pisum spp.)，早熟禾属(Poaspp.)，杨树(Populus spp.)，牧豆树(Prosopis spp.)，樱桃(Prunus spp.)，石榴属(Psidium spp.)，安石榴(Punica granatum)，西洋梨(Pyrus communis)，橡树属(Quercus spp.)，萝卜(Raphanussativus)，大黄(Rheum rhabarbarum)，茶藨属(Ribes spp.)，钩子属(Rubus spp.)，甘蔗(Saccharum spp.)，Sambucus spp.，黑麦(Secale cereale)，Sesamum spp.，马铃薯属(Solanum spp.)，高梁(Sorghum bicolor)，Spinacia spp.，蒲桃属(Syzygium spp.)，酸豆(Tamarindus indica)，可可(Theobroma cacao)，Trifoliumspp.，Triticosecale rimpaui，小麦属(Triticum spp.)，越桔属(Vaccinium spp.)，野豌豆属(Vicia spp.)，豇豆(Vigna spp.)，葡萄(Vitis spp.)，玉蜀黍(Zea mays)，野生稻(Zizania palustris)，枣(Ziziphus pp.)，等等。
本发明的方法对应用于农作物植物中特别有利，因为本发明的方法用于提高植物的产量，特别是种子产量，更特别为种子的总重量、饱满种子的数量和收获指数。因此，本发明的方法在收获种子的谷类植物中特别有用，例如谷类、向日葵、大豆、棉花、豌豆、亚麻、羽扇豆、油菜(canola)等等，但也可用于收获生物量的农作物中。根据本发明的优选特性，植物为农作物植物，包括大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽(rapeseed)或棉花。本发明的植物更加优选为单子叶植物，包括禾本科的成员，例如甘蔗，最优选谷类，例如水稻、玉米、小麦、粟、大麦和高梁。相应地，本发明的一个特别的具体实施方式
涉及提高谷类的产量，特别是种子的总重量、饱满种子的数量、总种子数和/或收获指数的方法。
本发明也涉及分离的编码TAD蛋白的核酸及其片段或与之杂交的核酸在改变植物的生长特性中的应用，优选提高植物产量，更加优选植物的种子产量，特别是种子的总重量、饱满种子的数量、总种子数和/或收获指数，其中编码TAD蛋白的核酸，其片段或与之杂交的核酸以种子优先的方式表达。本发明也涉及TAD蛋白的应用及其同源物、衍生物和活性片段在改变植物生长特性中的应用，特别是提高植物的种子的总重量、饱满种子的数量、总种子数和/或收获指数中的应用，核酸序列优选SEQ ID NO1所示的或其一部分，或能够与之杂交的序列，或编码SEQ ID NO2的氨基酸序列或其同源物、衍生物或活性片段。本发明还包括植物或植物部分(包括种子)在加工中的应用，该植物或植物部分具有改变的编码TAD蛋白的核酸的表达和/或改变的TAD蛋白的活性。这种对加工的应用包括在食品或饲料生产、酿造、在生产工业蛋白质或医药品、在生产糖或油中的应用。
如上所述，本发明的方法产生具有改变的生长特性的植物。这些有利的生长特性也可以与其它的经济学优势特性结合，例如进一步的产量增加特性、对各种应激的耐受性、改变各种结构特征的特性和/或生物化学和/或生理学性质。相应地，本发明的方法也可以用于所谓的“基因堆叠”(gene stacking)步骤。
本发明将参考下列附图进行描述，其中


图1进入克隆p69的示意图，在AttL1和AttL2位点内含有CDS0671，在pDONR201的框架内进行Gateway克隆。CDS0671为烟草BY2细胞TOB3样AAA-ATPase结构域编码序列的内在编号。该载体还含有一个细菌卡那霉素抗性盒和细菌复制起点。
图2在胚乳/幼苗优先的启动子PRO0090的调控下，在水稻中表达烟草BY2细胞TOB3样AAA-ATPase结构域基因(CDS0671)的二元载体。该载体含有来源于Ti质粒的T-DNA，被左边界(LB重复，LB TiC58)和右边界(RB重复，RB Ti C58))限定。从左边界到右边界，该T-DNA含有植物可选择标记以及可筛查的标记物，以选择和筛查转化植物；表达烟草BY2细胞TOB3样AAA-ATPase结构域基因的PRO0090-CDS0671一玉米醇溶蛋白和rbcS-deltaGA双终止子盒。该载体也含有来自pBR322的复制起点以进行细菌复制，以及一个可选择标记物(Spe/SmeR)，以用壮观霉素和链霉素进行细菌选择。
图3序列表。
实施例本发明将通过参考下列实施例加以描述，所述实施例仅用于说明的目的。
DNA操作除非另外说明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)分子克隆实验室手册，第三版，冷泉港实验室出版社，CSH，纽约)或第1和2卷的Ausubel等人(1984)，Current Protocols inMolecular Biology，Current Protocols中所描述的标准操作程序进行。植物分子工作的标准的材料和方法在Plant Molecular BiologyLabfase(1993)中描述，作者R.D.D.Croy，BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。
实施例1CDS0671的克隆从烟草中克隆TAD基因片段对同步化的烟草BY2细胞培养物(Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow-2)进行cDNA-AFLP试验，选择细胞周期调节的BY2表达序列标签进行进一步的克隆。表达序列标签用于筛选烟草cDNA文库和分离感兴趣cDNA，即编码TOB3样AAA-ATPase结构域基因的一个克隆(CDS0671)。
BY2细胞的同步化按下述方法通过用蚜栖菌素将细胞阻滞在早S期而使烟草BY2(Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow-2)培养细胞悬液同步化。Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow 2的细胞悬液按照所述的方法维持培养(Nagata等Int.Rev.Cytol.132，1-30，1992)。为进行同步化，用加入了一种DNA聚合酶α抑制药物即蚜栖菌素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；5mg/l)的新鲜培养基将培养7天的静止培养物稀释10倍。24小时后，通过用新鲜培养基洗涤数次将细胞从阻滞中释放，然后其细胞周期进程继续进行。
RNA提取和cDNA合成。
采用LiCl沉淀制备总RNA(Sambrook等，2001)，用Oligotex柱子(Qiagen，Hilden，Germany)根据厂商的说明书从500μg总RNA中提取poly(A+)RNA。从1μg的poly(A+)RNA开始，用生物素化的oligo-dT25引物(Genset，Paris，France)以及SuperscriptII(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)反转录合成第一链cDNA，用大肠杆菌连接酶(Life Technologies)、DNA聚合酶I(USB，Cleveland，OH)和RNAse-H(USB)进行链替代合成第二链。
cDNA-AFLP分析。
用500ng双链cDNA按照经调整的所述的方法进行AFLP分析(Vos等，Nucleic Acids Res.23(21)4407-4414，1995；Bachem等，PlantJ.9(5)745-53，1996)。采用的限制性内切酶为BstYI和MseI(Biolabs)，在两个分别的步骤中进行消化。在用其中一种酶进行第一次限制性消化后，通过它们生物素化的尾巴而将3′末端片段捕获于Dyna珠(Dynal，Oslo，Norway)，而其它片段被冲洗掉。在用第二种酶消化后，收集释放的限制性片段，并用作后继的AFLP步骤的模板。为进行预扩增，将没有选择性的核苷酸的MseI引物与含有T或C作为最3′端核苷酸的BstYI引物组合。PCR条件按照所述进行(Vos等，1995)。将获得的扩增混合物稀释600倍，采用P33标记的BstYI引物和Amplitaq-Gold聚合酶(Roche Diagnostics，Brussels，Belgium)将5μl用于选择性扩增。扩增产物采用Sequigel系统(Biorad)在5％聚丙烯酰胺凝胶上分离。将干胶暴露于Kodak Biomax胶片以及在Phosphor Imager(Amersham Pharmacia Biotech，Little Chalfont，UK)中扫描。
AFLP片段的鉴定。
从胶中分离并洗提相应于不同表达转录本的条带，其中有相应于SEQ ID NO 1(或CDS0671)的(部分)转录本。在与选择性扩增同样的条件下进行DNA扩增。通过用选择性BstYI引物对扩增聚合酶链反应产物的直接测序或在将片段克隆入pGEM-T easy(Promega，Madison，WI)后对单独的克隆进行测序而获得序列信息。将获得的序列通过BLAST序列比对与公共数据库中的核苷酸和蛋白进行对比(Altschul等，Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402 1997)。在可获得时，将标签序列用较长的EST或分离的cDNA序列替换，以增加发现显著的同源物的机会。相应于SEQ ID NO 1(CDS0671)的物理cDNA克隆随后从商业烟草cDNA文库中按下列方法扩增。
TAD基因片段(CDS0671)的克隆。
从分离自活性分裂、非同步化的BY2烟草细胞的poly(A+)RNA制备平均插入大小为1,400bp的cDNA文库。这些文库-插入序列被克隆入载体pCMVSPORT6.0中，后者含有attB Gateway盒(LifeTechnologies)。从该文库中选择46,000个克隆，排列于384孔的微滴定板，随后在尼龙滤纸上副本点样。用几百个放射性标记的标签(包括相应于序列CDS0671、SEQ ID NO 1的BY2标签)作为探针筛查排列的克隆。分离阳性克隆(其中具有相应于CDS0671，SEQ I NO 1的克隆)，进行测序，并与标签序列比对。在与标签杂交失败的情况下，通过PCR扩增选择相应于标签的全长cDNA采用primer 3程序设计标签特异性的引物(http//www-genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html)并用于与普通的载体引物组合扩增部分cDNA插入片段。将来自50,000、100,000、150,000和300,000cDNA克隆的DNA库用作PCR扩增的模板。接着将扩增产物从琼脂糖凝胶中分离、克隆、测序并将它们的序列与标签序列比对。
然后，通过LR反应将相应于SEQ ID NO 1核酸序列的全长cDNA从pCMVsport 6.0文库载体中克隆入pDONR201，即一个Gateway供体载体(Invitrogen，Paisley，UK)，获得进入克隆p69(
图1)。
实施例2用PRO0090-CDS0671盒进行转化的载体构建随后进入克隆p69被用于与一个用于水稻转化的目的载体(destination vector)p0830的LR反应。该载体在T-DNA界限的范围内含有作为功能元件的植物可选择标记；筛查标记以及用于与已经克隆入进入克隆的感兴趣序列在体内进行LR重组的Gateway盒。启动子PRO0090位于该Gateway盒的上游。
LR重组步骤后，得到的表达载体p74(图2)被转化入农杆菌属(Sgrobacterium)菌株LBA4404，并随后导入水稻植株中。
实施例3用PRO0129up-CDS0716转化水稻将Oryza sativa japonica cultivar Nipponbare的成熟的干燥种子脱壳。通过将种子在70％的乙醇中孵育1分钟，然后在0.2％HgCl2中30分钟进行消毒，并用消毒蒸馏水15分钟洗涤6次。接着使消毒的种子在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)中发芽。在黑暗中孵育4周后，将胚发生的来自盾片的愈伤组织切下并在相同的培养基中繁殖。2周后，通过在同样的培养基中再培养2周而繁殖愈伤组织。在共同培养3天前，将胚发生的愈伤组织片在新鲜的培养基中再培养以增进细胞分裂活性。携带二元载体p3076的农杆菌属(Agrobacterium)株系LBA4404用于共培养。用合适的抗生素在28℃将农杆菌属(Agrobacterium)株系在AB培养基中培养3天。接着收集细菌并以OD600大约为1在液体共培养基中悬浮。将悬浮液转移到培养皿，将愈伤组织在悬浮液中沉浸15分钟。接着将愈伤组织在滤纸上点干，转移到凝固的共培养基中，并在黑暗中25℃孵育3天。
然后将共培养的愈伤组织在含有2，4-D的培养基中在合适浓度的选择试剂的存在下，在28℃的黑暗中生长4周。在这期间，迅速生长的抗性愈伤组织发育。在将该材料转移到再生培养基和在光照下孵育后，释放了胚生成潜力，芽苗在下面的4到5周内发育。从愈伤组织剪除芽苗，并在含有植物激素的培养基中孵育2到3周，然后转移到土壤中。将变硬的芽苗在温室中高湿度和短日照下生长。最后在移植后3到5个月收获种子。该方法以大于50％的比例生产单位点的转化株(Aldemita和Hodges，1996，Chan等，1993，Hiei等，1994)。
实施例4.用PRO0129-CDS1585转化的转基因水稻的评估大约产生15到20株独立的T0水稻转化株。将初级T0转化株从组织培养室转移到温室，以培育和收获T1种子。其中保留T1后代按转基因的存在/缺乏分离为3∶1的7种事件。对每种事件，通过监测可筛查标记的表达而选择含有转基因(异源和同源受精卵)的大约10个T1幼苗，以及缺乏转基因的大约10个T1幼苗(空接合子)。
将选择的T1植物转移到温室中，每株植物都接受到独特的条形码(barcode)标记以将表型数据和相应植物清楚地相互连锁。选择的T1植物在10cm直径的罐中的土壤中栽培，在下列环境设置下光周期＝11.5h，光照强度＝30,000勒克斯或更大，日间温度＝28℃或更高，夜间温度＝22℃，相对湿度＝60-70％。转基因植物和相应的空受精卵在随机位置并行培育。从播种期直到成熟期，植物多次通过数字成像室。每次从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048×1536像素，16百万颜色)。
收获、装袋、并用条形码标记成熟的初级圆锥花序，然后在烤箱中37℃干燥3天。圆锥花序接着被脱粒，并收集所有种子。用吹风装置将饱满的壳与空壳分离。分离后，将两种种子用可商业化购买得到计数器计数。将空壳丢弃，饱满的壳在分析天平上称重，对种子的横截面积用数字成像进行测量。该操作步骤导致下面描述的种子相关参数(i)饱满种子数通过对分离步骤后保留的饱满壳的计数来确定饱满种子的数目。
(ii)每株植物的总种子重量通过称量从植物收获的所有饱满壳的重量来测量总种子重量。
(iii)植物的收获指数本发明的收获指数定义为总种子重量和地上面积(mm2)的比例，再乘以106。
采用图像分析软件这些参数从数字图像以自动方式获得并进行统计学分析。用经不均衡设计矫正的双因子ANOVA(离差分析)作为植物表型性状的总体评估统计模型。对所有用感兴趣基因转化的所有植物，对所有检测的参数进行F检验。进行F检验来检测所有的转化事件中的基因的效果并检验基因总的效果，这里也称为“综合基因效果”。通过F检验值确定的有意义的数据，表明了“基因”效果，表示观察到的效果不仅由基因的存在或位置引起。在F检验的情况下，真正综合基因效果的显著性的阈值设置为5％概率水平。
为检测每一事件内基因的效应，即，线性特异性效应，采用从转基因植物以及相应的空载植物中获得的数据在每一个事件内进行t检验。“空载植物”或“空载分离株”或“空受精卵”为用与转基因植物同样的方式处理的植物，但其中转基因被隔离。空载植物也可以被描述为纯合子阴性转化植物。T检验的显著性的阈值设为10％概率水平。一些事件的结果可能在该阈值之下或之上，这基于基因可能只在基因组的特定位置时才有效应的假设，该位置依赖性效应的发生率并非罕见。这种基因效应也可以称为“基因的线性效应”，p值通过比较t-分布与t值，或者比较F分布与F值而得到。然后P值给出了零假设(即转基因没有任何效应)正确的概率。
按照上述的方法测量植物生长和种子产量。发现在用TAD编码序列转化的植物中，总种子重量、饱满种子数和收获指数与没有TAD编码序列的对照植物相比有所增加。
在第一个试验中获得的数据在T2植物的第二个试验中得到证实。通过监测标记的表达筛查来自T1阳性植物的一批种子(纯合子和杂合子)。对每一选择的事件，保留杂合子种子批次进行T2评估。在每一种子批次内，在温室中培育相等数目的阳性和阴性植物进行评估。选择3株系的具有正确的表达模式的植物进行进一步分析。
T2代中总共评估了120株TAD转化植物，每一事件40株植物，其中20株为转基因阳性，20株为阴性。
实施例5.用PRO0090-CDS0671转化的转基因植物的评估结果在T1代中，5个检测种系中的4种表现出饱满种子数、总种子重量、以及收获指数的增加。对于最好的品系(品系21)，3种不同种子产量参数的增加达到大约50％，p值均较低(表2)。
表2品系21的种子产量的增加
从进行确证采用的4株阳性T1种系以及3株T2种系中计算的平均增值与空受精卵(nullizygous)植物对比的不同的种子产量参数列于表3。
表3T1和T2代的种子产量的平均增长
T1植物的结果用T2植物确定。这里各种参数也均有增加(表3)。当T1和T2植物的数据结合并重新分析，发现了对饱满种子数、总种子重量和收获指数的积极效果十分显著(见表3中的p值，右栏)。
实施例6本发明在玉米中的应用这里所述的本发明的方法也在玉米中采用。为达到这一目的，TAD基因，或其玉米直向同系物(orthologue)，在合适的启动子(优选种子和/或幼苗优先启动子)的控制下，在适合于农杆菌属(Agrobacterium)介导的玉米转化的植物转化载体中克隆。用于玉米转化的这种载体和方法在文献中已经记载(EP0604662、EP0672752、EP0971578、EP0955371、EP0558676、Ishida等人，1996；Frame等人，2002)。通过这些方法制备的转基因植物在温室中生长，进行T1种子生产。通过后代分离分析检测遗传可能性，通过定量实时PCR和/或Southern印迹分析来检测转基因的拷贝数，通过反转录PCR和/或Northern分析确定转基因的表达水平。选择具有转基因的单拷贝插入和具有转基因表达水平改变的转基因系通过自花受精或与其它种质交叉受精进行T2种子生产。使后代种子发育，在田野或温室中以非常适合玉米的条件下生长(16:8hr光周期，26-28℃日间温度和22-24℃夜间温度)，还在缺乏水、缺乏氮以及过量NaCl的条件下进行。在自花受精的情况下，用从同一母系的零分离种以及同一栽培变种的野生型植物作为对照。在交叉受精的情况下，同一栽培变种的转基因、零分离种和野生型植物与所选的亲本交叉受精，且将来自转基因交叉受精的F1植物与来自零分离种和野生型交叉受精的F1植物相对比。对自花受精或交叉受精的后代植物的不同的生物量和发育参数进行评估，包括植物高度，茎/干的厚度，叶子数目，总地上面积，叶子的绿色度，成熟时间，开花时间，抽穗数目，收获时间。也对这些种系的种子的多种参数进行测定，例如谷粒大小，每株植物的总谷粒产量，谷粒质量(淀粉含量，蛋白含量和油含量)。选择与相应的对比系相比上述的任一参数有最显著地提高的植物系进行进一步的田间测验和标记辅助的育种，目标是将田间有效的转基因品质转移到商品化的种质。在田间对玉米生长和产量相关参数的检测方法在现有技术中已经良好地确立，如将特定基因座位(例如含有转基因的位点)从一种种质转移到另一种质的技术。
权利要求
1)一种相对于相应野生型植物提高植物产量的方法，包括改变植物中分离的编码TAD蛋白或其同源物、衍生物或活性片段的核酸序列的表达和/或改变植物中TAD蛋白或其同源物、衍生物或活性片段的活性。
2)根据权利要求1的方法，其中所述的改变通过重组手段和/或化学手段实现。
3)根据权利要求1或2的方法，其中所述的改变表达包括向植物中导入编码TAD蛋白或其同源物、衍生物或活性片段的核酸序列。
4)根据权利要求1到3的任意一项的方法，其中所述的提高产量包括提高种子产量。
5)根据权利要求4的方法，其中所述的提高种子产量至少包括饱满种子数的提高。
6)根据权利要求4的方法，其中所述的提高种子产量至少包括总种子重量的提高。
7)根据权利要求4的方法，其中所述的提高种子产量至少包括收获指数的提高。
8)根据权利要求1到7任意一项的方法，其中所述的编码TAD蛋白的核酸序列来源于植物。
9)根据权利要求1到8任意一项的方法，其中所述的改变表达为与相应的野生型植物相比过表达。
10)包括下述各项的构建体a.一种能够改变编码TAD蛋白的核酸的表达和/或TAD蛋白的活性的核酸序列；b.一种或多种能够驱动(a)项的核酸序列表达的调控序列；c.一种转录终止序列。
11)根据权利要求10的构建体，其中所述的核酸编码TAD蛋白。
12)生产与相应的野生型植物相比具有增加的产量的转基因植物的方法，该方法包括a.向植物或植物细胞中导入编码TAD蛋白或其同源物、衍生物或活性片段的核酸序列或其片段；b.在促进再生和成熟植物生长的条件下培养该植物细胞。
13)与相应的野生型植物相比具有增加的产量的转基因植物，其特征在于所述的转基因植物具有改变的编码TAD蛋白的核酸序列的表达和/或改变的TAD蛋白的活性。
14)权利要求13的转基因植物，其中所述改变的表达和/或改变的活性为与相应的野生型植物相比增加的表达和/或增加的活性。
15)根据权利要求13或14的转基因植物，其中所述的植物为农作物，例如大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽或棉花，优选为单子叶植物，例如甘蔗，最优选为谷物，例如水稻、玉米、小麦、粟、大麦、高梁。
16)根据权利要求13到15的任一项的植物的转基因植物细胞、转基因植物部分，包括可收获部分，繁殖体、种子或后代。
17)编码TAD蛋白的核酸序列和/或TAD蛋白在增加产量中的应用。
18)权利要求17的应用，其中所述增加的产量包括增加的种子产量。
19)权利要求18的应用，其中所述增加的种子产量包括增加的饱满种子数、增加的总种子重量或增加的收获指数的至少一种。
20)根据权利要求13到15的任一项的转基因植物、其植物部分或种子在加工中的应用。
全文摘要
本申请涉及一种通过改变植物中编码TAD蛋白的核酸序列的表达和/或通过改变植物中TAD蛋白的活性来改变植物的生长特性的方法。本发明还涉及具有改变的生长特性的转基因植物，该植物具有编码TAD蛋白片段的核酸表达的改变。
文档编号A01H5/00GK1768144SQ200480008855
公开日2006年5月3日 申请日期2004年2月16日 优先权日2003年4月1日
发明者Y·哈茨费尔德, V·弗兰克卡德 申请人:作物培植股份有限公司