专利名称：蛋白水解酶在反刍动物饮食中增加饲料利用的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过提供包括蛋白酶的饲料添加剂或饲料组合物来增加反刍动物的纤维消化的方法。
背景技术：
反刍动物是有特殊消化器官瘤胃的哺乳动物，在瘤胃中通过厌氧性微生物(细菌，真菌，原生动物)的活性对植物纤维进行有效的消化。反刍动物主要依靠来自草和豆类的植物纤维生活，这些植物纤维由不可溶的多糖，特别是纤维素和半纤维素组成。尽管多数哺乳动物缺乏为消化这些多糖所必需的酶，但反刍动物依赖微生物作为消化剂。当食物保留在瘤胃中时，分解纤维素的微生物将纤维素水解为二糖纤维二糖和游离的葡萄糖单位。之后释放出的葡萄糖经过细菌发酵产生挥发性脂肪酸(即乙酸、丙酸和丁酸)和气体(二氧化碳和甲烷)。这些挥发性脂肪酸透过瘤胃壁进入血流中，并被反刍动物氧化作为其主要的能量来源。通过打嗝将二氧化碳和甲烷排到大气中。另外，微生物合成氨基酸和维生素。
尽管瘤胃是用于消化的有效机制，但是这个过程是缓慢的，且经常是不完全的，特别是对于较高纤维的饲料。这种低效率导致牲畜产品的成本提高，饲料资源耗费的增加，以及反刍动物生产对环境影响的增加。由于费用以及引起的对人和环境的危害，所以通过物理处理(例如研磨、蒸汽处理、颗粒化等)或化学处理(例如碱、氨、尿素、臭氧等)来提高反刍动物对纤维的利用程度并不合乎需要。
备选的处理，例如生物催化剂或酶来加速瘤胃中饲料的消化，是合乎需要的。增加饲料的消化提高了动物的生产率并且可降低生产成本。另外，通过减少动物排泄的肥料量，以及通过减少获得特定生产水平所需的饲料量，也可降低牲畜生产对环境的影响。
酶是加速或催化生物反应的蛋白，并由微生物分泌(主要是真菌或细菌)。降解植物细胞壁或“纤维”的酶被共同称为纤维素酶和半纤维素酶，这依赖于其降解的纤维级分(纤维素或半纤维素)。纤维素酶和半纤维素酶广泛用于纺织、食物、酿造、去污剂和饲料工业中。在动物营养学中，它们用于单胃动物(家禽和猪)工业；然而其在反刍动物中的应用仍未得到开发。
将酶用于反刍动物饮食的早期研究由于缺少对所用酶的表征而不得要领。另外，这种利用受到怀疑，因为认为未受保护的酶会由于高的蛋白水解活性而在瘤胃中快速失活。此外，由于瘤胃的微生物本身通过分泌与那些所添加的同样类型的酶来降解饲料，所以就认为所添加的酶将不会起到正面效果。但是，使用更新和更好表征的酶混合物的研究证实，不仅这些酶能够足够长时间地耐受瘤胃的环境以改变消化，而且添加特异性酶的混合物增加了饲料的消化和动物的性能(即牧场家畜和乳用母牛)。Beauchemin等人的美国专利号5,720,971中教导了包括某种优选比例和水平的纤维素酶和木聚糖酶的混合物的纤维消化酶添加物，以及利用其提高反刍动物的豆类饲料和谷物饲料的可消化性。
传统的反刍动物研究集中于纤维素酶和半纤维素酶，并偶尔关注于果胶酶和淀粉酶。相反，忽视了反刍动物饮食中蛋白酶的使用。可能的原因是，认为瘤胃中过多的蛋白降解是营养低效的，因为其导致动物更高的氮损失并且增加了污染。但是，本发明令人惊讶的证明了在反刍动物饮食中使用蛋白酶对于提高饲料的可消化性是有效和有益的。
发明概述本发明广泛提供了通过提供包括至少一种蛋白酶的饲料添加剂或饲料组合物来增加反刍动物纤维消化的方法。具体的，本发明提供了提高饲料或谷物饲料的可消化性的方法，该方法包括步骤提供至少一种蛋白酶；提供适合于反刍动物的饲料或谷物饲料；将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料来形成饲料组合物；以及将该组合物施用于动物，由此实现可消化性的增加。
在另一方面，本发明提供饲养反刍动物的方法，该方法包括步骤提供至少一种蛋白酶；提供饲料或谷物饲料；将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料来形成饲料组合物；以及将该组合物施用于动物，由此实现可消化性的增加。
另一方面，本发明提供处理饲料或谷物饲料来提高可消化性的方法，该方法包括步骤提供至少一种蛋白酶；提供了适合于反刍动物的饲料或谷物饲料；将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料来形成饲料组合物；以及将该组合物施用于动物，由此实现可消化性的增加。
另一方面，本发明提供生产饲料添加剂的方法，该方法包括步骤提供至少一种蛋白酶；将蛋白酶与一种或多种惰性或活性成分混合来形成饲料添加剂；以及用饲料添加剂饲喂反刍动物，或将饲料添加剂加入动物的饲料或谷物饲料，由此实现可消化性的增加。
另一方面，本发明提供为饲养反刍动物生产饲料组合物的方法，该方法包括步骤提供至少一种蛋白酶；提供饲料或谷物饲料；以及将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料以形成组合物，由此实现可消化性的增加。
另一方面，本发明提供包括与一种或多种饲料级的惰性或活性成分组合的至少一种饲料级蛋白酶的饲料添加剂，其中当应用于饲料或饲料谷物并饲喂动物时，包括的蛋白酶的量提高了饲料或饲料谷物的可消化性。另一方面，本发明提供了用于饲养反刍动物的饲料组合物，其包括与至少一种蛋白酶组合的饲料或谷物饲料，由此实现可消化性的增加。
另一方面，本发明提供蛋白酶用于饲养反刍动物的用途，包括步骤提供至少一种蛋白酶；提供饲料或谷物饲料；将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料来形成饲料组合物；以及将该组合物施用于动物，由此实现可消化性的增加。
另一方面，本发明提供蛋白酶用于生产饲料添加剂的用途，包括步骤提供至少一种蛋白酶；将蛋白酶与一种或多种惰性或活性成分混合来形成饲料添加剂；以及用饲料添加剂饲喂反刍动物，或将饲料添加剂加入动物的饲料或谷物饲料，由此实现可消化性的增加。
在另一方面，本发明提供蛋白酶用于生产饲料组合物的用途，包括步骤提供至少一种蛋白酶；提供饲料或谷物饲料；以及将蛋白酶用于饲料或谷物饲料来形成组合物，由此实现可消化性的增加。
如在此和在权利要求中所使用的，下列陈述的术语和短语具有下述定义。
“瘤胃”是指反刍动物的胃的最大区室。
“反刍动物”或“多种反刍动物”是指包括有复杂的、多室的胃的家畜、绵羊、山羊、骆驼、水牛、鹿、驯鹿、北美驯鹿和驼鹿。
“饲料材料”是指饲料或谷物饲料或其组合。
“谷物饲料”是指一般饲喂反刍动物的植物种子，其可能或可能没有包括外壳、豆荚或种皮。谷物饲料的实例包括但不限于，大麦、小麦、玉米、燕麦、高梁、黑小麦、黑麦和油料种子。
“饲料”是指不同于分离的谷物的植物的可食用部分，其能够为食草动物提供饲料，或是能够被收获用以饲喂反刍动物。
“豆类饲料”是指用作动物饲料的植物的部分，其是双子叶的植物物种，是植物学的豆科(Leguminosae)的成员。实例包括但不限于，苜蓿、红豆草、三叶草和野豌豆。该术语意味着包括包含大于50％的来自豆科的植物材料的饲料，其中余下的植物材料来自其他物种。
“混合的干草”是指豆类-草混合的干草。
“总混合配给量”缩写为TMR，是指两种或多种饲料原料的组合。
“干燥的”是指饲料材料的水分含量低于15％(w/w)。
“湿的”是指饲料材料的水分含量大于15％(w/w)。
“干物质”缩写为“DM”，是指在烘箱干燥至恒重后植物中残留的物质。
“有机物质”缩写为“OM”，是指起始饲料组合物及其灰含量之间的差异，通过在＞500℃下至少燃烧3小时而测定。
“粗蛋白”缩写为“CP”，是指根据总氮(N)含量×6.25的测定评估蛋白的含量。
“中性去污剂纤维”缩写为“NDF”，是指饲料中不溶于中性去污剂的部分，其与细胞壁成分同义，但不包括果胶。
“酸性去污剂纤维”缩写为“ADF”，是指在用酸性去污剂提取饲料材料后的不溶性残余物，或减去半纤维素的细胞壁成分。
“酸性去污剂木质素”缩写为“ADL”，是指用浓硫酸提取ADF后测定的木质素或残余物。
“半纤维素”是指在植物的细胞壁中与纤维素和木质素结合的多糖，且包括葡聚糖(除淀粉以外)、甘露聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖或聚葡糖醛酸或聚半乳糖醛酸。这确定为NDF和ADF之间的差异。
“纤维素”是指通过β-1，4键连接的葡萄糖单位组成的碳水化合物。
“表观可消化性”是指通过动物饲喂试验来确定的可消化性，其用饲料消费量减去排泄物来计算，并用饲料组合物的百分比来表达，但是并不考虑粪便中的内源性排泄。
“真实可消化性”是指饲料(feed)、饲料(forage)或营养物的实际可消化性或有效性，其用相同摄取材料的摄入和粪便中的损失之间的差额来表示，同时考虑粪便中的内源性排泄。这个术语也反映了体外的可消化性。
“挥发性脂肪酸”缩写为“VFA”，是瘤胃中微生物发酵的终产物，并且为宿主动物提供能量。VFA意味着包括但不限于，乙酸、丙酸和丁酸。支链挥发性脂肪酸缩写为“BCVFA”。
“酶混合物”是指含有至少一种蛋白酶的酶的组合物。
“纤维素酶”是指将纤维素消化为己糖单位的酶。
“蛋白酶”或“多种蛋白酶”是指能够切割肽键的酶。该术语意味着包括但不限于，半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。
“蛋白酶活性”是指蛋白酶的活性，也就是切割肽键的能力，或在pH6.0，39℃使用0.4％的偶氮酪蛋白作为底物所测定的蛋白酶活性。
“蛋白酶作为主要成分”是指以蛋白酶作为主要成分，而无需其他酶活性，尽管可能存在其他的活性。
“丝氨酸蛋白酶”是指负责催化肽键水解的酶，且其在活性位点有一个活性的丝氨酸残基。该术语是指胰蛋白酶样和枯草杆菌蛋白酶样的类型，其具有催化的His、Asp和Ser的相同空间排布，但是催化的支架完全不同。
“枯草杆菌蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶”是指其催化活性由类似于丝氨酸蛋白酶的胰蛋白酶家族的电荷中继系统提供的丝氨酸蛋白酶，但是其是独立进化发展的。参与催化的三联体(天冬氨酸、丝氨酸和组氨酸)的残基周围的序列完全不同于胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶中的类似残基周围的序列，并且可以用作此类蛋白酶特异性的信号。
“胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶”是指包括具有大约230个残基的哺乳动物酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、激肽释放酶和凝血酶，以及具有大约190个残基的细菌的酶。
“浓度”是指包括用蛋白酶处理的饲料材料的饲料组合物的每千克干物质所具有的蛋白酶活性水平。
“稳定的”是指处理后至少大约一年时间里，蛋白酶保持活性并且饲料材料没有发霉、腐烂或有其他损害。
“饲料组合物”是指将酶添加到饲料材料中形成的复合物。
“饲料级”是指饲喂动物时无毒性。
附图简述
图1是将发酵罐pH作为饲喂后的小时的函数所描绘的图表，以说明由于酶混合物的影响，在饲料添加后(0900小时)连续培养的发酵罐中pH的日波动。数值是最小二乘法平均值并且竖线显示了SEM。
发明详述本发明广泛提供通过提供包括至少一种蛋白酶的饲料添加剂或饲料组合物来提高反刍动物纤维消化的方法。具体的，本发明提供提高饲料或谷物饲料的可消化性的方法，该方法包括步骤提供至少一种蛋白酶；提供适合于反刍动物的饲料或谷物饲料；将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料来形成饲料组合物；以及将该组合物施用于动物，由此实现可消化性的提高。
另一方面，本发明提供饲养反刍动物的方法，包括步骤提供至少一种蛋白酶；提供饲料或谷物饲料；将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料来形成饲料组合物；以及将该组合物施用于动物，由此实现可消化性的提高。
另一方面，本发明提供处理饲料或谷物饲料来提高可消化性的方法，包括步骤提供至少一种蛋白酶；提供适合于反刍动物的饲料或谷物饲料；将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料来形成饲料组合物；以及将该组合物施用于动物，由此实现可消化性的提高。
另一方面，本发明提供生产饲料添加剂的方法，包括步骤提供至少一种蛋白酶；将蛋白酶与一种或多种惰性或活性成分混合来形成饲料添加剂；以及用饲料添加剂饲喂反刍动物，或将饲料添加剂加入动物的饲料或谷物饲料，由此实现可消化性的提高。
另一方面，本发明提供生产用于饲喂反刍动物的饲料组合物的方法，包括步骤提供至少一种蛋白酶；提供饲料或谷物饲料；以及将蛋白酶加入饲料或谷物饲料中来形成组合物，由此实现可消化性的提高。
另一方面，本发明提供包括与一种或多种惰性或活性成分组合的至少一种蛋白酶的饲料添加剂。另一方面，本发明提供用于饲养反刍动物的、包括与至少一种蛋白酶组合的饲料或谷物饲料的饲料组合物，由此实现可消化性的提高。
另一方面，本发明提供蛋白酶用于饲喂反刍动物的用途，包括步骤提供至少一种蛋白酶；提供饲料或谷物饲料；将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料来形成饲料组合物；以及将该组合物施用于动物，由此实现可消化性的提高。
另一方面，本发明提供蛋白酶用于生产饲料添加剂的用途，包括步骤提供至少一种蛋白酶；将蛋白酶与一种或多种惰性或活性成分混合来形成饲料添加剂；以及用饲料添加剂饲喂反刍动物，或将饲料添加剂加入动物的饲料或谷物饲料，由此实现可消化性的提高。
在另一方面，本发明提供蛋白酶用于生产饲料组合物的用途，包括步骤提供至少一种蛋白酶；提供饲料或谷物饲料；以及将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料来形成组合物，由此实现可消化性的提高。
反刍动物包括但不限于，家畜、绵羊、山羊、骆驼、水牛、鹿、驯鹿、北美驯鹿和驼鹿。饲料或谷物饲料包括但不限于，苜蓿干草和青贮饲料、草类干草和青贮饲料、混合的干草和青贮饲料、麦杆、玉米青贮饲料、玉米谷粒、大麦青贮饲料、大麦谷粒、油料种子或其组合。优选的饲料包括但不限于，苜蓿和苜蓿的混合物，包括苜蓿-草混合的饲料以及含有苜蓿的饮食。饲料或谷物饲料可以是干燥的(水分含量大于15％)或湿的(水分含量小于15％)饲料添加剂或饲料组合物包含蛋白酶作为主要成分，这样就无需其他酶活性，尽管可能存在其他活性。蛋白酶可包括但不限于半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶，以及可能是胰蛋白酶样或枯草杆菌蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶。本领域的技术人员很容易理解可通过几种不同的方法来制备所述蛋白酶。例如，可通过标准技术构建宿主生物来生产特定量的所需蛋白酶而获得蛋白酶。备选地，蛋白酶可以来自微生物或含有或能够产生这种蛋白酶的微生物的发酵。例如，蛋白酶可来自细菌，例如芽孢杆菌属(Bacillus)的物种，或来自真菌，例如木霉属(Trichoderma)的物种。备选地，也可使用商业上提供的蛋白酶，包括但不限于下列Protex 6L(GenencorInternational，Rochester，NY)。适当的丝氨酸蛋白酶包括但不限于下列具有枯草杆菌蛋白酶样特性的碱性丝氨酸内肽酶(E.C.3.4.21.62)。适宜的枯草杆菌蛋白酶包括但不限于下列从SigmaChemica1s，St.Louis，MO获得的Subti1isin Carlsberg(VIII型，Cat.No.P5380)。
提供的蛋白酶在量上足够提供特定的浓度和活性来使饲料可消化性和动物的表现最大化。应用于饲料或谷物饲料的蛋白酶的最适宜用量是0.1至20.0mL/kg消耗的饮食干物质，更优选0.5至2.5mL/kg消耗的饮食干物质，以及最优选0.75至1.5mL/kg消耗的饮食干物质。
添加到饲料或谷物饲料中的蛋白酶的量是使得所得到的饲料或谷物饲料包括足够的蛋白酶活性的量，所述蛋白酶的活性为1,000至23,000蛋白酶单位/kg干物质，更优选2,300至11,000蛋白酶单位/kg干物质，以及最优选3,300至6,800蛋白酶单位/kg干物质。蛋白酶活性是指蛋白酶切割肽键的能力，或利用0.4％的偶氮酪蛋白为底物，在pH6.0，39℃下测定的蛋白酶活性。
尽管枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶是碱性的(即，最适活性在pH7以上)，但适当的蛋白酶优选在pH5-7的范围内显示活性，其相应于瘤胃特征性的pH范围。
本发明延伸至特定的反刍动物饲料添加剂和饲料组合物。各种蛋白酶制剂对于施用于反刍动物来促进纤维消化是理想的。蛋白酶可如下配制为固体、液体、悬浮液、饲料添加剂、混合物或饲料组合物的形式。
i)固体-蛋白酶可配制为固体形式，如矿物质块、盐、颗粒、片剂、丸剂或粉末。在粉末形式中，可将蛋白酶喷洒到饲料槽中或与配给量混合。
ii)液体和悬浮液-可将蛋白酶掺入液体，通过向适宜的液体中添加冻干的或粉末状的蛋白酶，来配制溶液或悬浮液。可将蛋白酶与动物的饮用水混合或以其他用于消耗的液体形式提供。
iii)饲料添加剂-蛋白酶可以以饲料添加剂的形式施用，所述添加剂包括添加蛋白酶的冻干微生物的制剂。该饲料添加剂可以包含在动物的常规饲料中。饲料添加剂可包括与一种或多种惰性或活性成分组合的、包含每mL或克中100至500,000单位蛋白酶的、至少一种饲料级的蛋白酶。
iv)混合物-将活性成分掺入饲料材料一般通过下述步骤实现制备活性成分的预混合物，将预混合物与维生素和矿物质混合，之后将预混合物或饲料添加剂加入饲料中。蛋白酶可与本领域技术人员已知的其他活性成分混合，例如其他的酶，包括但不限于纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶、酯酶；抗生素；益生元和益生菌。包括单独的蛋白酶，或与其他活性成分组合的活性成分，可与营养物组合以提供预混合的补料。营养物包括微量营养物，例如维生素、矿物质、以及常量营养物。之后将预混合物加入饲料物质。
v)饲料组合物-可提供饲料组合物形式的蛋白酶，包括用蛋白酶处理的饲料或谷物饲料。可将干燥形式，例如作为粉末的蛋白酶与饲料或谷物饲料混合，或使用液体的形式，例如用作浸液或喷雾。
可通过加入其他的蛋白或化学试剂来稳定这些制剂。制药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂也可掺入到该制剂中。为了确保动物消耗足够的量，可加入调味剂以提供对动物看起来可口形式的蛋白酶。
可通过几种方式施用蛋白酶；然而在动物饲料中口服是优选的。蛋白酶的剂量依赖于本领域技术人员已知的很多因素，例如动物的种类、年龄和重量。可在每日一次的基础上将蛋白酶施用于动物。
为了实现饲料材料可消化性的改进，应该根据某些步骤和参数将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料。参考饲料或谷物饲料的质量，将足够的粉末或液体的蛋白酶稀释于水中来提供所需的活性水平，所述活性范围在1,000至23,000蛋白酶单位/kg干物质，更优选2,300至11,000蛋白酶单位/kg干物质，以及最优选3,300至6,800蛋白酶单位/kg干物质。
将蛋白酶，例如液体形式的蛋白酶，应用于饲料或谷物饲料来提供平均分布在饲料或谷物饲料上的水溶液。一般将蛋白酶喷洒到饲料或谷物饲料上，同时混合饲料或谷物饲料来促进蛋白酶的平均分布。
可将饲料或谷物饲料的处理与多种可在蛋白酶处理前或之后发生的一般饲料加工步骤相结合。这些加工步骤包括但不限于，将饲料干碾压、蒸汽碾压、蒸汽压片、切丁、回火、爆裂、烘烤、烹煮或破裂。当加工步骤包括高温的时候，优选在处理之后再应用蛋白酶。
如在实施例中所描述的，本发明人测定了蛋白酶提高反刍动物中饲料或谷物饲料的可消化性的惊人效果。如实施例1中所示，最初筛选了22个商业化提供的酶混合物来评估其蛋白浓度、酶活性和对天然底物的水解能力(即释放的还原糖)。
实施例2陈述了3个试验，包括反刍动物饮食中常用的饲料在体外的瘤胃内降解。重要的是，在有瘤胃流体存在时研究了酶混合物。在实验1中，鉴定了候选的酶混合物并在实验2中进一步评估其对苜蓿和玉米青贮饲料的降解效果。之后，进行相关性处理来建立这些因素之间的关系。因此选择出了两个酶混合物，并在实验3中进一步确定了其对体外饲料降解的速率和程度的影响。
如实施例3中所示，利用连续培养来检测所选择的蛋白酶混合物对总混合配给量的影响(采用新鲜的代替烘干或冻干的)。通过使用双流的连续培养发酵罐在体外模拟瘤胃代谢反应。该系统由一系列的发酵罐组成，这些发酵罐中接种有获得自瘤胃有瘘管的家畜的瘤胃流体；连续饲喂对照或待测试的饲料材料；以及用人造唾液持续输注。发酵罐保持温度、pH、厌氧条件和连续流动的消化物，其速率与消耗相同饮食的反刍动物中存在的速率相匹配。进一步的，将pH调节至产生两个不同的pH范围(5.4-6.0和6.0-6.7)来模仿当用高浓度饮食饲喂家畜时一般发生的唾液分泌减少作用(Van Soest，1994)。研究了蛋白酶混合物是否会改善饮食的可降解性，以及改善程度在低pH是否比在高pH下低。进行包括细菌计数、酶活性和化学检测的分析。在不同的pH条件下添加蛋白酶混合物增强了纤维降解并且只伴随有数值上的蛋白降解增加。总的来说，这些发现进一步表明了蛋白酶混合物在反刍动物中的作用模式是直接和间接效果的结合，对饲料和瘤胃中的微生物群体都有影响。
在实施例4中，对所选择的蛋白酶混合物的分析进一步表明了蛋白酶的类型似乎是枯草杆菌蛋白酶样的，但是对纤维消化的有益效果可能不止限于这个类型的蛋白酶。
具体的，本发明人已经发现将特异的蛋白酶混合物加入常用于反刍动物饮食的饲料中，使瘤胃中的纤维(NDF)的消化提高了最多60％(预期范围10至45％)。此外，这种纤维消化的提高并没有伴随着大量不合乎需要的瘤胃蛋白消化的增加或甲烷产生的增加。由于加入蛋白酶而导致的纤维消化的增加对于苜蓿饲料和含有一些苜蓿饲料的饮食是最大的，但这种改善并不只限于以苜蓿为基础的饮食。
预期这种量级的纤维消化提高会导致增加动物的可利用能量的量，由此提高生长率或奶生产。这些蛋白酶增加纤维消化的机制似乎与除去作为纤维溶解性微生物及其酶的结构性屏障的蛋白实体有关。在苜蓿中，有效的酶似乎通过除去妨碍可消化级分的微生物集群的结构性屏障起作用，从而增加了降解的速率。在玉米青贮饲料中，有效的酶似乎与瘤胃的酶相互作用来更加速地降解饲料。考虑到所观察到的纤维消化增加的量级，预期向反刍动物饮食中添加蛋白酶将会增加被饲喂了这些饮食的动物的生长率或奶生产。
实施例5显示了将蛋白酶添加到乳用母牛的饮食中提高了饮食的可消化性。DM、OM、N、ADF和NDF的可消化性由于蛋白酶而始终如一地提高。一般低饲料的饮食(即，商业上饲喂高产乳用母牛的一般饮食)的可消化性比高饲料的饮食的提高更多；然而这种可消化性的提高对于两种饮食都是相当大的。
实施例6显示了在实施例5中报道的饲喂研究中所使用的个别饲料的可消化性的增加。当单独处理饮食中的个别饲料成分时，蛋白酶改善了苜蓿干草的消化，但是对大麦青贮饲料却并非如此。然而，在实施例6中当将包括构成饮食的这些相同饲料饲喂母牛时，提高了总饮食的可消化性。可消化性的提高大于可仅仅通过苜蓿干草成分的可消化性改善所说明的，因为苜蓿干草只占饮食的16％。实施例5中显示的瘤胃流体酶活性的增加表明了饲喂蛋白酶提高了瘤胃的总体纤维溶解能力，显示外源性酶的作用和瘤胃微生物之间的协同。因此，通过向饮食中添加蛋白酶，提高了瘤胃消化纤维的能力。在实施例5中所观察到的消化增加不仅仅只限于饮食中的苜蓿干草成分，在实施例6中当分别温育饲料时的情况也是如此。
对本领域的技术人员显而易见的是，除了在此具体详细说明的之外，备选的方法、试剂、程序和技术可用于或很容易地进行改变来实施本发明。本发明在下列的非限制性实施例中进一步加以说明。在此所用的全部缩写是本领域使用的标准缩写。实施例中没有详细描述的具体步骤是本领域众所周知的。
实施例1-酶混合物的最初筛选使用22个商业化提供的酶混合物。对每个酶混合物分配试验代码(RT1180至RT1201)(RT1180至RT1194来自Genecor Int.，Rochester，NY；RT1195至RT1198来自Quest Int.，Naarden，荷兰；RT1199至RT1201来自DSM，Delft，荷兰)。此外，用3个已知功效的商业化酶混合物作为阳性对照；实验编码为P、PD和PB(Cargill Inc.，St Louis，MO)。
a.蛋白浓度使用Bio-Rad DC蛋白测定试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，以牛血清清蛋白作为标准来确定蛋白的量。将每个稀释的酶混合物各5μL加入微量滴定板，之后加25μL的Bio-Rad试剂A和200μL的试剂B。允许该反应在室温下进行15分钟，并使用MRX-HD平板读出器(Dynatech Laboratories Inc.，Chantilly，VA)在630nm处读取吸光度。
b.酶活性i.多糖酶活性利用在蒸馏水中的底物溶液或悬浮液(1％w/v)重复三次来测定多糖酶活性。使用木聚糖(来自桦木或来自斯卑尔脱燕麦)、羧甲基纤维素(CMC，中等粘度)、Sigmacell 50、地衣淀粉、昆布多糖和可溶淀粉(全部获得自Sigma Chemicals，St Louis，MO)来分别测定木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(EC3.2.1.91)、α-1，3-α-1，4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)、α-1，3-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)和α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)。此外，大麦α-葡聚糖、木糖葡聚糖(来自罗望子种子)和小麦阿拉伯木聚糖获得自Megazyme International Ltd.(Wicklow，爱尔兰)。
将适当稀释的酶(50μL)和底物溶液(450μL)依赖于活性温育5-60分钟，按照Wood和Bhat(1988)进行测定。简而言之，通过加入2体积的Somogyi-Nelson氏试剂(Somogyi，1952)并煮沸10分钟终止反应。在630nm用比色法测定还原糖。将1个活性单位定义为在这些测定条件下，释放1μmol当量的木糖或葡萄糖min-1g-1酶产品所需的酶量。
ii.糖苷酶活性测定的糖苷酶活性是β-D-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)、β-D-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、β-D-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)和乙酰基酯酶(EC 3.1.1.6)，其中使用1mM的对硝基苯基衍生物(Sigma Chemicals，St Louis，MO)溶液，如Wood和Bhat(1988)所描述的。除乙酰基酯酶活性以外，将100μL的每种底物(n＝6)与每种稀释的酶混合物(12.5μL)和缓冲液(37.5μL)在39℃温育30分钟。温育后，通过加入150μL的0.4M甘氨酸-NaOH缓冲液(pH10.8)终止反应并于420nm测定吸光度。对于乙酰基酯酶的测定，在温育的0、5、10和15分钟连续进行读取，并根据340nm吸光度的增加来计算活性。将1个活性单位定义为释放1μmol硝基苯酚min-1g-1酶混合物所需的酶量。
iii.蛋白酶活性用径向扩散测定方法测定蛋白酶活性(Brown，等人，2001)。将10mL在柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(0.1M，pH6.0)中制备的并含有0.5％(w/v)明胶作为底物(Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ)的1％(w/v)熔化琼脂(Fermtech Agar，EM Science，Gibbstown，NJ)倒入培养皿中(90mm直径)。含有0.01％叠氮化钠(w/v)来防止微生物生长。琼脂凝固后，使用软木塞钻孔器在每个平板上钻一个6mm的孔，加入5μL未稀释的酶混合物和20μL蒸馏水。将平板于39℃温育16小时。在温育阶段结束时，通过加入饱和的硫酸铵溶液使没有水解的明胶沉淀。两位独立的观察者使用电子数字测径器(Traceable，ModelNo 62379-531，Control Company，Friendswood，TX)测量孔周围的澄清半径区(表示被酶降解的区域)。之后，在用孔的直径校正后，以明胶降解的mm为依据表示蛋白酶的活性。
c.从天然底物释放还原糖在与酶混合物(50μL)于39℃和pH6.0(450μL的0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液)温育15分钟后，通过重复测量三次从25mg苜蓿干草或玉米青贮饲料(冻干且碾碎通过1mm的筛子)释放的还原糖来确定水解潜力。将粉末状的酶混合物用蒸馏水稀释250倍，而液态的酶混合物则稀释25倍。冷冻干燥前，将底物用蒸馏水于室温洗涤2小时来提取可溶性成分。使用只包括底物的空白进行校正。释放的还原糖以μg葡萄糖当量/mg添加的酶产品来表示。
表1显示了所有酶混合物的蛋白含量、酶活性和从苜蓿干草和玉米青贮饲料的温育释放的还原糖。在全部的酶混合物中蛋白含量是不同的，可能是由于微生物来源、生产过程及其制剂中常用的防腐剂或载体的多样性。关于酶活性，RT1197是这些检测中最为浓缩的，在17个测定的活性的14个中居于最前的5个制剂中。大体上，RT1191、RT1192、RT1196和RT1200也显示高活性。RT1191、RT1192和RT1197对于纤维素是最有活性的。RT1190、RT1191、和RT1192最为成功地从两个底物释放还原糖。
测定了酶活性和从苜蓿干草和玉米青贮饲料释放还原性糖之间的关系(表2)。蛋白含量和在还原糖释放上的酶活性的逐步回归显示，单独的蛋白分别含量解释了苜蓿干草和玉米青贮饲料的总变化的60％和59％(P＜0.001)。对于α-葡聚糖的活性解释了苜蓿干草中变化的另外的24％(P＜0.001)，但是它与还原糖释放之间的关系是负相关的。相反，从玉米青贮饲料释放的还原糖与针对斯卑尔脱燕麦木聚糖(P＜0.03)、CMC(P＜0.07)和结晶纤维素(P＜0.05)的活性是正相关的，但是与桦木木聚糖(P＜0.01)、淀粉(P＜0.001)和pNP-吡喃葡糖苷(P＜0.003)的活性却是负相关的。总的说来，所有这些变量解释了从玉米青贮饲料释放还原糖的总变化的96％。蛋白含量和来自两个底物的还原糖释放之间强烈的正相关可能暗示了浓缩的酶比更为稀释的样品作用更好，或至少是更快的，从而提供了足够的酶活性，以在所分配的短时间内使多糖断裂成为更简单的分子。
实施例2-对于具有蛋白酶活性的酶混合物的体外瘤胃降解评估进行几个实验来鉴定在存在瘤胃流体时具有较强蛋白酶活性的酶混合物，以及其对苜蓿干草或玉米青贮饲料的影响。所有实验中使用相同批次的饲料材料。称量1g苜蓿干草或玉米青贮饲料的DM(±20mg，干燥并碾碎通过2-mm的筛子)，放入125mL发酵瓶中(WheatonScientific，Mil1ville，NJ)。苜蓿干草分别含有382.0g/kg和252.4g/kg DM的NDF和ADF，而玉米青贮饲料分别含有467.4g/kg和254.1g/kg DM的NDF和ADF。
关于统计学分析，实验1是完全随机设计的，其模型包括酶处理和底物作为固定效应。由于发现了显著的酶-底物相互作用，所以对每个饲料来源(苜蓿和玉米青贮饲料)分别进行分析。使用调用PDIFF命令的SAS的混合程序(Mixed Procedures)(SAS Inst.Inc.，Cary，NC，1996)来分析平均值之间的差异。使用SAS的逐步回归程序(Stepwise Regression Procedures)使对于每个饲料来源的蛋白含量、总活性和释放的还原糖与干物质的可消化性(DMD)值相关。使用包括酶作为固定效应和实验运转作为随机效应的模型，以具有处理因素排列的完全随机设计分析实施例2和3的数据。除非另有说明，在P＜0.05指明显著性，而在P＜0.10讨论趋势。
i.实验1-添加酶混合物对苜蓿干草或玉米青贮饲料降解的效果在与瘤胃流体温育前20小时，以1.5mg/g DM饲料的比率应用22种酶混合物。使用3种商业化的酶混合物作为阳性对照P、PD和PB。取125mg的每种酶混合物溶解于50mL蒸馏水中，且取0.6mL加入每个瓶中。重复三次称量处理物。3小时后，加入已经用1M反乌头酸(Sigma Chemicals，St Louis，M0)调节到pH6.0的40mL厌氧缓冲液培养基(Goering和Van Soest，1970)，将瓶子在25℃下存储过夜。
从用以玉米青贮饲料为基础的总混合配给量饲喂的3只分泌乳汁、瘤胃有瘘管的乳用母牛收集瘤胃流体。在收集流体前4小时从进料器撤走饲料。在连续的CO2气流下使瘤胃内容物滤过4层干酪包布(cheesecloth)，并在预热的保温瓶中转移到实验室。将10mL瘤胃流体接种入已经预热到39℃的各个瓶子。只含有底物或只有瘤胃流体的对照也一式三份地包括在内。瓶子于39℃温育18小时，并立即使未降解的残余物通过预先称重过的烧结玻璃坩锅过滤(孔隙率1,100-160μm孔径)。将残余物在110℃干燥24小时，以测定表观干物质降解(DMD)，以g/kg表示。根据其相对于对照的DMD相对增加来确定酶混合物的等级排列。
表3显示了酶混合物对苜蓿干草或玉米青贮饲料的影响。对于苜蓿干草，在与瘤胃流体温育18小时后，有5个酶混合物相对于未处理的对照增加了DMD(P＜0.05)。对于玉米青贮饲料，11个酶混合物增加了DMD(P＜0.05)。有趣的是，对苜蓿干草最有效的酶混合物并不是对玉米青贮饲料也有效，暗示了酶-饲料的强特异性。
检查了与瘤胃流体温育18小时后的酶活性与苜蓿干草和玉米青贮饲料的表观DMD之间的关系(表4)。当进行蛋白浓度、总酶活性和还原糖的释放与体外瘤胃降解值的逐步多元回归时，观察到木聚糖酶(斯卑尔脱燕麦)和苜蓿DMD之间的正相关(P＝0.01)。蛋白酶活性也与苜蓿DMD正相关(P＜0.10)。但是，用该模型能解释的变化的比例少于40％。针对斯卑尔脱燕麦木聚糖的活性对于玉米青贮饲料也是显著的(P＝0.04)，但是该关系的特性是负相关的(表4)。然而还不清楚，这个负相关是否预示了玉米青贮饲料中低木聚糖酶活性和高DMD之间的因果关系。
ii.实验2-用选择的蛋白酶混合物处理或未处理的苜蓿干草或玉米青贮饲料的干物质降解动力学基于实验1的结果，选取RT1184和RT1197用苜蓿进行进一步评估，而选择RT1181和RT1183用玉米青贮饲料进行研究。采用Daisy II体外发酵系统(ANKOM Corp.，Fairport，NY)检查用这些酶混合物处理的饲料的DM和纤维降解的速率和程度。称取500mg(±20mg)苜蓿干草或玉米青贮饲料放入人造纤维袋(#F57，ANKOM Corp.)，之后将其热密封。30个袋子为一组，其中包括6个空袋子用于校正，与150mL缓冲液(pH6.0)一起，直立放入塑料容器。用于这个预处理的缓冲液是按照Goering和Van Soest(1970所述的，而未加入还原溶液。在加入瘤胃流体前20小时，向容器中以合适的比率(1.5mL/g饲料DM)加入溶解在1mL蒸馏水中的酶。轻轻震荡混合物使其适当混合并于室温(24℃)存储。按照实验1中描述的，从3头母牛收集瘤胃流体。
之后向每个ANKOM发酵罐中加入400mL瘤胃流体和1,600mL厌氧缓冲液(调节到pH6.0)。将袋子，以及塑料容器中的全部液体内含物，加入发酵罐，并使发酵在39℃持续96小时。在温育的0、6、18、30、48和96小时一式四份的移出袋子(每个时间点加上一个空袋子)，并在冷的自来水下洗涤直到过量的水澄清。使袋子在55℃下干燥48小时，并测定DMD。继而使用ANKOM200纤维分析系统(ANKOMCorp.，Fairport，NY)按照Van Soest等(1991)所述对相同的袋子顺序测定纤维(NDF和ADF)的降解。对于NDF分析，包括α-淀粉酶而将亚硫酸钠排除在外。在每个分析后，按照对DMD测定所述的方法干燥袋子。重复实验2次。
表5显示了用酶混合物处理或未处理的苜蓿干草或玉米青贮饲料的干物质降解动力学。6小时后，RT1184提高了(P＜0.05)苜蓿干草的降解(+9.0％)，以及在0小时有提高(P＜0.10)降解的趋势(+8.8％)。对于苜蓿中任何处理的6小温育后没有检测到差异。在玉米青贮饲料中，温育6小时后RT1181提高了(P＜0.05)DMD，并在30小时趋向于提高(P＜0.10)DMD。另外RT1181和RT1183在48小时提高了(P＜0.05)DMD。考虑到总体上一致认为酶提高了降解的速率而非降解的程度，后者是令人惊讶的(Colombatto，2000；Beauchemin等，2001)。但是在48小时的DMD并不是玉米青贮饲料的终点，因为在这个时间之后仍然发生着相当可观的降解(在10至14个百分比单位之间)。很可能在30-48小时的温育阶段期间活性的降解仍然在进行，这与在苜蓿干草中所观察到的相反。
表6显示了苜蓿干草的纤维(NDF、ADF和半纤维素)降解动力学。在温育的6小时RT1184几乎100％地提高了(P＜0.05)苜蓿干草的半纤维素降解，而对于相同的酶处理，在温育后6和18小时，在NDF中观察到相当大的增长(虽然是非显著的)。相反，RT1197相对于对照没有显示出差异。很明显，大部分的可利用纤维已经在48小时被降解，并且酶仅仅是提高了降解的速率。在0小时几乎没有纤维级分降解的事实，结合6小时后半纤维素降解的增加，强烈暗示了RT1184除去了一些作为降解的物理屏障而存在的成分。RT1184主要包含蛋白酶活性的事实可能暗示了蛋白是这种被除去的成分。
表7显示了玉米青贮饲料的纤维(NDF、ADF和半纤维素)降解动力学。RT1181在最高为48小时温育的所有时间都提高了NDF和ADF的降解，其值在18小时和48小时达到了显著(P＜0.05)。用相同的酶在6小时温育时提高了半纤维素的降解(P＜0.05)，并且比起对照在18小时(+17％)和48小时(11％)趋向于更高(P＜0.10)。与苜蓿干草相反，在对照和任何的酶处理物之间没有“预摄取”效果(即0小时差异)的迹象。这个发现暗示了，对于玉米青贮饲料，酶混合物仅在瘤胃水平发生作用。苜蓿似乎受益于预处理阶段，这可能是由于对细胞壁的小的结构性改变(Nsereko等，2000)，然而玉米青贮饲料的情况则不清楚。因此看来饲喂之前的酶-饲料相互作用时间的最佳长度可能依赖于饲料的类型。
表8显示了非纤维级分的降解概况，以确定可归因于纤维部分的DMD增长的比例。当将RT1184加入苜蓿时，纤维的降解解释了在最初18小时温育期间的DMD的大约三分之一。当将RT1181加入玉米青贮饲料时，纤维降解产生了至少50％的总的降解增加，并且在48小时发现的显著的DMD增长可几乎完全由纤维降解的增加来解释(86.4％)。这些发现进一步证实了RT1181和RT1184有不同的作用模式。看来源自于长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)的RT1181一旦处于体外瘤胃系统中就将其功能集中于纤维上。来自芽孢杆菌属物种的RT1184主要作用于非纤维性级分(可能是蛋白)，其在0小时温育时具明显效果，从而暗示除去了阻止微生物集群和苜蓿降解的结构性屏障。
iii.实验3-组合的所选择蛋白酶混合物或其对混合饲料的影响由于实验2显示出RT1181和RT1184分别有效降解了玉米青贮饲料和苜蓿干草，本发明人检查了这些酶混合物对混合饲料(1∶1，w/w的苜蓿干草和玉米青贮饲料)或当酶混合物组合时(“8184”)是否都有效。该方法与实验2中所描述的相同。处理组如下1.对照(无酶)2.只有RT11813.只有RT11844.RT1181和RT1184(1∶1，v/v)的组合，有两种终水平，0.5(8184低)或1.5(8184高)mL/g饲料DM。
如表9中所示，在6小时和18小时温育时，RT1184提高了(P＜0.05)苜蓿-玉米青贮饲料组合物的DMD。在0小时，它也提高了(P＜0.05)DMD，表明存在“预摄取”效果。而且，相对于对照，在0到18小时之间提高的程度保持相当恒定，这暗示了在0小时的提高并不是从最容易消化的级分(即，最初12小时温育内所降解的)的消耗获得的。如果在6或18小时的可降解性与对照相等，则将是那样的情形。有效的证据暗示了在18至30小时温育之间，降解速率开始放慢，这与体外温育时瘤胃微生物侵袭纤维级分的时间相符。
RT1184处理中纤维降解的分析表明DMD的提高伴随着在6小时的NDF降解增加(P＜0.05)，在18小时NDF降解增加的趋势(P＜0.10)，以及在6小时和18小时半纤维素降解的增加(表10)。
RT1181和RT1184的组合物显示在对照和RT1184(表9)之间的中间值，并且处理8184高趋向(P＜O.10)于在6小时温育时增加DMD，同时伴随有NDF和半纤维素降解的增加(P＜0.05)。由于RT1181没能明显提高DMD或纤维降解，所以合理推测在苜蓿-玉米的组合物中发现的所有提高都是由于RT1184的单独作用。而且，似乎RT1184施用率可减半而不会损失对纤维降解的有效性。
特别令人感兴趣的事实是，RT1184和两个RT1181及RT1184的组合物提高了(P＜0.05)DMD和NDF两者的终点(96小时)降解。这与通常当把酶加入饲料时所观察到的形成了对比(Yang等，1999；Colombatto，2000)。尽管DMD的提高可能不具有生物学的重要意义，但是获得NDF降解(对于RT1184、8184低和8184高分别为+2.0、+3.5和+3.5％)的提高程度是令人鼓舞的，特别是当包括RT1184和8184高的处理几乎在所有的温育时间都显示更高的NDF降解值。
当考虑到非纤维级分的降解概况时，发现在最初18小时温育期间观察到的RT1184增加不能只归因于纤维级分的增加，因为后一个级分解释了DMD增加的25％-50％。这些发现与实验2的相符，表明RT1184主要作用于非纤维级分，并且对混合饲料以及单独的纯的苜蓿干草有效。
实施例3-选择的蛋白酶混合物对总混合配给量的酶活性、微生物数目和纤维降解的影响检查了选择的蛋白酶混合物对总混合配给量的影响。进一步的，通过调节人造唾液的浓度来维持两个发酵的pH范围(5.4-6.0和6.0-6.7)。研究了酶混合物是否会提高饮食的可降解性，以及提高的程度是否在低pH下比高pH下更低。
a.饲料材料的制备总混合配给量(TMR)由30％苜蓿干草、30％玉米青贮饲料和40％碾压的玉米谷粒(DM基础)组成，这是在哺乳的中期到晚期饲喂乳用母牛的一般商业化饮食。饲料浓缩物比例为60∶40。将苜蓿干草碾碎并使其通过4.5-mm的筛子(Arthur H.Thomas Co.，Philadelphia，PA)，将碾压的玉米在Knifetec 1095样品粉碎机(Foss Tecator，Hgans，瑞典)中碾碎2秒来获得谷粒的部分破裂。将两种底物都在室温下储存备用。玉米青贮饲料取样自位于Lethbridge Research Centre(Lethbridge，AB)的青贮窖内的不同位置，并且于-40℃贮存备用。当需要时，使青贮饲料的样品(足够饲喂3天)解冻并且用Knifetec 1095样品粉碎机(Foss Tecator，Hgans，瑞典)新鲜碾碎10秒。碾碎的样品在4℃下最多贮存3天。每3天，通过称重单独的饲料成分来在1L的塑料容器中制备TMR。充分混合该内容物并于4℃贮存。表11概括了单独的饲料材料和TMR的化学组成。
b.酶混合物和蛋白酶活性的测定这个研究中使用了商业化可获得的酶混合物RT1184。酶混合物源自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，并含有可忽略量的纤维素酶、半纤维素酶和α-淀粉酶活性(Colombatto等人，2003)。
用0.4％(wt/vol)的偶氮酪蛋白作为底物在pH6.0和39℃测定蛋白酶活性(Bhat和Wood，1989)。简单地说，使含有0.5mL偶氮酪蛋白、0.5mL柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液和25μL酶(1∶100稀释于蒸馏水中)的反应混合物在39℃温育15分钟。通过加入80μL25％(wt/vol)的三氯乙酸使未水解的偶氮酪蛋白沉淀，之后于室温在2,040×g离心10分钟将其除去。将0.5-mL上清液样品与0.5mL的0.5M NaOH混合并且在420nm处相对于试剂空白来读取吸光度。也包括酶(无底物)和底物(无酶)的空白用于校正。1个单位的蛋白酶活性被定义为在420nm处，在同样的条件下测定的由l0μg标准蛋白酶(灰色链霉菌(Streptomyces griseus)，XIV型，sigmaChemicals，St Louis，MO)作用所测量的吸光度。酶混合物的蛋白酶活性测定为4507单位/mL(SD＝161.0，n＝5)，计算如下10μg的标准产生0.278的吸光度25μL 1∶100稀释的酶混合物溶液产生0.313的吸光度因此，如果1个蛋白酶单位是0.278，那么该溶液含有(0.313/0.278)单位＝1.126单位。为了将其转换为每mL的单位，使用稀释因数(100)和添加的量(25μL)1.126×40×100＝4,507单位/mL稀释的酶混合物。
c.体外的瘤胃降解评估本实验使用了3头泌乳的乳用母牛。按照Canadian Council onAnimal Care(1993)建立的指导方针管理母牛，并且其瘤胃装有瘘管。用与提供给发酵罐的相似饮食喂养母牛。
在4个连续阶段中使用4单元的双流连续培养系统(与Hoover等，1989所描述的相似)。在饲喂后2小时从动物收集瘤胃流体接种物。在不含氧的CO2气流下，在Waring搅拌机(Waring Product Division，New Hartford，CT)中使瘤胃内容物匀浆1分钟。之后使匀浆物滤过4层的干酪包布，并在预热的保温瓶中转移到实验室。通过15mL/分钟的速度的CO2灌输来维持厌氧环境。将人造唾液持续输注入发酵罐(McDougall，1948)。在各个阶段，两个发酵罐获得常规浓度的唾液，而另外两个发酵罐获得稀释于蒸馏水中的唾液以使获得的浓度相当于常规的60％。人造唾液含有0.2g/L的尿素以模拟再循环的氮以及0.015g的氨15N((15NH4)2SO4，10.6％的原子百分比15N；Isotec，Miamisburg，OH)。提供给每个发酵罐的15N的每日量是大约1.5mg。使液体和固体稀释率分别恒定保持在10和4.5％/小时。在0900和2100小时，以两次相等的膳食饲喂每天总计80g的DM。4个处理组如下所示
关于酶混合物的应用，取60μL酶混合物溶解于440μL蒸馏水中，并加入40g TMR(DM基础)，置于250-mL的塑料容器中，颠倒混合。向对照处理中加入500μL蒸馏水。酶混合物和饲料材料在4℃相互作用的时间段为12到24小时。
试验设计是具有4个9天时间段的4×4拉丁方，每个由用于适应的6天和用于取样的3天组成。在取样的日子，使收集容器维持4℃以阻碍微生物的作用。混合固体和流出物。使250mL样品于4℃在16,000×g离心40分钟以测定流出的DM(即，未消化的部分)。使第二个500mL的样品于4℃在16,000×g离心40分钟以获得沉淀物，使其在55℃干燥并分析灰分、氮、NDF、ADF、酸性去污剂木质素(ADL)和淀粉。
在各个取样阶段的笫1和笫2天，利用插入发酵罐的pH探头在0800至2100小时中的每小时测量发酵罐pH。在早晨的饲料供应前立即获得来自滤液的流体样品，然后在饲料供应后的2小时、5小时、8小时和12小时获得所述样品，以测定氨和挥发性脂肪酸(VFA)。用1mL的1％硫酸(v/v)使5mL过滤的液体二次抽样样品酸化以用于氨测定。用1mL的25％偏磷酸(w/v)使另一个5-mL的二次抽样样品酸化以用于VFA分析。使样品冷冻储存在-40℃直到分析。早晨饲料供应后6小时(即，1500小时)，取气体样品用于气体组成分析(CO2和CH4)。同时，从发酵罐移出2.0mL的瘤胃流体样品以定量总的和分解纤维素的细菌。获得另外的1.5mL样品用于测定酶促活性。
在各个时间段的最后一天从发酵罐分离细菌。利用Waring搅拌器(Waring Products Division，New Hatford，CT)以低速使发酵罐内容物匀浆1分钟以移出固相的细菌，然后滤过4层的干酪包布。使滤液于4℃在1,196×g离心15分钟以除去饲料颗粒和原生动物，然后于4℃在16,000×g离心40分钟以分离细菌沉淀。冷冻干燥沉淀，利用研钵和研杵进行进一步的碾碎，然后分析15N的富集。计算DM、OM和N的表观的和真实的(即，通过微生物部分校正的)消化。也测定NDF、ADF、ADL和淀粉的消化。
i.统计分析利用SAS的混合程序(Mixed procedures)(SAS Inst.Inc.，Cary，NC)，使用包括pH、酶及其相互作用作为固定效应的模型分析数据。认为发酵罐和时间段是随机效应。除非另有说明，在P＜0.05表示平均值间的差异是显著的，而在P＜0.15论述趋向。
ii.细菌计数为了定量总的活细菌，利用含有0.1％蛋白胨、0.1％刃天青、0.05％半胱氨酸和0.35％Na2CO3的培养基(Bryant和Burkey，1953)制备过滤的发酵罐内容物的厌氧连续稀释物(10-6至10-9)。将各个稀释物一式三份地接种到含有纤维二糖、木聚糖、淀粉和葡萄糖(各自为0.5mg/mL)的分开的旋管中。在39℃培养48小时后计数活的菌落。在39℃培养14天后，利用Whatman 1号滤纸作为唯一的碳水化合物来源计数具有每一稀释物(10-1至10-4)的一式三份试管中分解纤维素的细菌。使用最大概率数方法(Garthright，1998)。在统计分析前，使微生物数据进行对数变换以使误差分布标准化(Dehority等人，1989)。
iii.酶活性测定根据Colombatto等人，2003所述测定液相中的酶活性。测定内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)、β-D-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、β-D-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、蛋白酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)的活性。
木聚糖酶和内切葡聚糖酶使用浓度为10mg/mL的斯卑尔脱燕麦木聚糖和中等粘度的羧甲基纤维素(Sigma Chemicals，St Louis，MO)分别作为针对木聚糖酶和内切葡聚糖酶的底物。使40μL酶与1mL底物、0.90mL缓冲液(0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液，pH 6.0)和0.06mL蒸馏水温育。一式三份地在39℃温育60分钟(木聚糖酶)或120分钟(内切葡聚糖酶)。通过加入二硝基水杨酸试剂终止酶促反应并利用MRX-HD平板读出器(Dynatech Laboratories Inc.，Chantilly，VA)在530nm处读取吸光度。利用在相同条件下展开的标准木糖或葡萄糖曲线将吸光度值转化为还原糖。也包括空白、单独的底物(即，没有酶)和单独的酶(即，没有底物)来分别校正底物自溶和存在于酶样品中的糖。将1个活性单位定义为在这些测定条件下释放1nmol木糖或葡萄糖当量min-1所需要的酶量。
蛋白酶活性如上所述利用0.4％(w/v)的偶氮酪蛋白溶液在pH6.8测定蛋白酶活性，除了温育时间是120分钟以及温育40μL的样品。1个蛋白酶活性单位定义为在相同条件下且对于温育系列同时测定的在1μg标准蛋白酶(灰色链霉菌，XIV型，Sigma Chemicals，St Louis，MO)的作用下在420nm处测量的吸光度。由于不同的测定长度，所以使用1μg作为标准。如果使用10μg，吸光度将会过高而不落在光密度的线性范围内。
芳基-糖苷酶活性使对硝基苯基(p-NP)衍生物的原液(1mM)。底物是p-NP-β-D-纤维二糖苷、p-NP-β-D-吡喃葡糖苷、p-NP-β-D-吡喃木糖苷和p-NP-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(Sigma Chemicals，St Louis，MO)。使未稀释的酶样品(20μL)与80μL的相应底物(在pH6.0的缓冲液中制备)在39℃温育180分钟。通过加入1体积的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.4M，pH10.8)终止反应。在420nm用比色法测定对硝基苯酚的释放。1个酶活性单位定义为在这些测定条件下释放1nmol对硝基苯酚min-1所需要的酶量。
iv.化学分析进行下列化学分析
图1显示通过改变唾液浓度以获得2个不同的pH曲线所获得的pH范围。表12显示pH和酶混合物对总的活细菌和分解纤维素的细菌的影响。在低pH(P＜0.03)以及伴随酶混合物的加入(P＜0.13)，总的活细菌计数增加。在低pH(P＜0.02)分解纤素的细菌减少，但保持不受酶混合物的影响(P＞0.88)。
表13显示饲喂后6小时pH和酶混合物的影响。在低pH时内切葡聚糖酶和β-D-木糖苷酶活性是较低的(P＜0.05)，而外切葡聚糖酶活性减少(P＜0.11)。相反，在低pH时蛋白酶活性较高(P＜0.001)，主要是由于LT基团所显示的活性增加。酶混合物增加了木聚糖酶、内切葡聚糖酶和蛋白酶活性(P＜0.02)，并且增加了β-D-葡糖苷酶(P＜0.07)和外切葡聚糖酶(P＜0.12)活性。在β-D-木糖苷酶中检测到显著的pH×酶相互作用(P＜0.05)，因为酶混合物看来似乎在高pH时增加这种活性，但在低pH时降低这种活性。对于蛋白酶活性，显著的pH×酶相互作用是由于正如先前所提到的由LT基团显示的活性大量增加。只有α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶保持不受pH或酶混合物的影响。
表14显示pH和酶混合物对DM、OM、NDF、ADF和淀粉的影响。真实的OM可消化性在低pH时是较低的(P＜0.05)；然而，真实的DM可消化性只趋向于是较低的(P＜0.07)。酶混合物不影响真实的DM(P＞0.36)或OM(P＞0.27)的可消化性。在低pH时NDF和ADF消化大大地降低(P＜0.001)，而酶混合物增加NDF的可消化性(P＜0.005)。酶混合物增加半纤维素的可消化性(P＜0.001)，但不影响纤维素的可消化性。真实的粗蛋白(CP)和淀粉降解都不受处理的影响(P＞0.15)。
表15显示pH和酶混合物对VFA生产、乳酸和气体浓度的影响。在低pH时总的VFA生产较低(P＜0.006)。支链挥发性脂肪酸(BCVFA)生产也伴随低pH显示降低(P＜0.001)。高pH增加乙酸盐、丁酸盐、异丁酸盐异戊酸盐的比例(P＜0.01)，伴随有己酸显示趋向于增加(P＜0.14)。然而，高pH降低丙酸盐和戊酸盐的比例(P＜0.01)。在低pH时乙酸盐丙酸盐比率比在高pH时更低(P＜0.001)。酶混合物对任何VFA没有影响(P＞0.20)。乳酸的水平很低，并且可能不是具有生物学意义，然而观察到在高pH趋向于较高的水平(P＜0.10)。对于总的气体组成，低pH大大降低了甲烷的比例(P＜0.001)，而在高pH时CO2比例较高(P＜0.04)。
表16显示pH和酶混合物对瘤胃微生物的氮代谢的影响。在高pH时总的氮流量较高(P＜0.15)，但被酶混合物降低(P＜0.08)。细菌或饮食的N流量都不受处理的影响(P＞0.15)。氨的水平极低，而在高pH(P＜0.003)和酶混合物下较高(P＜0.07)。结果，微生物蛋白合成的效率在高pH时趋向于比在低pH时更高(P＜0.10)。
蛋白酶混合物的加入大大地增加了纤维(主要为半纤维素)的降解(与未处理的对照相比最高为43％)，伴随有干物质和蛋白降解的数值增加(分别为4.5和5.5％)。这些增加与总的微生物数目增加及其分泌酶活性增加是同时发生的。总体上，这些发现与如下假设相符，即加入这种蛋白酶除去了存在于饲料中的结构屏障，从而使得瘤胃微生物能够更快速地接近底物，其随后导致快速地微生物增殖和底物降解。在低pH时甲烷生产降低，但其不受加入蛋白酶混合物的影响。这种结果也表明蛋白酶混合物在增加纤维可消化性而不增加对环境有害的由反刍动物产生的甲烷中是有益的。进一步的，蛋白酶混合物的影响在为瘤胃内所特有的较高pH条件下是更大的。
实施例4-蛋白酶混合物中蛋白酶类型的确定进一步评估实施例3的蛋白酶混合物(RT1184)以测定混合物内的蛋白酶类型。在有或没有加入特异的蛋白酶抑制剂，例如苯甲基磺酰氟(PMSF，丝氨酸蛋白酶的抑制剂)、EDTA(金属蛋白酶的抑制剂)和对氯高汞苯甲酸(CMB，半胱氨酸蛋白酶的抑制剂)时进行蛋白酶活性测定。利用SDS-PAGE技术分辨存在于混合物中的蛋白的分子大小。为了测定负责所述影响的级分是否是热不稳定的，利用天然形式的酶(即，原态)或高压处理后的酶(即，使酶经受121℃和高压至少30分钟)进行体外降解研究。同样，进行剂量-反应研究以检验加入递增的酶水平对降解参数的影响。最后，利用电子显微镜术定性地分析来自0小时温育(即，加入瘤胃流体前的预处理)和与瘤胃流体温育18小时的样品。
抑制剂研究表明只存在1个类型的蛋白酶，即丝氨酸蛋白酶。加入1mM EDTA二钠或0.1mM CMB不抑制蛋白水解作用，而3mM PMSF抑制36％的蛋白酶，因此表明在酶混合物中存在丝氨酸蛋白酶，但没有金属蛋白酶。根据SDS-PAGE判断，酶混合物包含32kDa的主要条带，伴随有其它约22和10kDa的小条带。
体外瘤胃降解评估表明在加入瘤胃流体前2小时加入1.5μL/gDM，该酶混合物使苜蓿干草的DM降解(22小时温育)有效增加了11.8％。此外，随着施用率增加(最高为10μL/g)，降解增加到最高为21％，然而其关系是二次的(P＜0.001，R2＝0.85)。高压处理破坏了这种能力，也消除了先前从天然的(即，非高压处理的)酶所观察到的对纤维消化的所有正效应，表明该活性成分是热不稳定的。
显微镜术研究显示与瘤胃流体温育18小时后，酶混合物增加苜蓿干草的降解范围，伴随有在0小时也观察到一些影响(即，预处理效应)。推测蛋白酶混合物除去了存在于饲料中的结构屏障，因此使得瘤胃微生物能够更快速地集群和经瘤胃微生物的纤维降解。
这些发现暗示了有效成分是热不稳定的，很可能是蛋白酶活性。利用商品化纯化来源的丝氨酸蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶，获得自SigmaChemicals，St.Louis，MO)作为针对这种酶混合物的比较来进行附加的体外研究。调节施用率以提供与由这种酶混合物所提供的相似的蛋白酶活性。显示纯化的枯草杆菌蛋白酶以与这种酶混合物非常相似的方式发挥作用，进一步暗示了这种特异类型的蛋白酶在纤维消化中所观察到的增加中的作用。
因此本发明人已经发现具有枯草杆菌蛋白酶样特性的特异蛋白酶当被加入反刍动物饲料范围时增加纤维的消化。这些效应与蛋白消化中的一些增加是同时发生的，并且认为是由除去存在于饲料中的结构屏障(可能是蛋白起源的)所引起的，由此使得瘤胃微生物能够更快速地接近底物。考虑到所观察到的纤维消化中增加的量级，预期向反刍动物饮食加入蛋白酶可提高被提供这些饮食的动物的生长率或奶生产。
实施例5-向总混合配给量加入选择的蛋白酶混合物对营养物可消化性的影响检查向饲喂给乳用母牛的总混合配给量(TMR)加入选择的蛋白酶混合物的影响。此外，评估在完全的消化道中对营养物可消化性的影响。
a.动物和实验设计使用8头经产的泌乳的Holstein母牛，其中4头母牛通过手术装有瘤胃插管。在开始实验时母牛的平均授乳期为63±32(平均值±SD)。在实验开始时平均体重是690±44(平均值±SD)kg，在实验结束时为685±40(平均值±SD)kg。
实验设计是具有持续21天的各个时期(处理适应的10天和数据收集的11天)的二重的4×4拉丁方。根据母牛是否是插管的将其分配到拉丁方，并同时进行2个拉丁方试验。在各个时间段期间，母牛接收4种饮食中的1种。处理以2×2的阶乘安排(饮食中2种水平的饲料，有和没有酶补充)。
b.饮食和饲料材料的制备使用包含高或低水平饲料的2种饮食。高饲料饮食包含60％的饲料，而低饲料饮食包含34％的饲料(DM基础)。伴随有或没有外源的蛋白酶来饲喂各种饮食以形成4个如下的处理组
饮食的饲料成分由苜蓿干草和大麦青贮饲料的混合物组成。浓缩物包含蒸汽碾压的大麦、干碾压的玉米和颗粒化补料。利用Cornell-Penn-Miner系统(CPM Dairy，Version 2.0)配制饮食，并加以平衡以提供足够的可代谢能量和蛋白、维生素和矿物质以产生40kg/d的具有3.5％脂肪和3.3％蛋白的牛奶。表17显示该饮食的化学组成。
c.选择的蛋白酶混合物用于这个研究的酶产品是可商业购买的蛋白酶(Protex 6L°Genencor International，Rochester，NY)。将其以1.25ml/kg饮食DM的比率加入。这个商业化的酶产品表现具有来源于地衣芽孢杆菌菌株的蛋白酶活性的特性，其适应于当前的食品级酶的规格并且通常承认是安全的。在制备的时候将酶产品喷雾到浓缩物上。然后将该浓缩物与每日的饲料混合以产生TMR。
d.动物的饲养和管理将饮食作为TMR进行饲喂，以用于具有至少10％的每日饲料拒绝的不限量摄取。每日3次逐一地饲喂所有的母牛，并且使其自由摄取水。根据Canadian Council on Animal Care(Ottawa，ON，加拿大)的指导原则管理母牛。使母牛置于配备有橡胶垫并铺好刨花的单独拴养厩间，并且每日挤奶两次。将母牛带出到肥育场进行每日运动。
e.饲料取样每日测量和记录提供和拒绝的饲料。每周取样大麦青贮饲料、切碎的苜蓿干草和浓缩物以测定DM含量。调节饮食以进行DM含量的变化。每日收集饲喂和拒绝的TMR的样品，在55℃干燥，研磨通过1-mm的筛子(标准型号4；Arthur H.Thomas Co.，Philadelphia，PA)，并且储存用于随后的分析。
f.可消化性为了获得2g Yb/d/母牛的摄取，利用以8.7g YbCl3/d/母牛的比率直接放置到饲料的颗粒化浓缩部分上的YbCl3(Rhne-Poulenc，Inc.，Shelton，CT)来测量营养物的表观总消化道消化。从第6至第12天在日间的不同时间从所有的母牛收集粪便样品(来自直肠)。对于各头母牛合并越过取样时间的样品，在55℃干燥，研磨通过1-mm的筛子(标准型号4)，并且储存用于化学分析。从饲喂的饮食、残余物和粪便中Yb和营养物的浓度，利用下式计算表观的总消化道营养物可消化性(1)表观可消化性＝100-(100×(Ybd/Ybf)×(Nf/Nd))其中Ybd＝消耗的饮食(即，提供的残余物)中Yb的浓度，Ybf＝粪便中的Yb浓度，Nf＝粪便中营养物的浓度，以及Nd＝消耗的饮食(即，提供的残余物)中营养物的浓度。
g.瘤胃取样为了测定酶活性，在第19和20天饲喂的下午后的第0和4小时从插管的母牛取样瘤胃内容物。从瘤胃内的前背侧、前腹侧、中部腹侧、后背侧和后腹侧位置获得由母牛复合的大约1L的瘤胃内容物，并且使之滤过PeCAP聚酯筛(孔径355μm；B & S H Thompson，VilleMont-Royal，QC，加拿大)。将从全部瘤胃内容物滤出的残余固体与0.9％的NaOH(1∶1，wt/vol)组合，在搅拌器(Waring ProductsDivision，New Hartford，CT)中匀浆2分钟，使其再滤过PeCAP聚酯筛(孔径355μm)，并且与滤出的瘤胃流体混合。取样由两步过滤法产生的50毫升瘤胃流体。所有的样品储存在-20℃直到分析酶活性。
h.实验室分析进行下列分析
h.统计分析利用SASTM的混合模型程序(SAS Institute，1999，Cary，NC)统计分析所有的数据。利用解释拉丁方(即，非插管的对插管的母牛)的固定效应、饮食中饲料水平的固定效应(即，高对低饲料)、酶的固效果(即非蛋白酶对蛋白酶)、饲料和酶之间相互作用的固定效应、拉丁方内母牛的随机效应、拉丁方内时间段的随机效应，以及残留误差的模型分析可消化性数据。用相同的模型分析瘤胃酶活性的数据，但是也考虑重复的测量。认为在P＜0.05的差异是显著的。
表18表明向饮食加入蛋白酶增加了该饮食的可消化性。由于蛋白酶，DM、OM、N、ADF和NDF的可消化性始终如一地增加。低饲料饮食的可消化性提高的量级普遍大于较高饲料饮食的可消化性提高的量级，但是对于两种饮食，可消化性都有相当大的提高。
表19表明通过向饮食加入蛋白酶，增加了瘤胃流体中的酶活性。特别地，增加了木聚糖酶、内切葡聚糖酶和蛋白酶的活性。因为酶产品不包含可测量的木聚糖酶或内切葡聚糖酶活性，所以瘤胃流体中的更高活性毫无疑问是增加的微生物活性的结果。这些数据清楚表明向乳用母牛的饮食加入蛋白酶增加了瘤胃内总的纤维分解活性。因此，加入蛋白酶导致与微生物群体的协同作用。瘤胃纤维消化能力的增加解释了表18中所存在的饲料消化的增加。
实施例6-蛋白酶对饲料体外可消化性的影响利用来自实施例5中的体内研究的饲料进行这个研究。进行该研究来测定加入蛋白酶产品对体外测量的饲料可消化性的影响。
利用与Mauricio等人(1999)所描述的系统相似的系统测量饲料的体外瘤胃气体产生。利用KnifetecTM1095样品粉碎机(FossTecator，Hgans，瑞典)将用于实施例5中所描述的体内实验的苜蓿干草和大麦青贮饲料的新鲜样品粉碎10秒。然后称量近似等于1gDM的粉碎饲料样品，放入8个重复的气密血清培养小瓶中(125ml容量)。使用用于实施例5的相同的可商业购买的蛋白酶产品(Protex6LGenencor International，Rochester，NY)。在以用于实施例5的相同施用率用瘤胃流体接种前20个小时，施加1.25μl/g DM饲料的比率的酶。向试管加入酶后3小时，加入如Goering和Van Soest(1970)概括所制备的，并利用1M反乌头酸(Sigma Chemicals)调节至pH6.0的40ml厌氧的缓冲培养基，并将该小瓶在20℃储存过夜。
饲喂后4小时(1100小时)从分泌乳汁的乳用母牛获得瘤胃流体体，所述母牛用由大麦青贮饲料、切碎的苜蓿干草、碾压的玉米谷粒和浓缩物组成的饮食饲喂。如实施例5所描述的收集滤过的瘤胃流体，在密封的预热容器中转运至实验室并且保持在39℃水浴中。将接种物分配(每小瓶10ml)到已经在培养箱中加温到39℃并且用无氧的CO2冲洗的培养小瓶中。加样和温育48小时后立即用14mm的丁基橡胶塞加包铝的卷曲帽密封该小瓶。也以8个重复的方式温育阴性对照(瘤胃流体加上单独的缓冲液和瘤胃流体加上缓冲液和酶产品)。这些对照用来校正直接由接种物所产生的气体释放和发酵残余物。接种后通过插入附着于连接到可视显示器(Data Track，Christchurch，英国)的压力传感器(T443A型，Bailey和Mackey，Birmingham，英国)的23号(0.6mm)针在2、4、6、8、10、12、18、24、30、36、42和48小时测量由底物发酵产生的顶隙气体。然后除去传感器只原地留下针以容许排气。利用由Mauricio等人(1999)所报道的等式(气体体积＝0.18+3.697×气体压力+0.0824×气体压力2)，使用通过所温育的底物有机物质和来自阴性对照的气体释放的量校正的压力值来产生体积估算。在移出后，将小瓶置于4℃的冷柜2小时以终止发酵，并过滤。
表20表明向苜蓿干草加入蛋白酶在温育2小时开始增加气体的生产，并且在温育的自始至终都保持这种增加。增加的气体生产表明微生物消化的改善。相反，加入蛋白酶对大麦青贮饲料的气体生产没有影响。
参考文献Beauchemin，K.A.，Morgavi，D.P.，McAllister，T.A.，Yang，W.Z.and Rode，L.M.(2001)The useoffeed enzymes in rnminant diets.In Recent Advances in Animal Nutrition.P.C.Garnsworthyand P.J.Wiseman，eds.Nottingham University Press，Nottingham，UK.
Brown，R.L.，Chen，Z.Y.，Cleveland，T.E.，Cotty，P.J.and Cary，J.W.(2001)Variationin in vitro α-amylase and protease activity is related to the virulence of Aspergillus flavus isolates.J.FoodProd.64401-404.
Bryant，M.P.andBurkey，L.A.(1953)Cultural methods and some characteristics of some of the morenumerous groups of bacteria in the bovine rumen.J.Dairy Sci.36205-207.
Colombatto，D.(2000)Use of enzymes to improve fibre utilization in ruminantsa biochemical and invitro rumen degradation assessment.PhD.Thesis.The University of Reading.Reading，UK.
Colombatto，D.，Morgavi，D.P.，Furtado，A.F.and Beauchemin，K.A.(2003)Screening of fibrolyticenzymes as additives for ruminant dietsrelationship between enzyme activities and the in vitrodegradation of enzyme-treated forages.Proc.Brit.Soc.Anim.Sci.BSAS，York，UK，p.210.
Colombatto，D.，Mould，F.L.，Bhat，M.K.，Morgavi，D.P.，Beauchemin，K.A.and Owen，E.(2003)Influence of fibrolytic enzymes on the hydrolysis and fermentation of pure cellulose and xylanby mixed ruminal microorganisms in vitro.Proc.Brit.Soc.Anim.Sci.BSAS，York，UK，p.208.
Dehority，B.A.，Tirabasso，P.A.and Grifo Jr.，A.P.(1989)Mostprobable-number procedures forenumerating ruminal bacteria，including the simultaneous estimation of total and cellulolyticnumbers in one medium.Appl.Environ.Microbiol.552789-2792.
Goering，H.K.and Van Soest，P.J.(1970)Forage Fiber AnalysesApparatus，Reagents，Proceduresand Some Applications.Agri.Handbook No.379，ARS-USDA，Washington，DC.
Hoover，W.H.，Miller，T.K.，Stokes，S.R.and Thayne，W.V.(1989)Effects of fish meals on ruminalbacterial fermentation in continuous culture.J.Dairy Sci.722991-2998.
Mauricio，R.M.，Mould，F.L.，Dhanoa，M.S.，Owen，E.，Channa，K.S.and Theodorou，M.K.(1999)A semi-automated in vitro gas production technique for ruminant feedstuff evaluation.Anim.Feed Sci.Technol.79321-330.
McDougall，E.I.(1948)Studies on ruminant saliva.1.The composition and output of sheep’s saliva.Biochem.J.4399-109.
Nsereko，V.L.，Morgavi，D.P.，Rode，L.M.，Beauchemin，K.A.and McAllister，T.A.(2000)Effectsof fungal enzyme preparations on hydrolysis and subsequent degradation of alfalfa hay fiber bymixed rumen microorganisms in vitro.Anim.Feed Sci.Technol.88153-170.
Rode，L.M.，Yang，W.Z.and Beauchemin，K.A.(1999)Fibrolytic enzyme supplements for dairycows in early lactation.J.Dairy Sci.822121-2126.
Van Soest，P.J.，Robertson，J.B.and Lewis，B.A.(1991)Methods for dietary fiber，neutral detergentfiber，and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition.J.Dairy Sci.743583-3597.
Van Soest，P.J.(1994)Nutritional Ecology of the Ruminant.Cornell University Press，Ithaca，NewYork.
Verdouw，H.(1978)Ammonia determination based on indophenol formation with sodium salicylate.Water Res.12399-402.
Wood，T.M.and Bhat，M.K.(1988)Methods for measuring cellulase activities.In Methods ofEnzymology.W.A.Wood and S.T.Kellogg，eds.Academic Press，Inc.，London，UK，pp.87-112.
Yang，W.Z.，Beauchemin，K.A.and Rode，L.M.(1999)Effects of an enzyme feed additive on extentof digestion and milk production of lactating dairy cows.J.Dairy Sci.82391-403.
专利文献Beauchemin，K.A.，Rode，L.和Sewalt，V.J.Enzymeadditives for ruminant feeds.美国专利号5,720,971，1998年2月24日授权。
本说明书中提及的所有出版物是本发明所属领域的技术水的指示。在此引入所有的出版物作为参考的程度与每个单独的出版物被具体且单独地引入作为参考的程度相同。
尽管上述发明已经通过例证说明和实施例的方式进行了相当详细的描述，但为了清楚和理解起见，可以理解可进行某些改变和修饰而不背离正如下列权利要求所定义的本发明的范围或精神。
表1.蛋白浓度(mg/mL)、酶活性(μmol糖或对硝基苯酚min-1g-1或mm)及由苜蓿干草(AH)和玉米青贮饲料(CS)与酶产品温育释放的还原糖
xOSX＝木聚糖酶(斯卑尔脱燕麦)；BX＝木聚糖酶(桦木)；CMC＝内切葡聚糖酶；SCELL＝外切葡聚糖酶；BG＝β-葡聚糖酶；XG＝木糖葡聚糖；AGAL＝阿拉伯半乳聚糖；LICH＝地衣酶；AX＝阿拉伯木聚糖；AMYL＝α-淀粉酶；LAM＝昆布多糖酶；ES＝酯酶；AF＝阿拉伯呋喃糖苷酶；GPY＝β-葡糖苷酶；XPY＝β-木糖苷酶；PRT＝蛋白酶；GAPY＝半乳糖苷酶。
yRS＝还原糖，其通过一式三份地将25mg冻干底物于39℃与每一种酶产品温育15分钟后确定。
z使用Promote N.E.T(Lot MO-E100)。
表2.酶活性与从苜蓿甘草和玉米青贮饲料释放还原糖之间的关系
表3.与瘤胃流体温育18小时后添加酶(1.5μL/g DM)对苜蓿干草或玉米青贮饲料表观DMD(g/kg)的影响
w根据DMD相对分级。
xND＝未确定。
y，z分别在P＜0.05和P＜0.01上与对照不同。
表4.与瘤胃流体温育18小时后，酶活性(μmol木糖min-1g-1)与苜蓿干草和玉米青贮饲料的表观DMD(g/kg)之间的关系
表5.未处理或用1.5μL/g DM的酶产品处理的苜蓿干草或玉米青贮饲料的干物质降解(g/kg)动力学
a，b在底物和列内，无共同上标的平均值有差异(P＜0.05)。
表6.未处理或用1.5μL/g DM的酶产品处理的苜蓿干草的纤维降解动力学
a，b在级分和列内，无共同上标的平均值有差异(P＜0.05)。
表7.未处理或用1.5μL/g DM的酶产品处理的玉米青贮饲料的纤维降解动力学
a，b，c在级分和列内，无共同上标的平均值有差异(P＜0.05)。
表8.非纤维级分(100-NDF)的降解概况(g/kg DM)，以及归因于NDF降解的处理RT1184和RT1181的DMD中的百分比增加
表9.未处理或用酶产品处理的苜蓿干草和玉米青贮饲料混合物的干物质降解(g/kg)动力学
a，b在列内，无共同上标的平均值有差异(P＜0.05)。
y对照＝未添加酶；RT1181和RT1184＝以1.5μL/g DM添加酶；8184低＝以0.5μL/g DM添加的RT1181和RT1184的混合物(1∶1)；8184高＝以1.5μL/g DM添加的RT1181和RT1184的混合物(1∶1)。
表10.未处理或用酶产品处理的苜蓿干草和玉米青贮饲料的混合物的纤维降解(g/kg)动力学
a，b，c在级分和列内，无共同上标的平均值有差异(P＜0.05)。
y对照＝未添加酶；RT1181和RT1184＝以1.5μL/g DM添加酶；8184低＝以0.5μL/g DM添加的RT1181和RT1184的混合物(1∶1)；8184高＝以1.5μL/g DM添加的RT1181和RT1184的混合物(1∶1)。
表11.饲料和总混合配给量(TMR)的化学组成(g/kg DM)
a总混合配给量(DM基础)由30％苜蓿干草、30％玉米青贮饲料和40％碾压的玉米组成。
表12.在给发酵罐提供饲料后6小时的连续培养中pH和添加酶对总微生物(TMC)和分解纤维素的细菌计数(CBP)的影响
aHC＝高pH和对照TMR；HT＝高pH和用酶处理的TMR；LC＝低pH和对照TMR；LT＝低pH和用酶处理的TMR
表13.供给饲料后6小时pH和添加酶对酶活性的影响
aHC＝高pH和对照TMR；HT＝高pH和用酶处理的TMR；LC＝低pH和对照TMR；LT＝低pH和用酶处理的TMRbXY＝木聚糖酶；END＝内切葡聚糖酶；EXO＝外切葡聚糖酶；GPY＝β-D-葡糖苷酶；XPY＝β-D-木糖苷酶；PROT＝蛋白酶；AF＝α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。
cXY和END表示为nmol木糖或葡萄糖min-1mL-1；EXO、GPY、XPY和AF表示为nmol对硝基苯酚min-1mL-1；PROT表示为与在相同的实验条件下从1μg标准蛋白酶(来自灰色链霉菌)的作用测量的吸光度等价。
表14.在连续培养中pH和添加酶对DM、OM、纤维和淀粉降解的影响
aHC＝高pH和对照TMR；HT＝高pH和用酶处理的TMR；LC＝低pH和对照TMR；LT＝低pH和用酶处理的TMR
表15.在连续培养中pH和添加酶对VFAa、乳酸和气体浓度的影响
a提供的值是贯穿全天的4次测定的平均值(在早晨给发酵罐提供饲料后0，2，5和8小时)bHC＝高pH和对照TMR；HT＝高pH和用酶处理的TMR；LC＝低pH和对照TMR；LT＝低pH和用酶处理的TMR
表16.在连续培养中缓冲液pH和酶对瘤胃微生物的N代谢的影响
aHC＝高pH和对照TMR；HT＝高pH和用酶处理的TMR；LC＝低pH和对照TMR；LT＝低pH和用酶处理的TMRbEMPS＝微生物蛋白合成效率(gN/kg真实消化的OM)
表17.饮食的成分和化学组成(DM基础)
1存在于颗粒补料中的成分2基于来自NRC(2001)的值表18.泌乳的母牛总消化道中的干物质摄取和养分的可消化性，向所述母牛饲喂了具有(+P)或不具有(-P)蛋白酶补充的高或低饲料(F)
F＝饮食中饲料的水平(高对低饲料)P＝蛋白酶(无蛋白酶对蛋白酶)F×P＝F和P的相互作用NS＝不显著(P＞0.15)DM＝干物质；DNF＝中性去污剂纤维；ADF＝酸性去污剂纤维a，b，c相同行中具有不同上标的平均值有差异(P＜0.05)
表19.从泌乳的母牛滤过的瘤胃流体中的酶活性，向所述母牛饲喂具有或不具有蛋白酶补充的高或低饲料TMR饮食
F＝饮食中饲料的水平(高对低饲料)P＝蛋白酶(无蛋白酶对蛋白酶)F×P＝F和P的相互作用XY＝木聚糖酶；END＝内切葡聚糖酶；EXO＝外切葡聚糖酶；GPY＝β-D-葡糖苷酶；XPY＝β-D-木糖苷酶；PROT＝蛋白酶；AF＝α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。
XY和END表示为nmol木糖或葡萄糖min-1mL-1；EXO、GPY、XPY和AF表示为nmol对硝基苯酚min-1mL-1；PROT表示为每小时每毫升水解的偶氮酪蛋白NS＝不显著(P＞0.15)a，b相同行中具有不同上标的平均值有差异(P＜0.05)
表20.与或不与蛋白酶温育的苜蓿干草和大麦青贮饲料的累积气体生产(ml/g OM)概况
F＝饲料来源(苜蓿干草对大麦青贮饲料)，P＝蛋白酶(无蛋白酶对蛋白酶)，和F×P＝F和P的相互作用3NS＝不显著(P＞0.15)a，b，c相同行中具有不同上标的平均值有差异(P＜0.05)
权利要求
1.一种增加饲料或谷物饲料的可消化性的方法，包括下列步骤a)提供至少一种蛋白酶；b)提供适于反刍动物的饲料或谷物饲料；c)将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料以形成饲料组合物；以及d)将该组合物施用于动物，由此实现可消化性的增加。
2.根据权利要求1的方法，其中饲料或谷物饲料选自苜蓿干草及青贮饲料、草类干草及青贮饲料、混合干草及青贮饲料、麦杆、玉米青贮饲料、玉米谷粒、大麦青贮饲料、大麦谷粒、油料种子或其组合。
3.根据权利要求1的方法，其中饲料是苜蓿饲料或苜蓿-草饲料的混合物。
4.根据权利要求1的方法，其中蛋白酶来源于细菌或真菌。
5.根据权利要求4的方法，其中细菌是芽孢杆菌属物种。
6.根据权利要求4的方法，其中真菌是木霉属物种。
7.根据权利要求4的方法，其中蛋白酶选自半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。
8.根据权利要求7的方法，其中蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
9.根据权利要求4的方法，其中蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶样的。
10.根据权利要求4的方法，其中将蛋白酶配制为固体、液体或悬浮液。
11.根据权利要求10的方法，其中将蛋白酶配制为矿物质块、盐、颗粒、片剂、丸剂或粉末。
12.根据权利要求10的方法，其中蛋白酶是与一种或多种惰性或活性成分组合的，所述成分选自载体；稀释剂；调味剂；赋形剂；选自纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶和酯酶的酶；抗生素；益生元；益生菌；微量营养物；维生素；矿物质和常量营养物。
13.根据权利要求10的方法，其中将蛋白酶以0.1至20mL/kg消耗的饮食干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
14.根据权利要求10的方法，其中将蛋白酶以0.5至2.5mL/kg消耗的饮食干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
15.根据权利要求10的方法，其中将蛋白酶以0.75至1.5mL/kg消耗的饮食干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
16.根据权利要求10的方法，其中蛋白酶的量包括1,000至23,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
17.根据权利要求10的方法，其中蛋白酶的量包括2,300至11,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
18.根据权利要求10的方法，其中蛋白酶的量包括3,300至6,800蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
19.根据权利要求16至18中任何一项的方法，其中利用偶氮酪蛋白作为底物在pH6.0和39℃测定蛋白酶活性。
20.一种饲喂反刍动物的方法，包括下列步骤a)提供至少一种蛋白酶；b)提供饲料或谷物饲料；c)将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料以形成饲料组合物；以及d)将该组合物施用于动物，由此实现可消化性的增加。
21.根据权利要求20的方法，其中饲料或谷物饲料选自苜蓿干草及青贮饲料、草类干草及青贮饲料、混合干草及青贮饲料、麦杆、玉米青贮饲料、玉米谷粒、大麦青贮饲料、大麦谷粒、油料种子或其组合。
22.根据权利要求20的方法，其中饲料是苜蓿饲料或苜蓿-草饲料的混合物。
23.根据权利要求20的方法，其中蛋白酶来源于细菌或真菌。
24.根据权利要求23的方法，其中细菌是芽孢杆菌属物种。
25.根据权利要求23的方法，其中真菌是木霉属物种。
26.根据权利要求23的方法，其中蛋白酶选自半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。
27.根据权利要求26的方法，其中蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
28.根据权利要求23的方法，其中蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶样的。
29.根据权利要求23的方法，其中将蛋白酶配制为固体、液体或悬浮液。
30.根据权利要求29的方法，其中将蛋白酶配制为矿物质块、盐、颗粒、片剂、丸剂或粉末。
31.根据权利要求29的方法，其中蛋白酶是与一种或多种惰性或活性成分组合的，所述成分选自载体；稀释剂；调味剂；赋形剂；选自纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶和酯酶的酶；抗生素；益生元；益生菌；微量营养物；维生素；矿物质和常量营养物。
32.根据权利要求29的方法，其中将蛋白酶以0.1至20mL/kg消耗的饮食干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
33.根据权利要求29的方法，其中将蛋白酶以0.5至2.5mL/kg消耗的饮食干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
34.根据权利要求29的方法，其中将蛋白酶以0.75至1.5mL/kg消耗的饮食干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
35.根据权利要求29的方法，其中蛋白酶的量包括1,000至23,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
36.根据权利要求29的方法，其中蛋白酶的量包括2,300至11,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
37.根据权利要求29的方法，其中蛋白酶的量包括3,300至6,800蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
38.根据权利要求35至37中任何一项的方法，其中利用偶氮酪蛋白作为底物在pH6.0和39℃测定蛋白酶活性。
39.一种处理饲料或谷物饲料以增加可消化性的方法，包括下列步骤a)提供至少一种蛋白酶；b)提供适于反刍动物的饲料或谷物饲料；c)将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料以形成饲料组合物；以及d)将该组合物施用于动物，由此实现可消化性的增加。
40.根据权利要求39的方法，其中饲料或谷物饲料选自苜蓿干草及青贮饲料、草类干草及青贮饲料、混合干草及青贮饲料、麦杆、玉米青贮饲料、玉米谷粒、大麦青贮饲料、大麦谷粒、油料种子或其组合。
41.根据权利要求39的方法，其中饲料是苜蓿饲料或苜蓿-草饲料的混合物。
42.根据权利要求39的方法，其中蛋白酶来源于细菌或真菌。
43.根据权利要求42的方法，其中细菌是芽孢杆菌属物种。
44.根据权利要求42的方法，其中真菌是木霉属物种。
45.根据权利要求42的方法，其中蛋白酶选自半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。
46.根据权利要求45的方法，其中蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
47.根据权利要求42的方法，其中蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶样的。
48.根据权利要求42的方法，其中将蛋白酶配制为固体、液体或悬浮液。
49.根据权利要求48的方法，其中将蛋白酶配制为矿物质块、盐、颗粒、片剂、丸剂或粉末。
50.根据权利要求48的方法，其中蛋白酶是与一种或多种惰性或活性成分组合的，所述成分选自载体；稀释剂；调味剂；赋形剂；选自纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶和酯酶的酶；抗生素；益生元；益生菌；微量营养物；维生素；矿物质和常量营养物。
51.根据权利要求48的方法，其中将蛋白酶以0.1至20mL/kg消耗的饮食干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
52.根据权利要求48的方法，其中将蛋白酶以0.5至2.5mL/kg消耗的饮食干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
53.根据权利要求48的方法，其中将蛋白酶以0.75至1.5mL/kg消耗的饮食干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
54.根据权利要求48的方法，其中蛋白酶的量包括1,000至23,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
55.根据权利要求48的方法，其中蛋白酶的量包括2,300至11,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
56.根据权利要求48的方法，其中蛋白酶的量包括3,300至6,800蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
57.根据权利要求54至56中任何一项的方法，其中利用偶氮酪蛋白作为底物在pH6.0和39℃测定蛋白酶活性。
58.一种生产饲料添加剂的方法，包括下列步骤a)提供至少一种蛋白酶；b)将该蛋白酶与一种或多种惰性或活性成分混合以形成饲料添加剂；以及c)用饲料添加剂饲喂反刍动物或将饲料添加剂加入动物的饲料或谷物饲料中，由此实现可消化性的增加。
59.根据权利要求58的方法，其中饲料或谷物饲料选自苜蓿干草及青贮饲料、草类干草及青贮饲料、混合干草及青贮饲料、麦杆、玉米青贮饲料、玉米谷粒、大麦青贮饲料、大麦谷粒、油料种子或其组合。
60.根据权利要求58的方法，其中饲料是苜蓿饲料或苜蓿-草饲料的混合物。
61.根据权利要求58的方法，其中蛋白酶来源于细菌或真菌。
62.根据权利要求61的方法，其中细菌是芽孢杆菌属物种。
63.根据权利要求61的方法，其中真菌是木霉属物种。
64.根据权利要求61的方法，其中蛋白酶选自半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。
65.根据权利要求64的方法，其中蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
66.根据权利要求61的方法，其中蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶样的。
67.根据权利要求61的方法，其中将蛋白酶配制为固体、液体或悬浮液。
68.根据权利要求67的方法，其中将蛋白酶配制为矿物质块、盐、颗粒、片剂、丸剂或粉末。
69.根据权利要求67的方法，其中蛋白酶是与一种或多种惰性或活性成分组合的，所述成分选自载体；稀释剂；调味剂；赋形剂；选自纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶和酯酶的酶；抗生素；益生元；益生菌；微量营养物；维生素；矿物质和常量营养物。
70.根据权利要求67的方法，其中将蛋白酶以0.1至20mL/kg消耗的饮食干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
71.根据权利要求67的方法，其中将蛋白酶以0.5至2.5mL/kg消耗的饮食干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
72.根据权利要求67的方法，其中将蛋白酶以0.75至1.5mL/kg消耗的饮食干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
73.根据权利要求67的方法，其中蛋白酶的量包括1,000至23,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
74.根据权利要求67的方法，其中蛋白酶的量包括2,300至11,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
75.根据权利要求67的方法，其中蛋白酶的量包括3,300至6,800蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
76.根据权利要求73至75中任何一项的方法，其中利用偶氮酪蛋白作为底物在pH6.0和39℃测定蛋白酶活性。
77.一种生产用于饲喂反刍动物的饲料组合物的方法，包括下列步骤a)提供至少一种蛋白酶；b)提供饲料或谷物饲料；以及c)将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料以形成组合物，由此实现可消化性的增加。
78.根据权利要求77的方法，其中饲料或谷物饲料选自苜蓿干草及青贮饲料、草类干草及青贮饲料、混合干草及青贮饲料、麦杆、玉米青贮饲料、玉米谷粒、大麦青贮饲料、大麦谷粒、油料种子或其组合。
79.根据权利要求77的方法，其中饲料是苜蓿饲料或苜蓿-草饲料的混合物。
80.根据权利要求77的方法，其中蛋白酶来源于细菌或真菌。
81.根据权利要求80的方法，其中细菌是芽孢杆菌属物种。
82.根据权利要求80的方法，其中真菌是木霉属物种。
83.根据权利要求80的方法，其中蛋白酶选自半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。
84.根据权利要求83的方法，其中蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
85.根据权利要求80的方法，其中蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶样的。
86.根据权利要求80的方法，其中将蛋白酶配制为固体、液体或悬浮液。
87.根据权利要求86的方法，其中将蛋白酶配制为矿物质块、盐、颗粒、片剂、丸剂或粉末。
88.根据权利要求86的方法，其中蛋白酶是与一种或多种惰性或活性成分组合的，所述成分选自载体；稀释剂；调味剂；赋形剂；选自纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶和酯酶的酶；抗生素；益生元；益生菌；微量营养物；维生素；矿物质和常量营养物。
89.根据权利要求86的方法，其中将蛋白酶以0.1至20mL/kg消耗的饮食干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
90.根据权利要求86的方法，其中将蛋白酶以0.5至2.5mL/kg消耗的饮食干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
91.根据权利要求86的方法，其中将蛋白酶以0.75至1.5mL/kg消耗的饮食干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
92.根据权利要求86的方法，其中蛋白酶的量包括1,000至23,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
93.根据权利要求86的方法，其中蛋白酶的量包括2,300至11,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
94.根据权利要求86的方法，其中蛋白酶的量包括3,300至6,800蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
95.根据权利要求92至94中任何一项的方法，其中利用偶氮酪蛋白作为底物在pH6.0和39℃测定蛋白酶活性。
96.一种饲料添加剂，包括与一种或多种饲料级的惰性或活性成分组合的至少一种饲料级的蛋白酶，其中包括的所述蛋白酶的量为当被应用于饲料或饲料谷物以及被饲喂给动物时增加饲料或饲料谷物的可消化性的量。
97.根据权利要求96的添加剂，其中该蛋白酶来源于细菌或真菌，其中与一种或多种饲料级的惰性或活性成分组合的蛋白酶的量为每mL或每克中100至500,000单位蛋白酶。
98.根据权利要求97的添加剂，其中细菌是芽孢杆菌属物种。
99.根据权利要求97的添加剂，其中真菌是木霉属物种。
100.根据权利要求97的添加剂，其中蛋白酶选自半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。
101.根据权利要求100的添加剂，其中蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
102.根据权利要求97的添加剂，其中蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶样的。
103.根据权利要求97的添加剂，其中一种或多种惰性或活性成分选自载体；稀释剂；调味剂；赋形剂；选自纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶和酯酶的酶；抗生素；益生元；益生菌；微量营养物；维生素；矿物质和常量营养物。
104.根据权利要求96的添加剂，其中蛋白酶存在于添加剂中以产生0.1至20mL/kg消耗的饮食干物质的量，其中干物质是饲料或谷物饲料。
105.根据权利要求96的添加剂，其中蛋白酶存在于添加剂中以产生0.5至2.5mL/kg消耗的饮食干物质的量，其中干物质是饲料或谷物饲料。
106.根据权利要求96的添加剂，其中蛋白酶存在于添加剂中以产生0.75至1.5mL/kg消耗的饮食干物质的量，其中干物质是饲料或谷物饲料。
107.根据权利要求96的添加剂，其中当被应用于饲料或谷物饲料时，存在的蛋白酶的量产生1,000至23,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
108.根据权利要求96的添加剂，其中当被应用于饲料或谷物饲料时，存在的蛋白酶的量产生2,300至11,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
109.根据权利要求96的添加剂，其中当被应用于饲料或谷物饲料时，存在的蛋白酶的量产生3,300至6,800蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
110.根据权利要求107至109中任何一项的添加剂，其中利用偶氮酪蛋白作为底物在pH6.0和39℃测定蛋白酶活性。
111.根据权利要求104至109中任何一项的添加剂，其中饲料或谷物饲料选自苜蓿干草及青贮饲料、草类干草及青贮饲料、混合干草及青贮饲料、麦杆、玉米青贮饲料、玉米谷粒、大麦青贮饲料、大麦谷粒、油料种子或其组合。
112.根据权利要求104至109中任何一项的添加剂，其中饲料是苜蓿饲料或苜蓿-草饲料的混合物。
113.一种用于饲喂反刍动物的饲料组合物，包括与至少一种蛋白酶组合的饲料或谷物饲料，由此实现可消化性的增加。
114.根据权利要求113的组合物，其中饲料或谷物饲料选自苜蓿干草及青贮饲料、草类干草及青贮饲料、混合干草及青贮饲料、麦杆、玉米青贮饲料、玉米谷粒、大麦青贮饲料、大麦谷粒、油料种子或其组合。
115.根据权利要求113的组合物，其中饲料是苜蓿饲料或苜蓿-草饲料的混合物。
116.根据权利要求113的组合物，其中蛋白酶来源于细菌或真菌。
117.根据权利要求116的组合物，其中细菌是芽孢杆菌属物种。
118.根据权利要求116的组合物，其中真菌是木霉属物种。
119.根据权利要求116的组合物，其中蛋白酶选自半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。
120.根据权利要求119的组合物，其中蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
121.根据权利要求116的组合物，其中蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶样的。
122.根据权利要求116的组合物，其中将蛋白酶配制为固体、液体或悬浮液。
123.根据权利要求122的组合物，其中将蛋白酶配制为矿物质块、盐、颗粒、片剂、丸剂或粉末。
124.根据权利要求122的组合物，其中蛋白酶是与一种或多种惰性或活性成分组合的，所述成分选自载体；稀释剂；调味剂；赋形剂；选自纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶和酯酶的酶；抗生素；益生元；益生菌；微量营养物；维生素；矿物质和常量营养物。
125.根据权利要求122的组合物，其中将蛋白酶以0.1至20mL/kg消耗的干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
126.根据权利要求122的组合物，其中将蛋白酶以0.5至2.5ml/kg消耗的干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
127.根据权利要求122的组合物，其中将蛋白酶以0.75至1.5mL/kg消耗的干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
128.根据权利要求122的组合物，其中蛋白酶的量包括1,000至23,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
129.根据权利要求122的组合物，其中蛋白酶的量包括2,300至11,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
130.根据权利要求122的组合物，其中蛋白酶的量包括3,300至6,800蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
131.根据权利要求128至130中任何一项的组合物，其中利用偶氮酪蛋白作为底物在pH6.0和39℃测定蛋白酶活性。
132.蛋白酶用于饲喂反刍动物的用途，包括下列步骤a)提供至少一种蛋白酶；b)提供饲料或谷物饲料；以及c)将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料以形成饲料组合物，以及d)将该组合物施用于动物，由此实现可消化性的增加。
133.根据权利要求132的用途，其中饲料或谷物饲料选自苜蓿干草及青贮饲料、草类干草及青贮饲料、混合干草及青贮饲料、麦杆、玉米青贮饲料、玉米谷粒、大麦青贮饲料、大麦谷粒、油料种子或其组合。
134.根据权利要求132的用途，其中饲料是苜蓿饲料或苜蓿-草饲料的混合物。
135.根据权利要求132的用途，其中蛋白酶来源于细菌或真菌。
136.根据权利要求135的用途，其中细菌是芽孢杆菌属物种。
137.根据权利要求135的用途，其中真菌是木霉属物种。
138.根据权利要求135的用途，其中蛋白酶选自半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。
139.根据权利要求138的用途，其中蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
140.根据权利要求135的用途，其中蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶样的。
141.根据权利要求135的用途，其中将蛋白酶配制为固体、液体或悬浮液。
142.根据权利要求141的用途，其中将蛋白酶配制为矿物质块、盐、颗粒、片剂、丸剂或粉末。
143.根据权利要求141的用途，其中蛋白酶是与一种或多种惰性或活性成分组合的，所述成分选自载体；稀释剂；调味剂；赋形剂；选自纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶和酯酶的酶；抗生素；益生元；益生菌；微量营养物；维生素；矿物质和常量营养物。
144.根据权利要求141的用途，其中将蛋白酶以0.1至20mL/kg消耗的干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
145.根据权利要求141的用途，其中将蛋白酶以0.5至2.5mL/kg消耗的干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
146.根据权利要求141的用途，其中将蛋白酶以0.75至1.5ml/kg消耗的干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
147.根据权利要求141的用途，其中蛋白酶的量包括1,000至23,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
148.根据权利要求141的用途，其中蛋白酶的量包括2,300至11,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
149.根据权利要求141的用途，其中蛋白酶的量包括3,300至6,800蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
150.根据权利要求147至149中任何一项的用途，其中利用偶氮酪蛋白作为底物在pH6.0和39℃测定蛋白酶活性。
151.蛋白酶用于生产饲料添加剂的用途，包括下列步骤a)提供至少一种蛋白酶；b)将蛋白酶与一种或多种惰性或活性成分混合以形成饲料添加剂。
152.根据权利要求151的用途，其中蛋白酶来源于细菌或真菌。
153.根据权利要求152的用途，其中细菌是芽孢杆菌属物种。
154.根据权利要求152的用途，其中真菌是木霉属物种。
155.根据权利要求152的用途，其中蛋白酶选自半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。
156.根据权利要求155的用途，其中蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
157.根据权利要求152的用途，其中蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶样的。
158.根据权利要求152的用途，其中将蛋白酶配制为固体、液体或悬浮液。
159.根据权利要求158的用途，其中将蛋白酶配制为矿物质块、盐、颗粒、片剂、丸剂或粉末。
160.根据权利要求158的用途，其中蛋白酶是与一种或多种惰性或活性成分组合的，所述成分选自载体；稀释剂；调味剂；赋形剂；选自纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶和酯酶的酶；抗生素；益生元；益生菌；微量营养物；维生素；矿物和常量营养物。
161.根据权利要求158的用途，其中存在于添加剂中的蛋白酶产生0.1至20mL/kg消耗的干物质的量。
162.根据权利要求158的用途，其中存在于添加剂中的蛋白酶产生0.5至2.5mL/kg消耗的干物质的量。
163.根据权利要求158的用途，其中存在于添加剂中的蛋白酶产生0.75至1.5mL/kg消耗的干物质的量。
164.根据权利要求158的用途，其中蛋白酶以产生1,000至23,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性的量存在。
165.根据权利要求158的用途，其中蛋白酶以产生2,300至11,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性的量存在。
166.根据权利要求158的用途，其中蛋白酶以产生3,300至6,800蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性的量存在。
167.根据权利要求164至166中任何一项的用途，其中利用偶氮酪蛋白作为底物在pH6.0和39℃测定蛋白酶活性。
168.根据权利要求161至166中任何一项的用途，其中饲料或谷物饲料选自苜蓿干草及青贮饲料、草类干草及青贮饲料、混合干草及青贮饲料、麦杆、玉米青贮饲料、玉米谷粒、大麦青贮饲料、大麦谷粒、油料种子或其组合。
169.根据权利要求161至166中任何一项的用途，其中饲料是苜蓿饲料或苜蓿-草饲料的混合物。
170.蛋白酶用于生产饲料组合物的用途，包括下列步骤a)提供至少一种蛋白酶；b)提供饲料或谷物饲料；以及c)将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料以形成组合物，由此实现可消化性的增加。
171.根据权利要求170的用途，其中饲料或谷物饲料选自苜蓿干草及青贮饲料、草类干草及青贮饲料、混合干草及青贮饲料、麦杆、玉米青贮饲料、玉米谷粒、大麦青贮饲料、大麦谷粒、油料种子或其组合。
172.根据权利要求170的用途，其中饲料是苜蓿饲料或苜蓿-草饲料的混合物。
173.根据权利要求170的用途，其中蛋白酶来源于细菌或真菌。
174.根据权利要求173的用途，其中细菌是芽孢杆菌属物种。
175.根据权利要求173的用途，其中真菌是木霉属物种。
176.根据权利要求173的用途，其中蛋白酶选自半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。
177.根据权利要求176的用途，其中蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
178.根据权利要求173的用途，其中蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶样的。
179.根据权利要求173的用途，其中将蛋白酶配制为固体、液体或悬浮液。
180.根据权利要求179的用途，其中将蛋白酶配制为矿物质块、盐、颗粒、片剂、丸剂或粉末。
181.根据权利要求179的用途，其中蛋白酶是与一种或多种惰性或活性成分组合的，所述成分选自载体；稀释剂；调味剂；赋形剂；选自纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶和酯酶的酶；抗生素；益生元；益生菌；微量营养物；维生素；矿物质和常量营养物。
182.根据权利要求181的用途，其中将蛋白酶以0.1至20mL/kg消耗的干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
183.根据权利要求181的用途，其中将蛋白酶以0.5至2.5ml/kg消耗的干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
184.根据权利要求181的用途，其中将蛋白酶以0.75至1.5mL/kg消耗的干物质的量应用于饲料或谷物饲料。
185.根据权利要求181的用途，其中蛋白酶的量包括1,000至23,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
186.根据权利要求181的用途，其中蛋白酶的量包括2,300至11,000蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
187.根据权利要求181的用途，其中蛋白酶的量包括3,300至6,800蛋白酶单位/kg干物质的蛋白酶活性。
188.根据权利要求185至188中任何一项的用途，其中利用偶氮酪蛋白作为底物在pH6.0和39℃测定蛋白酶活性。
全文摘要
本发明提供了通过提供包括至少一种蛋白酶的饲料添加剂或饲料组合物来增加反刍动物中的纤维消化的方法。具体地，本发明提供了增加饲料或谷物饲料的可消化性的方法，包括提供至少一种蛋白酶；提供适于反刍动物的饲料或谷物饲料；将蛋白酶应用于饲料或谷物饲料；以及将该组合物施用于动物，由此实现可消化性的增加。此外本发明延伸至包括蛋白酶的饲料添加剂和饲料组合物，及其制备和用途。
文档编号A23K1/18GK1784147SQ200480012241
公开日2006年6月7日 申请日期2004年2月13日 优先权日2003年3月7日
发明者K·A·博谢敏, D·科隆巴托 申请人:加拿大农业及农业食品部