专利名称：减少经口或经皮传递烟碱的有害影响的方法
技术领域：
本发明大体来说是关于减小在常规的戒烟计划中经口或经皮传递的烟碱戒烟的有害影响。更具体来说，实施例是关于通过提供含有减少的烟碱和烟草特有亚硝胺(TSNA)量的烟草产品来减小与常规的戒烟计划相关的烟碱摄入的有害影响的方法。
背景技术：
烟草产品的成瘾特性大部分可归因于烟碱的存在和传递系统的习惯使用(例如，与吸烟或嚼烟行为相关的口欲滞留、烟摄入和味道)。许多戒烟计划涉及使用烟碱替代疗法(NRT)，其中给予个人各种烟碱量以作为烟草使用的替代。目前可使用若干种类型的涉及NRT的戒烟产品。举例来说，NRT的常规产品为烟碱贴片、胶、胶囊、吸入器、经鼻喷雾和含片。虽然这些常规的NRT产品可通过抑制烟碱戒断症状来帮助烟草使用者，但它们极少满足烟草使用者对习惯使用传递系统的渴望。(Dotinga，Study BurstsNicotine Gum′s Bubble，Health-Health Scout News，2002年9月20日)。习惯使用传递系统所涉及的因素在下文称为“成瘾的第二因素”。这些成瘾的第二因素大部分为与对烟碱的化学依赖只具有偶然关系的心理因素。
除了常规NRT极少镇压成瘾的第二因素的事实之外，NRT在使人们放弃烟草使用方面只具有有限成功。举例来说，在不需处方但可合法出售的NRT胶的使用者中，6周时的节制率为16.1％且6个月时的节制率为8.4％；而对于处方NRT胶的使用者而言，6周时的节制率为7.7％且6个月时的节制率为7.7％。(Shiftman等人，Addiction 97505-516，2002)。NRT贴片的使用者只经历稍微较好的结果；据报道不需处方但可合法出售的贴片的使用者在6周时具有19.0％的节制率且在6个月时具有9.2％的节制率；而处方NRT贴片的使用者在6周时经历16.0％的节制率且在6个月时经历3.0％的节制率。同样，其它人报道以贴片或胶戒烟的稍好结果显示12个月时的经核实的节制率在20％的范围内。(O′Brien，于1995年9月22日给宾夕法尼亚大学医学生所做的演讲)。然而，一个研究甚至称NRT在增大加利福尼亚吸烟者的长期成功戒断中不再有效。(Pierce和Gilpin，Jama，2881260-1264(2002))。明显地，烟草成瘾似乎是心理因素(也就是第二因素)结合烟碱依赖性的复杂网且现有的NRT大部分都无效。
通过设计，常规的NRT依赖于烟草使用者逐渐减小其每日烟碱摄入，同时其精神上控制其对成瘾第二因素的渴望。然而在实践中，许多计划参与者只以对NRT产品昂贵的多的成瘾来替代对烟草的成瘾。在一些状况下，计划参与者摄取远多于其从常规烟草使用所摄取的烟碱来补偿成瘾第二因素满足的缺少。在其它状况下，计划参与者在完成初始计划后继续长期使用NRT产品且最终转向烟草产品。
大量烟碱的摄入和长期使用NRT引起严重的健康问题。在一些状况下，烟碱过量用药伴随NRT的过度热情使用。烟碱过量用药的症状包括恶心和/或呕吐、口水增多(严重)、腹部或胃疼痛(严重)、腹泻(严重)、皮肤惨白、冷汗、头痛(严重)、眩晕(严重)、听力和视力失常、战栗、混乱、虚弱(严重)、极度疲劳、昏厥、低血压、呼吸困难(严重)、心跳不规则或抽搐(发作)。在长期使用NRT的个体中也可发生心理压力，因为烟碱释放肾上腺素，一种刺激体内压力回应的荷尔蒙。烟碱的心理影响包括烦躁、忧虑、睡眠障碍、紧张、情绪和脾气较差、头痛、疲劳、恶心和长期对烟草的渴望。
此外，最新研究已确认烟碱刺激血管在发炎期间生长和促进血管生成、动脉粥样硬化和肿瘤生长。(Heeschen等人，Nature Medicine 7833，2001)。烟碱也可为一种用于通过身体自身的代谢系统内生形成诸如4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)的致癌物质的前驱体。(Hecht等人，Proc.Nat.Acad.Set 9712493-12497，2000)。仍然需要利用含有减少的烟碱和TSNA量的烟草产品的烟碱减少和/或戒烟计划。
发明内容
本发明是关于减少与常规戒烟计划相关的烟碱摄入的有害影响的方法。更具体来说，提供具有减少的烟草特有亚硝胺(TSNA)量的烟草产品。此外，提供制造或混合这些TSNA减少的烟草产品的方法。
在本发明的一些实施例，提供制造烟碱减少的混合烟草的方法，所述方法通过提供第一烟草、由经基因改造的具有减少的QPTase含量(与未经改造的同种类烟草植物相比)的烟草植物制造的第二烟草和混合所述第一与第二烟草来获得烟碱减少的烟草。也提供具有通过这方法制造的烟碱减少的混合烟草的烟草产品。
在其它实施例中，提供制造TSNA减少的混合烟草的方法，所述方法通过提供第一烟草、由经基因改造的具有减少的QPTase含量(与未经改造的同种类烟草植物相比)的烟草植物制造的第二烟草和混合所述第一与第二烟草来获得TSNA减少的烟草。也提供具有通过这方法制造的TSNA减少的混合烟草的烟草产品。
在又一些实施例中，提供制造TSNA减少的混合烟草的方法，所述方法通过提供第一烟草、由经基因改造的具有减少的QPTase含量(与未经改造的同种类烟草植物相比)的烟草植物制造的第二烟草和混合所述第一和第二烟草来获得TSNA减少的烟草。也提供具有通过这方法制造的TSNA减少的混合烟草的烟草产品。
在又一些实施例中，提供制造具有所要烟碱量的烟碱减少的烟草的方法，所述方法通过提供具有经测量的烟碱量的第一烟草、由经基因改造的具有减少的QPTase含量(与未经改造的同种类烟草植物相比)的烟草植物制造的具有经测量的烟碱量的第二烟草和混合所述第一和第二烟草来制造具有所要烟碱量的烟碱减少的烟草产品。所述烟碱减少的烟草产品可例如为混合香烟。所述混合香烟可例如含有0.6mg或更少的烟碱、0.3mg或更少的烟碱或0.05mg或更少的烟碱。也提供具有通过这些方法制造的烟碱减少的混合烟草的烟草产品。此外，提供具有通过这些方法制造的烟草产品的戒烟套组。
本发明的额外实施例提供制造具有所要TSNA量的TSNA减少的烟草产品的方法，所述方法通过提供具有经测量的TSNA量的第一烟草、提供由经基因改造的具有减少的QPTase含量(与未经改造的同种类烟草植物相比)的烟草植物制造的具有经测量的TSNA量的第二烟草和混合所述第一和第二烟草来制造具有所要TSNA量的TSNA减少的烟草产品。
本发明的其它实施例提供减少烟草使用者的烟碱消费的方法，所述方法通过给烟草使用者提供具有由经改造的具有减少的QPTase含量(与未经改造的同种类烟草植物相比)的烟草植物制造的烟草的第一烟草产品；和具有由经改造的具有减少的QPTase含量(与未经改造的同种类烟草植物相比)的烟草植物制造的烟草的第二烟草产品，其中所述第二烟草产品具有小于所述第一烟草产品的烟碱；给烟草使用者提供具有由经改造的具有减少的QPTase含量(与未经改造的同种类烟草植物相比)的烟草植物制造的烟草的额外烟草产品，其中从具有小于第一或第二烟草产品的烟碱的第三产品开始，随后的烟草产品具有依次减少的烟碱量。
本发明的又一些实施例提供减少烟草使用者的TSNA消费的方法，所述方法通过给烟草使用者提供具有由经改造的具有减少的QPTase(与未经改造的同种类烟草植物相比)的烟草植物制造的烟草的第一烟草产品；和具有由经改造的具有减少的QPTase含量(与未经改造的同种类烟草植物相比)的烟草植物制造的烟草的第二烟草产品，其中所述第二烟草产品具有小于所述第一烟草产品的TSNA；和进一步给烟草使用者提供具有由经改造的具有减少的QPTase含量(与未经改造的同种类烟草植物相比)的烟草植物制造的烟草的额外烟草产品，其中从具有小于第一或第二烟草产品的TSNA的第三产品开始，随后的烟草产品具有依次减少的TSNA量。
本发明的额外实施例提供由具有减少的QPTase含量的烟草植物制造的经基因改造的烟草用于制备具有经选择的烟碱量的混合烟草产品。所述混合烟草产品可例如为混合香烟。所述混合烟草产品可例如为具有0.6mg或更少的烟碱、0.3mg或更少的烟碱或0.05mg或更少的烟碱的混合香烟。
本发明的其它实施例提供由具有减少的QPTase量的烟草植物制造的经基因改造的烟草用于制备具有经选择的TSNA量的混烟草产品。所述混合烟草产品可例如为混合香烟。所述混合烟草产品可例如为具有0.6mg或更少的烟碱、0.3mg或更少的烟碱或0.05mg或更少的烟碱的混合香烟。
具体实施例方式
本发明是关于烟碱减少和/或戒烟计划，其涉及使用经改造的含有减少的烟碱和TSNA量的烟草产品。虽然大多数戒烟计划很大程度上依赖于烟碱替代疗法(NRT)，但本文中所描述的实施例的许多实施例较少集中于烟碱替代而是更多的集中于替代成瘾的第二因素，诸如烟摄入、口欲滞留和味道。以英文形式出版的标题为″Modifying Nicotine and Nitrosamine levels inTobacco″(WO02100199)的同在申请中的申请案指定美利坚合众国且主张美国临时申请案第60/371635号的权利。也以全文引用的方式并入的专利为美国专利第6,586,661和6,423,520号。
本发明的一些实施例是关于使用低烟碱和TSNA的烟草产品，所述烟草产品具有与常规烟草产品实质上无法区分的燃烧和味道特性。虽然存在许多制造所述烟碱和/或TSNA减少的产品的方法，但优选方法使用植物基因工程中的技术来减少或消除烟碱生物合成中所涉及的酶。优选地，植物基因工程中的技术用于选择性地减少根皮层处的烟碱制造中所涉及的酶喹啉基磷酸核糖基转移酶(QPTase)的量。给定本文中所描述的教示和所属领域技术人员的水平，可存在许多减少烟草植物中的QPTase的含量的方法，然而，优选方法涉及使用反义技术或分子诱饵技术。
已发现若干种制造具有减少的烟碱和/或TSNA量的烟草和烟草产品的方法。有趣的是，我们发现烟草植物种的TSNA含量可通过减少烟草植物中的烟碱含量来降低。在一些实施例中，反义技术用于降低烟草植物中的烟碱和TSNA含量。(参看PCT/US98/11893)。在其它实施例中，分子诱饵技术用于降低烟草植物中的烟碱和TSNA含量。(参看美国专利申请案第09/941,042号)。
通过一种方法(例如)制备一编码补充QPTase基因的至少一部分(SEQ.ID.No.1)的反义RNA的DNA构造以使得RNA的补充股的转录减少内源性喹啉基磷酸核糖基基因的表达，其进而减少烟草植物中的烟碱的量且伴随TSNA减少的量。通过另一种方法，将QPTase基因的转录因子分子诱饵插入植物细胞中，所述转录因子分子诱饵为对应于5′上游调节元件的核酸片段(例如Nic 1和Nic 2转录因子结合位点)。所述转录因子结合到诱饵片段而不是内源性转录因子结合位点且获得QPTase转录量的减少。
一旦制造具有烟碱和/或TSNA减少的转基因烟草植物，就通过常规方法收获和烘烤烟草和将所述烟草并入各种烟草产品中。优选地，将所述转基因烟草混合以使得在特定产品中获得特定的烟碱和/或TSNA量。也就是说，进行混合以制造变化的烟碱和/或TSNA量的烟草产品。以这种方式，可建立逐步戒烟计划，其中计划参与者在步骤1处以具有只稍微较少的烟碱的烟草产品来开始所述计划；在步骤2处，所述计划参与者使用具有比步骤1中所用的产品少的烟碱的烟草产品来开始；在步骤3处，所述计划参与者使用具有比步骤2中所用的产品少的烟碱的烟草产品来开始；且对特定戒烟计划所需的许多步骤也如此。最后，计划参与者所使用的烟草产品可具有小于成瘾或维持成瘾所需量的烟碱量。以这种方式，提供限制计划参与者接触烟碱同时保持成瘾第二因素(包括(但不限于)烟摄入、口欲滞留和味道)的烟碱减少和/或戒烟计划。下列部分描述可供本文中所描述的戒烟计划使用的烟草产品。
供烟碱减少和/或戒烟计划使用的烟草产品野生型烟草视种类和其生长、收获和烘烤的方式而在TSNA和烟碱的量方面显著变化。举例来说，典型的白肋(Burley)烟草叶可具有约30,000百万分率(ppm)的烟碱和8,000十亿分率(ppb)的TSNA；典型的白肋烤烟叶可具有约20,000ppm烟碱和300ppb TSNA；且典型的东方叶可具有约10,000ppm烟碱和100ppb TSNA。供本发明方面使用的具有减少的烟碱和/或TSNA量的烟草植物或其部分可具有不可检测的烟碱和/或TSNA，或可含有一些可检测的一或多种TSNA和/或烟碱量，只要烟碱和/或TSNA的量小于同种类对照植物中所找到的量。
也就是说，本发明具有减少的烟碱量的白肋烟草叶实施例可具有在约0与约30,000ppm之间的烟碱和在约0与约8,000ppb之间的TSNA，适当地在约0与约20,000ppm之间的烟碱和在约0与约6,000ppb之间的TSNA，更适当地在约0与约10,000ppm之间的烟碱和在约0与约5,000ppb之间的TSNA，优选地在约0与约5,000ppm之间的烟碱和在约0与约4,000ppb之间的TSNA，更优选地在约0与约2,500ppm之间的烟碱和在约0与约2,000ppb之间的TSNA，甚至更优选地在约0与约1,000ppm之间的烟碱和在约0与约1,000ppb之间的TSNA。通过本文中所描述的方法制备的白肋烟叶实施例也可具有在约0与约1,000ppm之间的烟碱和在约0与约500ppb之间的TSNA且通过本文中所描述的方法制备的白肋烟叶的一些实施例具有实质上不可检测的烟碱或TSNA量。
类似地，供揭示方法使用的烤烟叶可具有减少的烟碱量，其为在约0与约20,000ppm之间的烟碱和在约0与约300ppb之间的TSNA，适当地在约0与约15,000ppm之间的烟碱和在约0与约250ppb之间的TSNA，更适当地在约0与约10,000ppm之间的烟碱和在约0与约200ppb之间的TSNA，优选地在约0与约5,000ppm之间的烟碱和在约0与约150ppb之间的TSNA，更优选地在约0与约2,500ppm之间的烟碱和在约0与约100ppb之间的TSNA且最优选地在约0与约1,000ppm之间的烟碱和在约0与约50ppb之间的TSNA。通过本文中所描述的方法制备的烤烟叶也可具有在约0与约500ppm之间的烟碱和在约0与约25ppb之间的TSNA且通过本文中所描述的方法制备的白肋烟叶的一些实施例具有实质上不可检测的烟碱或TSNA量。
此外，供具体方法使用的东方烟草可具有减少的烟碱量，其具有在约0与约10,000ppm之间的烟碱和在约0与约100ppb之间的TSNA，适当地在约0与约7,000ppm之间的烟碱和在约0与约75ppb之间的TSNA，更适当地在约0与约5,000ppm之间的烟碱和在约0与约50ppb之间的TSNA，优选地在约0与约3,000ppm之间的烟碱和在约0与约25ppb之间的TSNA，更优选地在约0与约1,500ppm之间的烟碱和在约0与约10ppb之间的TSNA且最优选地在约0与约500ppm之间的烟碱和基本上没有TSNA。通过本文中所描述的方法制备的东方烟草也可具有在约0与约250ppm之间的烟碱和基本上没有TSNA且通过本文中所描述的方法制备的东方烟草的一些实施例具有实质上不可检测的烟碱或TSNA量。
如上文所讨论，TSNA和烟碱显著促进烟草和烟草产品的致癌潜力和成瘾性质。因此，具有减少的TSNA和烟碱量的烟草和烟草产品具有极大效用。我们发现烟草中烟碱减少直接与TSNA减少有关。意想不到的是，本文中所描述的方法不仅制造具有经减少的成瘾潜力的烟草，而且伴随制造具有较低致癌潜力的烟草。
应强调短语“减少量”意欲用于指经处理或转基因的烟草植物、烟草或烟草产品中的烟碱和/或TSNA的量，其小于来自以相同方式加工的未经处理或转基因以减少烟碱和/或TSNA的同种类烟草的烟草植物、烟草或烟草产品中所发现的量。因此，在一些情形中，以相同方式加工的同种类野生型烟草用作一对照物，通过所述对照物来测量是否已获得烟碱和/或TSNA减少。
在一些情形中，短语减少的烟碱和/或TSNA量是指本发明具有重量比以相同方式生长、加工和烘烤的同种类烟草小的烟碱和/或TSNA的烟草植物、烟草和烟草产品。举例来说，野生型烟草可取决于种类和其生长、收获和烘烤的方式而含有约1-4％干重的烟碱和约0.2％-0.8％干重的TSNA。典型的香烟具有11mg烟碱和8μg TSNA。因此，本发明的烟草植物、烟草和烟草产品可具有以干重计例如小于0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％、0.075％、0.08％、0.085％、0.09％、0.095％、0.1％、0.15％、0.175％、0.2％、0.225％、0.25％、0.275％、0.3％、0.325％、0.35％、0.375％、0.4％、0.425％、0.45％、0.475％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％和1.0％的烟碱和小于0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.05％、0.055％、0.06％、0.065％、0.07％、0.075％和0.08％的TSNA。
或者，例如香烟的烟草产品可具有例如小于0.01mg、0.05mg、0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.4mg、0.45mg、0.5mg、0.55mg、0.6mg、0.65mg、0.7mg、0.75mg、0.8mg、0.85mg、0.9mg、0.95mg、1.0mg、1.1mg、1.15mg、1.2mg、1.25mg、1.3mg、1.35mg、1.4mg、1.45mg、1.5mg、1.55mg、1.6mg、1.65mg、1.7mg、1.75mg、1.8mg、1.85mg、1.9mg、1.95mg、2.0mg、2.1mg、2.15mg、2.2mg、2.25mg、2.3mg、2.35mg、2.4mg、2.45mg、2.5mg、2.55mg、2.6mg、2.65mg、2.7mg、2.75mg、2.8mg、2.85mg、2.9mg、2.95mg、3.0mg、3.1mg、3.15mg、3.2mg、3.25mg、3.3mg、3.35mg、3.4mg、3.45mg、3.5mg、3.55mg、3.6mg、3.65mg、3.7mg、3.75mg、3.8mg、3.85mg、3.9mg、3.95mg、4.0mg，.4.1mg、4.15mg、4.2mg、4.25mg、4.3mg、4.35mg、4.4mg、4.45mg、4.4mg、4.45mg、4.5mg、4.55mg、4.6mg、4.65mg、4.7mg、4.75mg、4.8mg、4.85mg、4.9mg、4.95mg、5.0mg、5.5mg、5.7mg、6.0mg、6.5mg、6.7mg、7.0mg、7.5mg、7.7mg、8.0mg、8.5mg、8.7mg、9.0mg、9.5mg、9.7mg、10.0mg、10.5mg、10.7mg和11.0mg的烟碱和小于0.1微克、0.15微克、0.2微克、0.25微克、0.3微克、0.35微克、0.4微克、0.45微克、0.5微克、0.55微克、0.6微克、0.65微克、0.7微克、0.75微克、0.8微克、0.85微克、0.9微克、0.95微克、1.0微克、1.1微克、1.15微克、1.2微克、1.25微克、1.3微克、1.35微克、1.4微克、1.45微克、1.5微克、1.55微克、1.6微克、1.65微克、1.7微克、1.75微克、1.8微克、1.85微克、1.9微克、1.95微克、2.0微克、2.1微克、2.15微克、2.2微克的TSNA。
已发现若干种用于减少植物中烟碱和TSNA的内源性含量的方法。这些方法可用于制造上文所描述的烟草产品。如通过下列部分中所描述的方法制造的具有减少的烟碱和/或TSNA量的烟草植物可用于具体的戒烟计划中，所述烟草植物保持了良好的吸烟特性和味道。
制造具有经减少的烟碱和/或TSNA含量的烟草的方法烟草植物中的烟碱通过缩合烟碱酸和4-甲基胺基丁醛来制造。两种调节loci(Nic1和Nic2)充当烟碱制造的共显性调节器。这两种loci不连接且基因作用为半支配性和主要为附加性(Legg等人(1969)J.Hered.，60，213-217)。
已使用基因和酶分析法来研究Nic1和Nic2基因。Collins等人((1974)Crop Sci.，14，77-80)制备这四种生物碱基因型的双单倍体烟草育种株。标准载培品种的基因型为Nic1/Nic1 Nic2/Nic2且低烟碱株的基因型为nic1/nic1nic2/nic2。Nic1/Nic1 nic2/nic2为高中间体且nic1/nic1 Nic2/Nic2为低中间体(Legg和Collins(1971)Can.J.Genet.Cytol.13，287-291)。这些株在开花期、叶子数目、叶子尺寸和植物高度方面类似。单和双Nic突变体的根的酶分析显示两种酶(喹啉基磷酸核糖基转移酶(QPTase)和腐胺甲基转移酶(PMTase))的活性与烟碱生物合成的含量直接成比例(Saunders和Bush(1979)Plant Physiol 64236)。Nic1和Nic2影响根中PMTase和QPTase活性，且因此调节烟碱合成(Leete(1983)AlkaloidsChemical and BiologicalPerspectives，S.W.Pelletier，编辑者John Wiley & Sons，第85-152页)。
单和双Nic突变体的根的酶分析显示QPTase和PMTase的活性与烟碱生物合成的含量直接成比例。烟碱生物合成中的必须步骤为从喹啉酸形成烟碱酸，该步骤通过QPTase来催化。QPTase在给烟草中的烟碱合成供应烟碱酸的路径中似乎为限制速率的酶(参见例如Feth等人，Planta，168，第402-07页(1986)和Wagner等人，Physiol.Plant，68，第667-72页(1986))。烟草组织(根和愈伤组织)中的酶活性与烟碱合成的不同能力的比较显示QPTase活性严格地与烟碱含量相关(Wagner和Wagner，Planta 165532(1985))。事实上，Saunders和Bush Plant Physiol 64236(1979)显示低烟碱突变体的根的QPTase含量与叶子中的烟碱含量成比例。
Hibi等人((1994)Plant Cell，6，723-735)分离出编码PMTase、PMT的cDNA且显示PMT转录物含量通过Nic1和Nic2来调节。也已分离出QPTasecDNA和基因组克隆体(NtQPT1)且NtQPT1转录物含量也通过Nic1和Nic2来调节。因此，Nic基因似乎通过调节编码两种限制速率的酶(PMTase和QPTase)的基因的转录物含量来调节烟碱含量。此外，已显示Nic1和Nic2为NtQPT1转录的正调节物且转录起始位点的启动子序列上游含有NtQPT1转录的Nic基因产品活化所需的顺式作用序列。因为QPTase和PMTase的表达通过Nic基因产品来协同调节，所以所述Nic基因产品也直接调节PMT基因的转录。
一种减少烟碱的方法涉及减少导致其制造的生物合成路径中所需酶(例如QPTase和PMTase)的量。在受影响的酶以限制速率的量(相对于路径中所需的其它酶)天然存在的情况下，酶数量的任何减少都将减少最终产品的制造。如果酶的量正常地不限制速率，那么其在细胞中的存在必须减少到限制速率的含量以减小路径输出量。相反地，如果天然存在量的酶限制速率，那么酶活性的任何增大将增大生物合成路径的最终产品的增大。
美国专利5,369,023和5,260,205直到Nakatani和Malik提出通过反义调节PMTase表达来改造烟草植物中的烟碱含量。PCT申请案WO 94/28142直到Wahad和Malik描述了编码PMT的DNA和同义与反义PMT构造的用途。此外，PCT申请案WO98/56923直到Conkling等人描述了编码一植物QPTase酶的DNA、包含所述DNA的构造和改变QPTase表达以增大或降低烟草植物中的烟碱制造的方法。又，美国专利申请案第09/941,042号直到Conkling描述了编码调节序列的DNA用于QPTase酶和使用这些序列作为分子诱饵以隔绝远离QPTase基因的内源性启动子的位点处的转录因子、借此降低烟草植物中的烟碱制造的方法。下列部分更详细地描述制造具有经减少的烟碱和/或TSNA含量的烟草产品的反义方法。
反义技术可用于制造具有经减少的烟碱和/或TSNA量的烟草产品反义技术可用于制造具有经减少的烟碱含量的烟草植物。用于反义调节烟碱含量的优选酶为编码烟草属烟草QPTase(参看实例1)(SEQ.ID.No.1)的TobRD2基因(参看Conkling等人，Plant Phys.93，1203(1990))。除了描述本文中所提供的技术外，PCT/US98/11893描述了技术的通用方面。
植物细胞基因组中的基因表达的调节可通过在于主体中可起作用的启动子的转录控制下整合异源DNA来达成，且其中异源DNA的转录股为从待调节的内源性基因转录的DNA股的补充。称为反义DNA的引入DNA提供一RNA序列，所述RNA序列为天然产生(内源性)的mRNA的补充且抑制内源性mRNA表达。虽然反义的机制未被完全理解，但已知反义构造可用于调节基因表达。用于通过分子改造来减少QPTase含量的一种优选方法于实例2和实例3中提供。
在本发明的一些方法中，反义产物可为天然存在的目标RNA的编码或非编码(或两者)部分的补充。反义构造可以任何适合的方式引入植物细胞中且可整合入植物基因组中以诱导或原构性转录反义序列。接着使用常规技术由成功转化的细胞重新产生烟草植物。最优选的是所述反义序列用作内源性序列的补充，然而可容忍外源性和内源性序列中的微小变化。优选的是反义DNA序列具有在如下文所描述的严格条件下可结合到待调节的细胞中的内源性序列的足够序列类似性。
虽然反义调节的优选酶为QPTase，但适用于反义调节的其它酶包括(例如)腐胺N-甲基转移酶、N-甲基腐胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、S-腺苷甲硫胺酸合成酶、NADH脱氢酶、磷酸核糖基胺基苯甲酸异构酶和与烟碱生物合成连接的任何其它酶。
作为使用反义技术的一个实例，具有减少的烟碱和TSNA量的烟草由一烟草植物产生，所述烟草植物通过将至少一选定烟草种类(优选白肋烟21)的烟草细胞暴露于在5′到3′方向具有在植物细胞中可操作的外源性DNA构造和含有编码烟碱合成路径中的酶的一部分DNA序列或其补充序列(例如SEQ.ID.No.1)的DNA来制造。所述DNA与所述启动子操作相关且所述烟草细胞通过所述DNA构造来转化。使用负选择或正选择技术来选择经转化的细胞且由经转化的细胞重新产生至少一烟草植物。优选分析重新产生的烟草植物或其部分以确定存在的烟碱和/或TSNA的量且这些值可与对照烟草植物或部分(优选为同种类)中所存在的烟碱和/或TSNA的量相比较。
具有编码烟碱合成路径中的酶的一部分DNA序列的DNA构造可具有所述酶的整个编码序列、这个序列的补充序列或其任何部分。编码烟碱合成路径中的酶的一部分DNA序列或其补充序列可具有至少25、27、30、35、40、45、50、60、75、100、150、250、500、750、1000、1500、2000、2500或5000个碱或所述酶的整个编码序列或其补充序列(例如SEQ.ID.No.1)。因此，这些DNA构造具有通过反义或共抑制机制干扰烟碱生物合成路径中的内源性酶的制造的能力。预期反义RNAi和共抑制构造在减少烟草植物中的烟碱和/或亚硝胺的含量方面有效。本文中所描述的构造中所采用的核酸序列包括那些与编码QPTase和编码具有喹啉基磷酸核糖基转移酶活性(包括例如QPTase蛋白中的等位基因变化)的蛋白的基因序列类似性的核酸序列。因此，杂交成编码QPTase的基因的DNA和为QPTase(尤其是植物QPTase酶)表达编码的DNA序列也可用于进行本发明。可存在多种形式的烟草QPT酶。多种形式的酶可归因于单一基因产物的后翻译改造或多种形式的NtQPT1基因。
如本文中所用的术语“基因”可指一DNA序列，其并入(1)包括启动子的上游(5′)调节信号、(2)具体说明产物、蛋白或基因的RNA的编码区域、(3)包括转录终止和多聚腺嘌呤信号的下游区域、(4)有效和特定表达所需的相关序列。在一些情形中，基因只可包括上文的(2)或项目(1)、(3)和(4)与(2)的一些组合。本发明的DNA序列可包含或基本上由编码QPTase的序列或表示等位基因或这些基因的多形变体的等效核苷酸序列或其编码区域。在本说明和权利要求范围中使用短语“实质的序列类似性”意谓与本文中所揭示和主张的实际序列有轻微和不重要的序列变化的DNA、RNA或氨基酸序列视为与本发明的序列等效。就这点来说，“轻微和不重要的序列变化意谓“类似”序列(也就是具有与本文中所揭示和主张的DNA、RNA或蛋白实质序列类似的序列)与本发明中所揭示和主张的序列等效作用。等效作用的序列实质上以实质相同的方式作用来产生与本文中所揭示和主张的核酸和氨基酸组合物实质相同的组合物。
通过一种方法，可使用编码植物QPTase的新颖的cDNA序列。因为QPTase活性严格地与烟碱含量相关，所以其中植物根中的QPTase含量降低(与野生型植物中的含量相比)的转基因烟草植物的构造导致在叶子中具有减少的烟碱量的植物。本发明实施例提供用于制造所述转基因植物的方法和核酸构造以及所述的转基因植物自身。所述方法包括降低烟草根中的QPTase量的反义NtQPT1 RNA的表达。
本发明方面也关于编码QPTase或QPTase反义RNA分子的同义和反义重组DNA分子和包含那些重组DNA分子的载体以及以那些DNA分子和载体转化的转基因烟草细胞和植物。本文中所描述的转基因烟草细胞和植物的特征在于其与未改造或对照烟草细胞和植物相比具有减少的烟碱和/或TSNA量。
连接到本发明的反义构造的启动子可为原构性活性的启动子。可利用许多可在植物中操作的原构性活性启动子。一优选实例为在大多数植物组织中原构性表达的花椰菜花叶病毒(Cauliflower Mosaic Virus)(CaMV)35S启动子。在替代例中，如下文更详细的解释，所述启动子可为根特有启动子或根皮层特有启动子。
反义序列利用花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子在转基因烟草植物中表达。例如参看Cornelissen等人，″Both RNA Level and TranslationEfficiency are Reduced by Anti-Sense RNA in Transgenic Tobacco″，NucleicAcids Res.17，第833-43页(1989)；Rezaian等人，″Anti-Sense RNAs ofCucumber Mosaic Virus in Transgenic Plants Assessed for Control of the Virus″，Plant Mol.Biol.11，第463-71页(1988)；Rodermel等人，″Nuclear-OrganelleInteractionsNuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose BisphosphateCarboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants″，Cell 55，第673-81页(1988)；Smith等人，″Antisense RNA Inhibition of PolygalacturonaseGene Expression in Transgenic Tomatoes″，Nature 334，第724-26页(1988)；Van der Krol等人，″An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in TransgenicPlants Inhibits Flower Pigmentation″，Nature 333，第866-69页(1988)。
优选使用CaMV 35S启动子以使反义QPTase基因在经转化的烟草细胞和本发明植物中表达。已详细描述了使用CaMV启动子来使其它重组基因在烟草根中表达(Lam等人，″Site-Specific Mutations Alter In Vitro FactorBinding and Change Promoter Expression Pattern in Transgenic Plants″，Proc.Nat.Acad Sci.USA 86，第7890-94页(1989)；Poulsen等人″Dissection of 5′Upstream Sequences for Selective Expression of the Nicotiana plumbaginifoliarbcS-8B Gene″，Mol.Gen.Genet.214，第16-23页(1988))。
只在根组织中呈活性的其它启动子(根特有启动子)也尤其适用于本发明的方法。例如参看美国专利第5,459,252号直到Conkling等人；Yamamot等人，Plant Cell，3371(1991)。也可利用TobRD2根皮层特有启动子。例如参看美国专利申请案SN 08/508,786(现在允许)直到Conkling等人；PCT WO9705261。
本文中所描述的一些核酸也可用于同义共抑制或RNAi介导抑制烟碱制造的方法中。这些方法中所采用的同义DNA优选具有在于植物细胞中表达时足以抑制如本文中所描述的植物QPTase蛋白于彼植物细胞中自然表达的长度。所述同义DNA基本上可为完整的基因组或编码QPTase酶的补充DNA或其片段，其中所述片段通常在长度上为至少15、25、27、30、35、40、45、50、60、75、100、150、250、500、750个核苷酸。确定导致自然基因于一细胞中的表达受到抑制的同义DNA的长度的方法对于所述领域的技术人员来说是可利用的。
在一替代实施例中，以含有编码称为“核糖酶”的酶RNA分子的DNA区段的DNA构造转化烟草属植物细胞，所述酶RNA分子导向和裂解编码本文中所描述的植物QPTase的DNA的mRNA转录物。所述酶RNA分子在植物细胞中的制造和QPTase蛋白制造的破坏以与制造反义RNA分子基本相同的方式减少了植物细胞中QPTase活性也就是说，通过破坏mRNA在产生酶的细胞中的翻译。以下部分描述了又一种使用诱饵核酸片段降低烟碱生物合成中所涉及的特有酶的含量的方法。
降低烟碱和/或TSNA含量的分子诱饵技术将基于核酸的诱饵片段用于减少基因表达成为“分子诱饵”。在一优选实例中，“诱饵片段”对应于QPTase上游的启动子序列，减少QPTase表达。
在一些实施例中，经分离的核酸或其片段由至少20-450个连续核苷酸、适当地至少30-400个连续核苷酸、优选地50-350个连续核苷酸、且更优选地100-300个或200-400个连续核苷酸组成，其最优选地就是或含有至少一顺式作用调节元素，所述顺式作用调节元素存在于编码序列(例如SEQ.ID.No.1)的植物QPTase和/或腐胺甲基转移酶PMTase的上游。另一实例为从美国专利第5,459,252号中所揭示的序列获得Nic基因产物回应元素。在一些实施例中，所述Nic基因产物回应元素在NtQPT1启动子的-1000与-600或-700个碱基对之间。因此，如美国专利第5,459,252号中所揭示，一些实施例涉及300-400个核苷酸的长NtQPT1启动子片段，所述片段对应于-1000与-600或-700之间的NtQPT1启动子的序列。
因此，在若干实施例中，具体核酸具有促进与开始转录QPTase和/或PMTase中所涉及的一或多个转录因子(例如Nic1和Nic2)相互作用的结构。因此，所述核酸据称为或含有也成为“顺式作用调节元素”的至少一个转录因子(例如Nic1和Nic2)结合序列。通过将这些顺式作用调节元素(例如与Nic1和/或Nic2相互作用的序列)的多个复本引入一植物细胞中，可减小或压制转录因子开始转录目标基因(例如QPTase和/或PMTase基因)的能力。
通过一种方法，以来自编码(但不限于)烟碱生物合成中调节的QPTase和PMTase的基因的启动子的过量DNA序列(顺式作用元素)转化烟草植物。这些顺式作用元素优选整合于植物基因组中以便允许转移到连续后代。优选方法提供于实例4和实例5中。通常，与顺式作用DNA序列相互作用的Nic1和Nic1DNA结合蛋白在细胞中相对低含量下表达，因此，过量的转基因顺式作用元素将与与编码(但不限于)Nic1和Nic2可利用的QPTase和PMTase的基因相关的内源性元素竞争。因此，这些顺式作用DNA序列(和那些其它顺式作用元素的DNA序列)在本文中称为“诱饵”或“分子诱饵”。竞争降低了其同源顺式作用元素上的反式作用DNA结合蛋白的占有率，借此使烟碱生物合成酶的合成向下调节。
本发明的实施例也提供QPTase或PMTase的顺式作用元素的DNA分子和包含那些DNA分子的载体以及以那些DNA分子和载体转化的转基因植物细胞和植物。本发明的转基因烟草细胞和植物的特征在于比未转化的对照烟草细胞和植物低的烟碱含量。
各种顺式作用元素的任一者可取决于特定应用来进行分子诱饵方法。可单独使用或彼此组合使用的可用于本发明的实施例中的顺式作用元素(和对应的转录因子)的实例包括(但不限于)AS-1和ASF-1(参看美国专利4,990,607和5,223,419)、AATT重复元素和PABF(参看美国专利5,834,236和6,191,258)、来自马铃薯的伤害回应顺式作用元素(Siebert等人，Plant Cell1961-8(1989))、来自蚕豆的胚胎特有顺式作用元素(Bustos等人，Plant Cell1839-853(1989))、来自烟草RB7启动子的根特有顺式作用元素(美国专利5,459,252和Yamamoto等人，Plant Cell 3371-382(1991))、正性聚(dA-dT)调节元素和结合蛋白和负性CCCAA重复元素和结合蛋白(Wang等人，Mol.Cell Biol.123399-3406(1992))、来自烟草的烟草植物色素A1启动子的根尖调节元素(Adam等人，Plant Mol Biol 29983-993(1995))、来自玉米甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶4基因的厌氧生活回应元素(Geffers等人，Plant Mol Biol4311-21(2000))和来自阿布属油质蛋白(Arabidopsis oleosin)基因的种子特定调节区域(参看美国专利5,792,922)。
技术状态为大数据库列出了经识别的顺式作用调节区域，例如具有约1,340个条目的植物顺式作用调节元素(PLACE)和列出约159个植物启动子的植物顺式作用调节元素(PlantCARE)。这些数据库中所列出的顺式作用调节元素和Raumbauts等人，Nucleic acids Research 27295-296(1999)和Higo等人，Nucleic acids Research 27297-300(1999)中所提供的顺式作用调节元素可供本发明的实施例使用。以下部分描述了用于以经改造的序列转化烟草植物以制造具有低烟碱和/或TSNA含量的烟草植物的通用方法。
转基因植物细胞和植物本文中所提供的DNA序列可转化成各种主体细胞。在此项技术中可容易地得到具有合人心意的生长合处理性质的各种适合的主体细胞。如本文中所用的“自然DNA序列”或“天然DNA序列”意谓可从非转基因细胞或组织分离的DNA序列。自然DNA序列为那些未经过人工改变的DNA序列，如位点定向诱变。一旦识别自然DNA序列，就可使用如此项技术中所已知的重组DNA程序化学合成或制造具有自然DNA序列的DNA分子。自然的植物DNA序列通常可从非转基因的植物细胞或组织分离。
本发明的DNA构造或“转录序列盒”在转录方向的5′到3′可包括如本文中所讨论的启动子、如本文中所讨论的与所述启动子操作相关的DNA序列和视情况包括RNA聚合酶的停止信号和多聚腺嘌呤酶的多聚腺嘌呤信号的终止序列。如本文中所用的术语“操作相关”是指单一DNA分子上的DNA序列，所述DNA序列相关以使得一者的作用受另一者影响。因此，当启动子可影响DNA转录时，所述启动子与那个DNA操作相关(也就是说，DNA受启动子转录控制)。所述启动子据称为DNA的“上游”，反过来所述DNA据称为启动子的“下游”。在本发明的使用终止信号的实施例中，可使用任何适当的终止信号执行本发明，其实例包括(但不限于)胭脂碱合酶(nos)终止基因、章鱼碱合酶(ocs)终止基因、CaMV终止基因、或源自与转录起始区相同的基因或源自不同基因的天然终止信号。参见(例如)Rezian等人(1998)如上，和Rodermel等人(1998)如上。或者，如果通过分子诱饵技术而非反义或其它方法来降低烟碱含量，那么可通过任何方式向植物细胞提供具有或不具有另外序列的分子诱饵断片。举例来说，分子诱饵断片可具有编码一可选择标记的伴随基因，其它适当基因，或可以质粒载体部分的形式存在。分子诱饵断片可由单股或双股DNA或RNA分子组成。可将分子诱饵并入基因组或其可游离存在于细胞中。
可在也具有至少一复制系统的DNA构造中提供转录序列盒。方便起见，通常具有一在埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)(诸如Co1E1、pSC101、pACYC184或其类似物)中起作用的复制系统。以此方式，在各操作后的各阶段，可克隆、定序所得构造，并测定操作的正确性。此外，或者可使用广泛宿主范围的复制系统代替大肠杆菌复制系统，诸如使用P-1不相容性质粒(例如pRK290)的复制系统。除复制系统外，常将有至少一个可用于一或一个以上宿主的标记存在，或用于个体宿主的不同标记存在。也就是说，可使用一个标记进行原核宿主的选择，而可使用另一标记进行真核宿主(尤其为植物宿主)的选择。这些标记可保护对抗诸如抗生素、毒素、重金属或其类似物的杀生物剂；可通过向营养缺陷宿主传递原营养来提供互补；或可通过在植物中产生一种新的化合物而提供一种可见的表现型。
可通过适当复制系统的限制酶裂解和特定构造或断片插入可用部位而连续地引入包含各种构造、转录序列盒、标记和其类似物的各种断片。在接合和克隆后，可分离DNA构造以供进一步操作。在由例如J.Sambrook等人的Molecular Cloning、A Laboratory Manual(第2版，1989)(Cold SpringHarbor Laboratory)的文献中详细例示了所有这些技术。
可用于转化具有本发明的核酸构造的植物组织的载体包括土壤杆菌(Agrobacterium)载体和弹道载体两者，以及适于DNA介导转化的载体。术语“启动子”是指DNA序列中包括用于有效表达编码序列所必需的信号的区域。这可包括RNA聚合酶所结合的序列，但不限于这些序列，并可包括其它调节蛋白结合的区域连同控制蛋白质翻译所涉及的区域并可包括编码序列。
用于产生本发明的经转化烟草细胞和植物的QPTase重组DNA分子和载体可进一步包含一显性可选择标记基因。用于烟草中的适当显性可选择标记尤其包括编码新霉素磷酸转移酶(NPTII)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的抗生素抗药性基因。其它熟知的适用于烟草的可选择标记包括编码抗氨甲喋呤二氢叶酸还原酶的突变二氢叶酸还原酶基因。市场上可购得含有适当抗生素抗药性基因的DNA载体和相应抗生素。
通过将混合的细胞群放入含有适当浓度抗生素(或其它通常对烟草细胞具有毒性的化合物)的培养基中而将经转化的烟草细胞从周围未经转化的细胞群中选出，其中选定的显性可选择标记基因产品呈现出对抗生素的抗药性。因此，只有那些已经转化的烟草细胞将存活并繁殖。另外，可使用由Jefferson(例如WO 00055333、WO 09913085、美国专利第5599670、5432081和5268463号)所述的阳性选择技术。
制造本发明的重组植物的方法通常包括首先提供能够再生的植物细胞(所述植物细胞通常在能够再生的组织中)。接着用包含本发明转录序列盒的DNA构造转化所述植物细胞(如本文所述)并从经转化的植物细胞再生重组植物。如以下所解释，通过此项技术中已知的技术执行转化步骤，所述技术包括(但不限于)用微粒轰击植物细胞、装载转录序列盒、用含有承载转录序列盒的Ti质粒的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染细胞、或适于产生转基因植物的任何其它技术。
许多可用于执行本发明的土壤杆菌载体系统为已知的。举例来说，美国专利第4,459,355号揭示一种用含有Ti质粒的土壤杆菌菌株转化易感植物(包括双子叶植物)的方法。美国专利第4,795,855号中揭示用土壤杆菌载体对木本植物的转化。另外，Schilperoort等人的美国专利第4,940,838号揭示一种可用于执行本发明的双元土壤杆菌载体(即，一种其中土壤杆菌含有一种具有Ti质粒毒性区但不具有T区的质粒，和一种具有T区但不具有毒性区的第二质粒的土壤杆菌载体)。
承载本发明的DNA构造的微粒也可用于制造本发明的经转化植物，所述微粒适用于植物细胞的弹道转化。将所述微粒推进至植物细胞中以产生经转化的植物细胞，并从所述经转化植物细胞再生植物。任何适当的弹道细胞转化方法和装置皆可用于实施本发明。示范性装置和程序揭示于Sanford与Wolf的美国专利第4,945,050号中，和Christou等人的美国专利第5,015,580号中。当使用弹道转化程序时，可将转录序列盒并入能够在待转化的细胞中复制或整合至其中的质粒。适用于所述系统的微粒的实例包括1至5μm金质球体。可通过任何适当的技术(诸如通过沉淀)将DNA构造沉积于微粒上。
可用本发明的DNA构造通过植物细胞原生质体的DNA调节转化来转化植物物种，并随后根据此项技术中熟知的程序从经转化的原生质体再生植物。此项技术中已知用含DNA的脂质体或经由电穿孔融合烟草原生质体。(Shillito等人，“Direct Gene Transfer to Protoplasts of Dicotyledonous andMonocotyledonous Plants by a Number of Methods，IncludingElectroporation”，Methods Enzymol 153，第313-36页，(1987))。
如本文中所用，转化是指将外源性DNA引入细胞，以便产生用外源性DNA稳定转化的转基因细胞。通过应用此项技术中熟知的烟草细胞和组织培养技术诱导经转化细胞再生出完整的烟草植物。选择植物再生的方法以便与转化方法相容。如用于从受控杂交所得后代的DNA分析标准方法所揭示，QPTase序列于转基因烟草植物中的稳定存在和定向可通过QPTase序列的孟德尔式基因证明。在从经转化细胞再生转基因烟草植物后，可容易地将引入的DNA序列通过常规的植物培植实践转至其它烟草种类中并无需不当的实验。
可用本发明的载体转化任何能够随后通过器官发生或胚胎发生进行克隆繁殖的植物组织。本文中所用的术语“器官发生”意谓一种通过其从分生组织中心顺次形成枝条和根的方法；本文所用的术语“胚胎发生”意谓一种通过其从体细胞或配子以一致方式同时(非顺次)形成枝条和根的方法。选定的特定组织将取决于对于待转化的特定特种可用，和最适合的克隆繁殖系统而变化。示范性组织目标包括叶盘、花粉、胚芽、子叶、胚轴、愈伤组织、现有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导分生组织(例如子叶分生组织和胚轴分生组织)。
本发明的植物可采取多种形式。所述植物可为经转化细胞与非转化细胞的嵌合体；所述植物可为克隆转化体(例如，经转化而含有转录序列盒的所有细胞)；所述植物可包含经转化与未转化组织的移植体(例如接枝至柑橘物种的未转化接穗的经转化根茎)。可通过各种方式使经转化植物繁殖，诸如通过克隆繁殖或传统的培植技术。举例来说，可使第一代(或T1)经转化植物近亲繁殖以生出纯合的第二代(或T2)经转化植物，并通过传统的培植技术繁殖T2植物。一显性可选择标记(诸如nptII)可与转录序列盒相关联以有助于培植。
如本文中所用，将包含复数种本发明的、并为同属的植物的庄稼一同种植于农田中。因此，本发明提供一种产生植物庄稼的方法，与同物种和同种类的非转化植物的类似庄稼相比所述植物具有降低的QPTase或PMTase活性且因此具有降低的烟碱和/或TSNA含量。
本发明的转基因烟草植物中的烟碱含量可通过标准烟碱检定来检测。与未转化的对照植物相比QPTase或PMTase含量减少的经转化植物将相应具有与对照组相比减少的烟碱含量。
本文所述的经改造烟草植物适合常规的生长和收获技术(例如除去顶芽或不除去顶芽，将花装袋或不将花装袋，栽培于肥料富集的土壤中或无需肥料)。已收获的烟草叶和梗适合常规的处理方法，诸如烘烤和混合。经改造的烟草适用于任何传统的烟草产品，包括(但不限于)烟斗丝、雪茄和香烟用烟叶，和包括烟叶、烟丝或生切烟丝的任何形式的嚼烟。以下段落描述可用于在烟草收获后对其进行制备的典型烘烤方法。
烘烤通常持续约1周的烘烤过程使烟草产生香味和香气。可使用几种方法烘烤烟草，并且实际上许多方法已在先前揭示。举例来说，Johnson的美国专利第4,499,911号、Martinez Sagrera的5,685,710号、Fowler的3,905,123号和Home的4,192,323号描述了多方面的烟草烘烤方法，其可用于本发明的某些实施例。常规上，将载有烟草的“条状物”放入大型容器中并将其放入具有称为烘烤室的热源的封闭建筑物中。通常使用烟道控制烟(因此得以称为术语“烟道烘烤”)。在某些情况下，烘烤方法将取决于所要的戒烟产品的类型(即鼻烟、香烟或烟斗丝可优选地利用不同的烘烤方法)，并且优选方法可在地区间且在不同国家发生变化。在某些方法中，可在烘烤之前从叶除去叶的梗和中脉以产出高质量、低亚硝胺的烟草产品。
“烟道烘烤”为一种流行于美国弗吉尼亚(Virginia)、北卡罗来纳(NorthCarolina)和沿海平原地区的烤烟方法。这种方法主要用于生产香烟。烟道烘烤需要一装备通风系统和热源的封闭建筑物。可直接或间接(例如辐射热)进行加热。在热量和湿度受到控制时，叶色改变，水分得以快速除去，并且叶和梗干燥。谨慎监测加热和湿度可减少亚硝胺的累积。
另一种烘烤方法称为“空气烘烤”。在这种方法中，制备一开放框架，将叶的条状物(或全植物)悬挂于其中以便保护其免受风和阳光。叶色从绿色变成黄色，同时叶和梗慢慢干燥。
“火管烘烤”使用一种类似于烟道烘烤所用的密闭室。将烟草悬挂于低温火上以便在充满烟的空气中使叶得到烘烤。这种方法使用较低的温度，因此与经历约6至8天的烟道烘烤形成对比，这种方法可经历长达1个月。
另外一种称为“晒干”的烘烤方法是在阳光中使未覆盖的烟草叶的条状物或股状物干燥。最熟知的晒干烟草为土耳其(Turkey)、希腊(Greece)、南斯拉夫(Yugoslavia)和附近国家的称作东方烟草者。
烘烤方法，且最尤其为烟道烘烤方法通常分为以下4个阶段A)点火在这个步骤期间，烟草叶的颜色变为亮柠檬桔色，这是通过温度的逐步升高而达到的。
B)叶变黄在这个步骤期间任何水分得以除去。如此产生烟草的“变黄”。这也使烟草预备进行下一步骤的干燥。
C)叶干燥叶干燥是烘烤过程中的一个重要步骤，其需要更长的时间以使烟草适当干燥。此外，在这个步骤中增加空气流量以促进干燥过程。
D)梗干燥干燥过程继续，从而使烟草叶的梗变得干燥。
接着可将经烘烤的烟草与其它烟草或其它物质(其用于制成用于戒烟方法的产品)混合。以下段落描述混合和制备烟草产品的典型方法。
烟草混合人们可能希望，混合不同烟碱含量的烟草以制成具有所期望烟碱含量的戒断产品。这种混合过程通常在烘烤过程后进行，并且可通过常规方法进行。实例6和7中提供了优选的烟草混合方法。在一些实施例中，对转基因烟草实施混合来制备烟草以便其在特定产品中含有特定量的烟碱和/或TSNA。优选地，实施混合以便以特定产品制成不同烟碱和/或TSNA量的烟草产品。
一种含有不同类型烟草的混合物为含意地基本上完全均匀，以避免味道或烟碱含量的不当波动。通常待混合的烟草可具有介于30％与75％之间的水分含量。举例来说，首先将烟草切割或切丝成适当大小，接着在一诸如转筒或混合箱的混合设备中进行混合。一种此类已知的混合设备为一通常包含一旋转外壳的翻转装置，旋转外壳中封闭有多个附着于所述旋转外壳上并因此随外壳旋转的混合浆片，以在鼓转动时以一翻转动作将烟草组份搅拌在一起。
在将所需烟草彻底混合后，从混合装置中移去所得烟草混合物，并将其堆积以提供连续、通常均匀数量的烟草混合物。接着在进行随后的操作之前，使烟草在所需时段内保持相对原状(称为“堆积步骤”)。堆积步骤通常持续30分钟或更短时间，并且可在一传送带上执行。在连续将烟草混合物从混合阶段移动至膨胀阶段的整个过程中，传送带允许混合烟草在原状条件下保持处于堆积形式。
通常通过施加蒸汽使烟草混合物膨胀。通常使烟草混合物在大气条件下经历持续至少10秒钟的每磅混合烟草至少0.25磅的饱和蒸汽，以向烟草混合物提供至少2重量％的水分增加。在烟草混合物已膨胀后，将其干燥。一典型干燥装置使用热空气或过热蒸汽在热空气或蒸汽流传送烟草通过一干燥室或一系列干燥室时将烟草干燥。通常，干燥空气的湿球温度可为约华氏150度至约华氏211度。通常将烟草混合物干燥至约60％至约5％的水分含量。接着如下所述以适当方式将经干燥、膨胀的烟草混合物加工成戒烟产品。
烟碱减少和/或戒烟计划方法本发明也涵盖可将本文所述的低烟碱和/或TSNA烟草加工并与常规烟草混合以便制造广泛范围的具有不同烟碱和/或亚硝胺量的烟草产品。这些混合烟草产品可用于烟碱减少和/或戒烟计划以便使消费者从高烟碱和TSNA产品转而使用低烟碱和TSNA产品。
在本发明的一些实施例中，可使用以上所述的低烟碱、低TSNA产品建立一多级的烟碱减少和/或戒烟计划。举例来说，起初所述计划的参与者确定他或她的当前烟碱摄取水平。接着所述计划的参与者开始计划的第1步骤，其中所用烟草产品与计划开始前所用的烟草产品相比具有减少的烟碱量。在一段时间后，所述计划的参与者继续进行第2步骤，其中使用与第1步骤中所用的产品相比具有更少烟碱的烟草产品。经过另一段时间后，所述计划的参与者到达第3步骤，其中所述计划的参与者开始使用与第2步骤中的产品相比具有更少烟碱的烟草产品，诸如此类。最后，所述计划的参与者所使用的烟草产品具有与足以成瘾或维护成瘾性相比更少量的烟碱。因此，烟碱减少和/或戒烟计划限制计划的参与者接触烟碱，并且相伴地烟碱的有害作用仍保留成瘾的第二因素，其包括(但不限于)烟摄入、口欲滞留和味道。
举例来说，吸烟者可在计划开始时吸具有5mg烟碱和1.5μg亚硝胺的混合香烟，逐步转而吸具有有3mg烟碱和1μg亚硝胺的香烟，继而为具有1mg烟碱和0.5μg亚硝胺的香烟，继而为具有0.5mg烟碱和0.25μg亚硝胺的香烟，继而为具有小于0.1mg烟碱和小于0.1μg TSNA的香烟直至消费者决定只吸实际上不具有烟碱和亚硝胺的香烟或完全放弃吸烟。优选地，遵循一个3步骤的计划，借此在第1步骤中，使用含有0.6mg烟碱和小于2μg/g TSNA的香烟；在第2步骤中，使用含有0.3mg烟碱和小于1μg/g TSNA的香烟；并在第3步骤中，使用含有小于0.1mg烟碱和小于0.7μg/g TSNA的香烟。更优选地，遵循一个3三步骤的计划，借此在第1步骤中，使用含有0.6mg烟碱和小于2μg/g TSNA的香烟；在第2步骤中，使用含有0.3mg烟碱和小于1μg/g TSNA的香烟；并在第3步骤中，使用含有小于0.05mg烟碱和小于0.7μg/g TSNA的香烟。相应地，本文所述的混合香烟为一种在人体中以逐步方式降低致癌潜力的方法提供基础。
本文所述的方法通过允许个体保留诸如烟摄入、口欲滞留和味道的成瘾第二因素，同时逐步减少所消耗的成瘾烟碱含量来促进烟草使用的戒断。最后，因为对于烟碱成瘾性的存在逐步减少同时允许个体维持对上述第二因素的依赖，所以可达到完全的戒断。
举例来说，实施例包括多级的烟草产品混合物，将其制备成具有各种烟碱量。这些多级混合物可经制成而具有减少含量的TSNA和不同量的烟碱。举例来说，香烟可含有每支香烟(例如)5mg、4、3、2、1、0.5、0.1或0mg的烟碱。更优选地，混合香烟含有小于0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％和0.6％的烟碱。
在本发明的另一方面中，包装不同烟碱含量的香烟并清楚指出所存在的烟碱的含量，并作为戒烟计划来销售。一种生产用于烟碱减少和/或戒烟计划的产品的优选方法提供于实例8中。个体可希望通过省略每支香烟的等级烟碱含量来加速所述计划或在某些步骤停留直至准备就续进行下一含量。本发明的多个方面显著地允许消费者地通过选择本文所述的特定烟草产品来个体性选择所摄入的烟碱量。另外，因为维持成瘾的第二因素，所以可迅速降低对烟碱的依赖。
烟碱减少和/或戒烟计划限制计划参与者对烟碱的接触，同时保留成瘾的第二因素。这些第二因素包括(但不限于)烟摄入、口欲滞留和味道。因为第二因素仍存在，所以与依赖于向计划参与者提供烟碱但除去上述第二因素的计划相比所述计划的参与者更可能成功地实现烟碱减少和/或戒烟计划。最终，计划参与者所使用的烟草产品具有小于足以成瘾之量的烟碱。
在本发明的另一方面中，个体可进行选择以只获得具有每支香烟小于0.05mg烟碱的香烟。一些诸如需要立即停止烟碱摄取的个体(例如，具有医学症状的个体或使用与烟碱相互作用的药物的个体)可发现这种方法的适用的。对于一些个体，只在口腔中存在香烟即可足以容易地戒除烟碱成瘾性。吸烟的成瘾特性可由于无烟碱的香烟而逐步降低。这些个体接着能够完全放弃吸烟。
在本发明的另一方面中，将多包含有等级烟碱含量的香烟作为一“戒烟套组”来提供。希望放弃吸烟的个体可在计划开始时购买整个套组的香烟。因此避免任何在烟草柜台购买香烟时可能出现的诱惑。因此，对于某些个体这种方法更可能获得成功。所述套组的一个优选实例提供于实例9中。
以下列出的实例用以说明本发明，并且不对其构成限制。
实例1分离和定序TobRD2 cDNA(Conkling等人，Plant Phys93，1203(1990))编码QPTase，预测QPTase为一种胞内蛋白质。NtQPT1氨基酸序列与GenBank数据库的比较揭示与某些细菌和其它蛋白质的有限顺序相似性，已表明喹啉基磷酸核糖基转移酶(QPTase)对鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)、大肠杆菌和普通烟草(N.tabacum)基因的活性。。NtQPT1编码的QPTase与拟南芥菜(Arabidopsis)EST(表达序列标签)序列(Genbank入藏登记号F20096)所编码的推导肽断片具有相似性，所述EST序列可代表拟南芥菜QPTase基因的部分。
实例2烟草植物的转化反义定向的QPTase基因的DNA可操作地与一植物启动子(CaMV 35S或TobRD2根-皮层特有启动子)相连以产生两个不同的DNA序列盒CaMV35S启动子/反义QPTase编码基因和TobRD2启动子/反义QPTase编码基因。
选择野生型烟草系和低烟碱烟草系供转化，例如野生型白肋烟21烟草(Nic1+/Nic2+)和纯合Nic1-/Nic2-白肋烟21。使用各DNA序列盒转化来自各系的复数个烟草植物细胞。使用土壤杆载体实施转化，例如使用土壤杆菌双元载体，其承载Ti边界序列和nptII基因(对卡那霉素呈现抗药性且在nos启动子(nptII)的控制下)。
选择经转化细胞并将其再生为称为R0的转基因烟草植物。使R0植物生长成熟并测试烟碱含量；一个子集的转化烟草植物与未转化的对照植物相比展示出显著较低的烟碱含量。
接着将R0植物近亲繁殖并分析下一代(R1后代)的转基因分离。使R1后代生长成熟并使其进行近亲繁殖；R2后代中的转基因分离指出对于转基因所述R1后代植物为纯合的。
实例3具有减少烟碱含量的烟草用双元土壤杆菌载体pYTY32转化种类白肋烟21LA的烟草以产生低烟碱烟草种类，载体21-41。所述双元载体pYTY32承载2.0kb NtQPT1根-皮层特有启动子(其驱动NtQPT1 cDNA的反义表达)和来自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的胭脂碱合酶(nos)3′终止基因序列。对于这种构造的可选择标记为来自大肠杆菌Tn5的新霉素磷酸转移酶(nptII)，其对卡那霉素呈现抗药性，并且通过来自根瘤土壤杆菌T-DNA的nos启动子来检测表达nptII。经转化细胞、组织和籽苗通过其在含有300μg/ml卡那霉素的穆拉许给-史酷格(Murashige-Skoog)(MS)培养基上生长的能力进行选择。白肋烟21LA为一个白肋烟21的变种，其与白肋烟21相比具有实质上减少的烟碱含量(即，白肋烟21LA具有8％的白肋烟21的烟碱含量，参见Legg等人，Can J Genet Cytol，13287-91(1971)、Legg等人，J Hered，60213-17(1969))。
允许1至100个白肋烟21LA的独立pYTY32转化体(T0)进行近亲繁殖。近亲繁殖的植物后代(T1)在含有卡那霉素的培养基上发芽并记数检查卡那霉性抗药性的分离。单一基因座位的转化产生分离3∶1的T1后代，并使其经历进一步的分析。
使用微检定技术定性测量分离3∶1的T1后代的烟碱含量。大致收集约200mg的新鲜烟草叶，并在1ml的提取溶液(提取溶液100ml H2O中的1ml乙酸)中研磨。将均浆在14,000xg下离心5分钟并将上清液移至一个清洁试管中，向其中添加下列试剂100μL NH4OAC(5g/100ml H2O+50μLBrij 35)、500μL溴化氰(Sigma C-6388、0.5g/100ml H2O+50μL Brij 35)、400μL苯胺(100ml NH4OAC+50μL Brij 35中的0.3ml缓冲苯胺)。制备提取溶液中10mg/ml的烟碱标准储备溶液，并将其稀释以制成标准系列以供校准。读取460nm下的吸收率并使用标准校准曲线测定测试样品的烟碱含量。
允许具有小于10％的白肋烟21LA母体的烟碱含量的T1后代近亲繁殖以产生T2后代。通过种子在含有卡那霉素的培养基上发芽并选择其中100％后代对卡那霉素具有抗药性的纯系(即经分离4∶0；纯合后代将分离3∶1)来识别纯合的T2后代。使用微检定来定性测定纯合和杂合T2后代中的烟碱含量，并且再次显示出小于10％白肋烟21LA母体的含量。将纯合T2后代的叶样品送到威尔逊市(Wilson，NC)的南部研究和测试实验室(SouthernResearch and Testing Laboratory)以供使用气相色谱/火焰电离检测(GC/FID)对烟碱含量进行定量分析。第41号转化体的纯合T2后代产生最低的烟碱含量(约70ppm)，并将此转化体命名为“载体21-41”。
允许载体21-41植物近亲繁殖杂交，从而产生T3后代。使T3后代生长并定性和定量地检定烟碱含量。允许T3后代近亲繁殖杂交，从而产生T4后代。使T4后代的体积大的种子样品生长并测试烟碱含量。
通常，在所有经评定的特征中载体21-41与白肋烟21LA相似，例外者为生物碱含量和总还原糖(例如烟碱和非烟碱物)。通过载体21-41实质上减少的烟碱、非烟碱物和总生物碱含量而可将其与母体白肋烟21LA相区别。如下文所示，载体21-41中的总生物碱含量大致相对于母体白肋烟21LA中的含量显著减少，并且与白肋烟21LA相比载体21-41中的烟碱和非烟碱物浓度显示出显著减少。与白肋烟21LA相比载体21-41也具有显著较高的还原糖含量。
在中央农作物研究站(Central Crops Research Station)(克莱顿市(Clayton，NC))执行载体21-41 T4后代的农田试验，并与白肋烟21LA母体相比较。设计为3种处理(载体21-41，只承载NtQPT1启动子的白肋烟21LA经转化系[启动子-对照]和未转化的白肋烟21LA[野生型])、15个复制、每复制10个植物。测量并比较下列的农业学特点移植至开花的天数、开花时的高度、开花时叶数目、产量、烟碱百分比、非烟碱物百分比、总氮百分比和还原糖百分比。
也在5个州(宾夕法尼亚(Pennsylvania)、密西西比(Mississippi)、路易斯安那(Louisiana)、衣阿华(Iowa)和伊利诺斯(Illinois))由600名以上的农民在大约5000英亩的土地上种植载体21-41。由美国农业、农业市场服务部(US Department of Agriculture，Agriculture Marketing Service)(USDA-AMS)使用FTC方法来量化取自这些农田的2,701份样品的烟碱含量(表示为每份干重的烟碱百分比)。烟碱含量在0.01％至0.57％的范围内。对于所有这些样品的平均烟碱含量百分比为0.09％，中值为0.07％。白肋烟草栽培品种通常具有介于2％与4％干重之间的烟碱含量(Tso，T.C.，1972，Physiology and Biochemistry of Tobacco Plants.Dowden，Hutchinson，and Ross，Inc.Stroudsbury)。
实例4使用分子诱饵调节NtQPT1基因表达将处在NtQPT1启动子的-1000与-600或-700bp之间的核苷酸序列以串联排列插入植物-土壤杆菌穿梭载体中并随后通过所属领域的技术人员已知的方法将其转化为烟草。评定用所述载体稳定转化的植物的NtQPT1表达水平和烟碱和/或TSNA含量。这些实验表明用与Nic基因产品相互作用的分子诱饵转化的烟草展示出降低的NtQPT1表达水平。
实例5使用分子诱饵所产生的具有减少的烟碱和/或TSNA含量的烟草将NtQPT1启动子的大约300或400核苷酸长度的断片的多个副本(例如包括处于NtQPT1启动子的-1000与-600或-700bp之间的核苷酸序列)(例如通过沉淀)附加至适于弹道转化植物细胞的微粒(例如1至5μm的金质球体)上。使用任何适当的弹道转化技术将所述微粒推进至烟草植物细胞(例如白肋烟21LA)中，以便产生经转化的植物细胞。接着从经转化的植物细胞再生植物。白肋烟21LA为一个白肋烟21的变种，其与白肋烟21相比具有实质上减少的烟碱含量(即，白肋烟21LA具有8％的白肋烟21的烟碱含量，参见Legg等人，Can J Genet Cytol，13287-91(1971)、Legg等人，J Hered，60213-17(1969))。
使经转化的细胞、组织和籽苗在穆拉许给-史酷格(MS)培养基上生长，所述培养基具有或不具有例如抗生素的选择化合物，此取决于是否使用可选择标记。允许1至100个白肋烟21LA的独立转化体(T0)近亲繁殖。使近亲繁殖的后代(T1)发芽。使用微检定技术定性测量T1后代的烟碱含量。收集大约200mg的新鲜烟草叶并将其在1ml的提取溶液(提取溶液100mlH2O中的1ml乙酸)中研磨。将均浆在14,000xg下离心5分钟并将上清液移至一个清洁试管中，向其中添加下列试剂100μL NH4OAC(5g/100mlH2O+50μL Brij 35)、500μL溴化氰(Sigma C-6388、0.5g/100ml H2O+50μL Brij 35)、400μL苯胺(100ml NH4OAC+50μL Brij 35中的0.3ml缓冲苯胺)。制备提取溶液中10mg/ml的烟碱标准储备溶液，并将其稀释以制成标准系列以供校准。读取460nm下的吸收率并使用标准校准曲线测定测试样品的烟碱含量。
允许具有小于10％的白肋烟21LA母体的烟碱含量的T1后代近亲繁殖以产生T2后代。接着识别纯合的T2后代。也使用微检定定性测定纯合和杂合T2后代的烟碱含量。也将纯合T2后代的叶样品送到威尔逊市的南部研究和测试实验室以供使用气相色谱/火焰电离检测(GC/FID)定量分析烟碱含量。纯合的T2后代与未转化的烟草相比具有实质上减少的烟碱含量(例如约70ppm)。因为所述植物中的烟碱含量实质上减少，所以这些植物中的TSNA含量随之减少。
这些实验表明用与Nic基因产品相互作用的分子诱饵转化的烟草展示出减少的烟碱和/或TSNA量。使用具有多重分子诱饵串联插入物的植物产生具有商业价值的烟草产品，其中所述分子诱饵已降低NtQPTl表达并减少烟碱/TSNA含量。
实例6低烟碱和亚硝胺的混合烟草下列实例描述几种通过混合制成具有特定烟碱和/或TSNA量的烟草产品。某些混合方法以从具有极低烟碱和/或TSNA量的种类制备的烟草开始。通过将从低烟碱/TSNA种类(例如检测不到的烟碱和/或TSNA含量)制备的烟草与常规烟草(例如具有30,000百万分率(ppm)烟碱和8,000十亿分率(ppb)TSNA的白肋烟；具有20,000ppm烟碱和300ppb TSNA的烟道烤烟；和具有10,000ppm烟碱和100ppb TSNA的东方烟)混合，可生产实际上具有任何所要烟碱和/或TSNA量的烟草产品。其它方法只混合低烟碱/TSNA烟草(经基因改造的白肋烟、经基因改造的弗吉尼亚烟道烤烟、和经基因改造的东方烟草，其含有减少的烟碱和/或TSNA量)。可将具有各种烟碱和/或TSNA量的烟草产品并入戒烟套组和计划中以帮助烟草使用者降低或消除其对烟碱的依赖并降低致癌潜力。
通过一种方法，第1步骤烟草产品由大约25％的低烟碱/TSNA烟草和75％的常规烟草组成；第2步骤烟草产品可由大约50％的低烟碱/TSNA烟草和50％的常规烟草组成；第3步骤烟草产品可由大约75％的低烟碱/TSNA烟草和25％的常规烟草组成；并且第4步骤烟草产品可由大约100％的低烟碱/TSNA烟草和0％的常规烟草组成。戒烟套组可包含一定量的来自各前述混合物的烟草产品以满足消费者的单月计划。也就是说，如果消费者为一名每天一包烟的吸烟者，(例如)单月套组应提供每步骤中7包，总计28包的香烟。各戒烟套组应包括一组特定指导消费者通过分步过程的说明。当然，具有特定烟碱和/或TSNA量的烟草产品应可以适宜分级的量(例如盒装雪茄、包装香烟、听装鼻烟或成捻的嚼烟)获得以便消费者可选择个体所要的烟碱和/或TSNA量。存在许多种使用本文所述的教示获得各种低烟碱/低TSNA烟草混合物的方法，并且以下只是有意向所属领域的技术人员指导一种可行的方法。
为获得作为25％低烟碱/TSNA混合物的第1步骤烟草产品，可将从大约0ppm烟碱/TSNA烟草制备的烟草分别与常规的白肋烟、烟道烤烟或东方烟以25％/75％的比率混合以获得具有22,500ppm烟碱和6,000ppb TSNA的白肋烟草产品，具有15,000ppm烟碱和225ppb TSNA的烟道烘烟产品，和具有7,500ppm烟碱和75ppb TSNA的东方烟产品。类似地，为获得作为50％低烟碱/TSNA混合物的第2步骤产品，将从大约0ppm烟碱/TSNA烟草制备的烟草分别与常规的白肋烟、烟道烤烟或东方烟以50％/50％的比率混合以获得具有15,000ppm烟碱和4,000ppb的白肋烟草产品，具有10,000ppm烟碱和150ppb TSNA的烟道烤烟产品，和具有5000ppm烟碱和50ppb TSNA的东方烟产品。另外，对于作为75％/25％低烟碱/TSNA混合物的第3步骤产品，可将从大约0ppm烟碱/TSNA烟草制备的烟草与分别常规的白肋烟、烟道烤烟或东方烟以75％/25％的比率混合以获得具有7,500ppm烟碱和2,000ppb TSNA的白肋烟草产品，具有5,000ppm烟碱和75ppb TSNA的烟道烤烟产品，和具有2,500ppm烟碱和25ppb TSNA的东方烟产品。
应了解烟草产品通常为一种许多不同类型烟草的混合物，所述烟草生长于世界的许多不同地方的各种生长条件下。因此，在农作物之间烟碱和TSNA的量将是不同的。然而，通过使用常规技术可容易地测定每种农作物的平均烟碱和TSNA量用以制造所要的混合物。通过调节构成混合物的各种类型的烟草的量，技术人员可在烟碱和/或TSNA的量与诸如外观、香味和点燃抽吸性的其它考虑因素之间达成平衡。以这种方式，可制造各种类型的具有不同烟碱和/或亚硝胺含量，以及外观、香味和点燃抽吸性的烟草产品。
实例7低烟碱和亚硝胺的混合烟草通过一种优选的方法，将常规的弗尼吉亚烟道烟草与经基因改造的白肋烟(即含有显著减少的烟碱和亚硝胺量的白肋烟)混合以产出一种混合烟草，将其并入3种烟碱含量减少的香烟中含有0.6mg烟碱的第1步骤香烟，含有0.3mg烟碱的第2步骤香烟和含有小于0.05mg烟碱的第3步骤香烟。发现TSNA的总量在介于大约0.17μg/g至0.6μg/g之间的范围内。
在一些香烟中，混合物的大约28％为弗尼吉亚烟道烟草，混合物的大约29％为经基因改造的白肋烟(即烟碱减少的白肋烟)，混合物的大约14％为东方烟，混合物的大约17％为经膨胀的烟道烤烟梗，并且大约12％为标准的市售再造烟草。含有这种混合物的香烟中TSNA的总量大约为1.5μg/g。
实例8含有低烟碱和亚硝胺含量的烟碱减少和/或戒烟计划以下实例描述一种利用本发明的低烟碱、低TSNA烟草产品进行的烟碱减少和/或戒烟计划。将含有非常低TSNA含量和几乎几烟碱的经改造的烟草与具有已知烟碱量的烟草混合以产生每支香烟特定、分级的烟碱含量。举例来说，将弗尼吉亚烟道烟草与经基因改造的白肋烟(即含有显著减少烟碱和亚硝胺量的白肋烟)混合以产出一种混合烟草，将其并入3种烟碱含量减少的香烟中含有0.6mg烟碱的第1步骤香烟，含有0.3mg烟碱的第2步骤香烟和含有小于0.05mg烟碱的第3步骤香烟。在包装上清楚标出分级的成包香烟的烟碱含量，并且也要清楚标出分级烟碱减少计划的步骤。每周使用者购买数包含有依次更低烟碱含量的香烟，但限制其本身每天所消费的香烟不超过先前。使用者可根据个体需要通过以下选择来定义他/她自身的烟碱减少和/或戒烟速率a)每天所抽的香烟数，b)起始的烟碱量，c)每周每支香烟中烟碱含量的变化，和d)每天所消耗烟碱的最终量。为保持对计划的更好跟踪，个体需保留总烟碱摄取量的每日记录，以及每天所消费的香烟数。最后，个体将消费几乎无烟碱的烟草产品。由于最终步骤的无烟碱烟草产品为非成瘾性的，所以接着应更佳容易地完全放弃烟草产品的使用。
实例9含有成包的具有低TSNA含量和分级减少的烟碱含量的香烟的烟碱减少和/或戒烟套组制备各种烟碱减少和/或戒烟套组以适合体重重、中或轻的吸烟者。所述套组提供所有两周时期(快速)、1个月时期(中速)或两个月时期(慢速)(此取决于套组)内放弃吸烟所需的物质。各套组含有许多组成包的根据本发明经改造的香烟，其含有第1步骤含有0.6mg烟碱的香烟，第2步骤含有0.3mg烟碱的香烟和第3步骤含有小于0.05mg烟碱的香烟。举例来说，1天1包的吸烟者应接受7包香烟，各包中每支香烟含有上述的烟碱量。也应在套组中提供与几周相等值对应的另外的每支香烟含有小于0.05mg烟碱的香烟以使消费者熟悉抽无烟碱的香烟。所述套组也应含有一个对每日烟碱摄取量保持跟踪的日记本，使个体对继续戒断计划保持兴趣的促进文学作品，对于戒烟益处的健康信息，和进行查找诸如聊天组群、会话、通讯、近期出版物和相关链接的另外控烟信息的web网站。
尽管已参考实施例和实例来描述本发明，但应了解可在不背离本发明实质的情况下作出各种修改。因此，本发明只受限于以下的权利要求。
序列表<110>维克多烟草公司<120>减少经口或经皮传递烟碱的有害影响的方法<130>VTOB.138VPC<150>60/475,945<151>2003-06-04<160>1<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1399<212>DNA<213>烟草<400>1caaaaactat tttccacaaa attcatttca caaccccccc aaaaaaaaac catgtttaga 60gctattcctt tcactgctac agtgcatcct tatgcaatta cagctccaag gttggtggtg 120aaaatgtcag caatagccac caagaataca agagtggagt cattagaggt gaaaccacca 180gcacacccaa cttatgattt aaaggaagtt atgaaacttg cactctctga agatgctggg 240aatttaggag atgtgacttg taaggcgaca attcctcttg atatggaatc cgatgctcat 300tttctagcaa aggaagacgg gatcatagca ggaattgcac ttgctgagat gatattcgcg 360gaagttgatc cttcattaaa ggtggagtgg tatgtaaatg atggcgataa agttcataaa 420ggcttgaaat ttggcaaagt acaaggaaac gcttacaaca ttgttatagc tgagagggtt 480gttctcaatt ttatgcaaag aatgagtgga atagctacac taactaagga aatggcagat 540gctgcacacc ctgcttacat cttggagact aggaaaactg ctcctggatt acgtttggtg 600gataaatggg cggtattgat cggtgggggg aagaatcaca gaatgggctt atttgatatg 660gtaatgataa aagacaatca catatctgct gctggaggtg tcggcaaagc tctaaaatct 720gtggatcagt atttggagca aaataaactt caaatagggg ttgaggttga aaccaggaca 780attgaagaag tacgtgaggt tctagactat gcatctcaaa caaagacttc gttgactagg 840ataatgctgg acaatatggt tgttccatta tctaacggag atattgatgt atccatgctt 900aaggaggctg tagaattgat caatgggagg tttgatacgg aggcttcagg aaatgttacc 960cttgaaacag tacacaagat tggacaaact ggtgttacct acatttctag tggtgccctg 1020acgcattccg tgaaagcact tgacatttcc ctgaagatcg atacagagct cgcccttgaa 1080gttggaaggc gtacaaaacg agcatgagcg ccattacttc tgctataggg ttggagtaaa 1140agcagctgaa tagctgaaag gtgcaaataa gaatcatttt actagttgtc aaacaaaaga 1200tccttcactg tgtaatcaaa caaaaagatg taaattgctg gaatatctca gatggctctt 1260ttccaacctt attgcttgag ttggtaattt cattatagct ttgttttcat gtttcatgga 1320atttgttaca atgaaaatac ttgatttata agtttggtgt atgtaaaatt ctgtgttact 1380tcaaatattt tgagatgtt1399
权利要求
1.一种制造烟碱减少的混合烟草的方法，其包含提供一第一烟草；提供一从经基因改造的烟草植物产生的第二烟草，与未经改造的同种类烟草植物相比，所述经基因改造的烟草植物包含减少的QPTase含量；和将所述第一烟草与所述第二烟草混合以获得所述烟碱减少的烟草。
2.一种烟草产品，其包含通过根据权利要求1所述的方法产生的烟碱减少的混合烟草。
3.一种制造TSNA减少的混合烟草的方法，其包含提供一第一烟草；提供一从经基因改造的烟草植物产生的第二烟草，与未经改造的同种类烟草植物相比，所述经基因改造的烟草植物包含减少的QPTase含量；和将所述第一烟草与所述第二烟草混合以获得所述TSNA减少的烟草。
4.一种烟草产品，其包含通过根据权利要求3所述的方法产生的TSNA减少的混合烟草。
5.一种制造具有所期望烟碱量的烟碱减少的烟草产品的方法，其包含提供一第一烟草，其中所述第一烟草具有经测量的烟碱量；提供一从经基因改造的烟草植物产生的第二烟草，与未经改造的同种类烟草植物相比，所述经基因改造的烟草植物包含减少的QPTase含量，其中所述第二烟草具有经测量的烟碱量；和将所述第一烟草与所述第二烟草混合以产生具有所期望烟碱量的烟碱减少的烟草产品。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述烟碱减少的烟草产品是混合型香烟。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述混合型香烟包含0.6mg或更少的烟碱。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述混合型香烟包含0.3mg或更少的烟碱。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述混合型香烟包含0.05mg或更少的烟碱。
10.一种烟草产品，其包含通过一选自由权利要求5、权利要求6、权利要求7、权利要求8和权利要求9所组成的组群的方法产生的烟碱减少的混合烟草。
11.一种戒烟套组，其包含一选自根据权利要求2、权利要求4或权利要求10所述的烟草产品。
12.一种制造具有所期望TSNA量的TSNA减少的烟草产品的方法，其包含提供一第一烟草，其中所述第一烟草具有经测量的TSNA量；提供一从经基因改造的烟草植物产生的第二烟草，与未经改造的同种类烟草植物相比，所述经基因改造的烟草植物包含减少的QPTase含量，其中所述第二烟草具有经测量的TSNA量；和将所述第一烟草与所述第二烟草混合以产生具有所期望TSNA量的TSNA减少的烟草产品。
13.一种减少烟草使用者的烟碱消耗量的方法，其包含向所述烟草使用者提供一第一烟草产品，其包含从经改造的烟草植物产生的烟草，与未经改造的同种类烟草植物相比，所述经改造的烟草植物包含减少的QPTase含量；和向所述烟草使用者提供一第二烟草产品，其包含从经改造的烟草植物产生的烟草，与未经改造的同种类烟草植物相比，所述经改造的烟草植物包含减少的QPTase含量，其中与所述第一烟草产品相比，所述第二烟草产品包含更少的烟碱；向所述烟草使用者提供另外的烟草产品，其包含从经改造的烟草植物产生的烟草，与未经改造的同种类烟草植物相比，所述经改造的烟草植物包含减少的QPTase含量，其中从包含比所述第一或第二烟草产品更少烟碱的第三产品开始，所述随后的烟草产品包含依次减少的烟碱量。
14.一种减少烟草使用者的TSNA消耗量的方法，其包含向所述烟草使用者提供一第一烟草产品，其包含从经改造的烟草植物产生的烟草，与未经改造的同种类烟草植物相比，所述经改造的烟草植物包含减少的QPTase含量；和向所述烟草使用者提供一第二烟草产品，其包含从经改造的烟草植物产生的烟草，与未经改造的同种类烟草植物相比，所述经改造的烟草植物包含减少的QPTase含量，其中所述第二烟草产品包含比所述第一烟草产品更少的TSNA；向所述烟草使用者提供另外的烟草产品，其包含从经改造的烟草植物产生的烟草，与未经改造的同种类烟草植物相比，所述经改造的烟草植物包含减少的QPTase含量，其中从包含比所述第一或第二烟草产品更少TSNA的第三产品开始，所述随后的烟草产品包含依次减少的TSNA量。
15.一种包含减少的QTPase量的烟草植物产生的经基因改造的烟草在制备一包含经选择烟碱量的混合烟草产品的用途。
16.一种包含减少的QTPase量的烟草植物产生的经基因改造的烟草在制备一包含经选择TSNA量的混合烟草产品的用途。
17.根据权利要求15或16所述的用途，其中所述混合烟草产品是混合型香烟。
18.根据权利要求15或16所述的用途，其中所述混合烟草产品是包含0.6mg或更少烟碱的混合型香烟。
19.根据权利要求15或16所述的用途，其中所述混合烟草产品是包含0.3mg或更少烟碱的混合型香烟。
20.根据权利要求15或16所述的用途，其中所述混合烟草产品是包含0.05mg或更少烟碱的混合型香烟。
全文摘要
本发明大体来说是关于减小在常规的戒烟计划中经口或经皮递送的烟碱的有害影响。更具体来说，实施例是关于通过提供含有减少的烟碱和烟草特有亚硝胺(TSNA)量的烟草产品来减小与常规的戒烟计划相关的烟碱摄入的有害影响的方法。
文档编号A01H5/00GK1812811SQ200480015279
公开日2006年8月2日 申请日期2004年5月27日 优先权日2003年6月4日
发明者马克·康克林 申请人:维克多烟草公司