一种或多种氨基酸的水平增加的植物的制作方法

专利名称：一种或多种氨基酸的水平增加的植物的制作方法
技术领域：
本发明要求以2003年5月7日提交的美国临时申请No.60/468,727作为优先权，在此通过引用的方式将该申请包括于本文内。
本发明的领域是农业生物技术。更具体地，本发明涉及增加植物内氨基酸水平的生物技术方法。
很多种重要的作物，包括大豆和玉米，都没有含有足够数量或达到正确平衡的使得营养完善的若干种氨基酸。对于带支链的氨基酸(Branched Chained amino acids，BCAA)亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸来说尤其如是。BCAA是必要的氨基酸，因为人类不能合成这些分子，因此必须从膳食中获取。异亮氨酸是合成自苏氨酸的带支链氨基酸。苏氨酸自身又是从天冬氨酸合成来的。天冬氨酸和BCAA之间的合成路径涉及到若干种酶，所述的酶受到若干种氨基酸的变构抑制。在对BCAA的合成中使用的酶包括天冬氨酸激酶(AK)、双功能天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶(AK-HSDH)、异丙基苹果酸合酶、苏氨酸脱氨酶(TD)以及乙酰羟酸合酶(AHAS)。具体而言，苏氨酸脱氨酶(EC 4.2.1.16)(TD，苏氨酸脱水酶；L-苏氨酸水解酶(脱氨基))和乙酰羟酸合酶(AHAS；乙酰乳酸合酶(EC 4.1.3.18))是BCAA生物合成过程中的关键酶。
在E.coli中，苏氨酸脱氨酶以单独的生物合成形式和生物降解形式存在。苏氨酸脱氨酶的生物合成形式是基因ilvA编码的，其催化植物和微生物中带支链氨基酸生物合成过程的第一个关键步骤。该步骤使L-苏氨酸脱水脱氨，利用吡哆醛5′-磷酸(PryP)产生2-氧丁酸。生物合成形式的苏氨酸脱氨酶受到通过L-异亮氨酸进行的变构调节(Umbarger，Science，123848(1956)；Umbarger，Protein Science，11392(1992)；Changeux，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，26313(1961)；Monod et al.，J.Mol.Biol.，6306(1963))。若干种被去调节的苏氨酸脱氨酶在植物和细菌中都存在。见，Feldberg et al.，Eur.J.Biochem.，21438-446(1971)；Mourad et al.，Plant Phys.，10743-52(1995)；Fisher et al.，J.Bact.，1756605-6613(1993)；Taillonet al.，Gene，63245-252(1988)；Mckel et al.，Mol.Microbiol.，13833-842(1994)；Guillouet et al.，Appl Environ Microbiol.，653100-3107(1999)；Slater et al.，Nature Biotechnology，71011-1016(1999)。
与生物合成形式相反，苏氨酸脱氨酶的生物降解形式会被AMP激活，其对L-异亮氨酸的反馈调控不敏感，其在含有高浓度氨基酸并且不含葡萄糖的培养基中以无氧方式产生。此外，在E.coli中，苏氨酸脱氨酶的生物降解形式由单独的基因(tdcB)编码。
AHAS酶在大量生物中都是保守的，例如，细菌、酵母和植物(Singhet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，884572-4576(1991))。在E.coli和其它肠细菌中，AHAS是由分别被称为ilvG和ilvM的两个大亚基和两个小亚基组成的异源四聚体蛋白质(Weinstock et al.，J.Bacteriol.，1745560-6(1992))。该四聚体的全部酶活性都由大亚基提供。小亚基是酶的稳定性和调控目的所需要的。在植物中，不同物种间的聚集情况是不同的。在一些植物中，例如Arabidopsis thaliana，AHAS酶是由单一结构基因编码的(Andersson et al.，Plant Cell Reports，22261-267(2003))，而在其它植物种中，例如烟草中，可能就有不止一个功能基因。和细菌一样，植物的AHAS酶也是受到反馈抑制的。植物的AHAS酶是一些商业除草剂的目标(U.S.专利6,727,414)。
在对作为一方面的亮氨酸和缬氨酸以及作为另一方面的异亮氨酸的水平进行平衡的方面，AHAS发挥着重要的作用。AHAS对于驱动丙酮酸向乙酰乳酸的转化是很重要的，乙酰乳酸是亮氨酸和缬氨酸的前体。AHAS还驱动2-氧丁酸向乙酰羟基丁酸的转化，后者是异亮氨酸的前体。因为AHAS对于2-氧丁酸的底物优先性高于丙酮酸，故而酶反应优先进行异亮氨酸的生产。异亮氨酸的水平会受到异亮氨酸对TD的反馈抑制的控制，而AHAS受缬氨酸和亮氨酸的反馈抑制。亮氨酸的生产还受异丙基苹果酸合成酶的反馈抑制。
BCAA的商业化生产可以通过直接从蛋白质水解产物中提取氨基酸来进行。例如，异亮氨酸现在的生产水平小于每年400公吨，而对于异亮氨酸的需求却在持续增长。因此，为弥补经过分离的BCAA的短缺，以及提供其更为经济的来源，人们需要对植物进行工程改造，以使氨基酸合成水平提高。

发明内容
本发明包括一种DNA构建体，所述构建体包含多个植物表达盒，其中第一个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码对反馈不敏感的苏氨酸脱氨酶的外源多核苷酸可操作地连接，第二个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码AHAS的外源多核苷酸可操作地连接。在一种实施方式中，本发明的DNA构建体包含多个植物表达盒，其中第一个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码对反馈不敏感的苏氨酸脱氨酶的外源多核苷酸可操作地连接，第二个表达盒包含AHAS的大亚基，第三个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码AHAS小亚基的外源多核苷酸可操作地连接。在一种实施方式中，启动子中的每个都是种子增强型(seedenhanced)启动子。在另一种实施方式中，启动子中的每个都选自以下所构成的组napin、7S alpha、7S alpha’、7S beta、USP 88、增强的USP 88、Arcelin 5和Oleosin。在一种实施方式中，至少有两种不同的种子增强型启动子。
在本发明的一个方面，第一个盒包含编码对反馈不敏感的苏氨酸脱氨酶的多核苷酸，其包含SEQ ID NO22。在一种实施方式中，该多核苷酸是SEQ ID NO22。在本发明的另一个方面，第一个盒包含编码苏氨酸脱氨酶变异等位基因(variant allele)或其亚基的外源多核苷酸，所述变异等位基因或其亚基包含L447F或L481F或L481Y或L481P或L481E或L481T或L481Q或L481I或L481V或L481M或L481K位上的氨基酸取代。在本发明的又一个方面，编码苏氨酸脱氨酶变异等位基因的多核苷酸包含SEQ ID NO2。在本发明的又一个方面，该多核苷酸是SEQ ID NO2。
在本发明的一种实施方式中，第一个盒还包含编码质体转运肽的多核苷酸，其与编码苏氨酸脱氨酶、苏氨酸脱氨酶变异等位基因或其亚基的多核苷酸可操作地连接。
在另一种实施方式中，第二个表达盒包含编码AHAS大亚基的多核苷酸。在一种实施方式中，编码AHAS大亚基的多核苷酸包含SEQ IDNO16。在一种实施方式中，该多核苷酸是SEQ ID NO16。在又一种实施方式中，编码质体转运肽的多核苷酸与编码AHAS大亚基的多核苷酸可操作地连接。在一种实施方式中，第三个表达盒包含编码AHAS小亚基的多核苷酸。在另一种实施方式中，编码AHAS小亚基的多核苷酸包含SEQ ID NO17。在一种实施方式中，该多核苷酸是SEQ ID NO17。在又一种实施方式中，编码质体转运肽的多核苷酸与编码AHAS小亚基的多核苷酸可操作地连接。
在一个方面，DNA构建体包含多个植物表达盒，其中第一个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码对反馈不敏感的苏氨酸脱氨酶的外源多核苷酸可操作地连接，第二个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码AHAS大亚基的外源多核苷酸可操作地连接。在另一个方面，启动子中的每个都是种子增强型启动子。在又一个方面，启动子中的每个都选自以下所构成的组napin、7Salpha、7S alpha’、7S beta、USP 88、增强的USP 88、Arcelin 5和Oleosin。在另一个方面，构建体中至少有两种不同的种子增强型启动子。
在一种实施方式中，第一个盒包含编码对反馈不敏感的苏氨酸脱氨酶的多核苷酸，其包含SEQ ID NO22。在一种实施方式中，该多核苷酸是SEQ ID NO22。在另一种实施方式中，第一个盒包含苏氨酸脱氨酶变异等位基因，其包含L447F或L481F或L481Y或L481P或L481E或L481T或L481Q或L481I或L481V或L481M或L481K位上的氨基酸取代。在另一种实施方式中，编码苏氨酸脱氨酶变异等位基因的多核苷酸包含SEQ ID NO2，其包含L447F或L481F或L481Y或L481P或L481E或L481T或L481Q或L481I或L481V或L481M或L481K位上的氨基酸取代。在一种实施方式中，该多核苷酸是SEQ ID NO22。在本发明的一个方面，第一个盒包含编码质体转运肽的多核苷酸，其与编码苏氨酸脱氨酶的所述多核苷酸可操作地连接。在另一个方面，第二个表达盒包含编码AHAS大亚基的多核苷酸。在又一个方面，编码AHAS大亚基的多核苷酸包含SEQ ID NO16。在一种实施方式中，该多核苷酸是SEQ ID NO16。在再一个方面，编码质体转运肽的多核苷酸与编码所述AHAS大亚基的所述多核苷酸可操作地连接。
在一种实施方式中，DNA构建体包含多个植物表达盒，其中一个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码单体AHAS的外源多核苷酸可操作地连接。在另一种实施方式中，DNA构建体包含多个植物表达盒，其中第一个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码AHAS大亚基的外源多核苷酸可操作地连接，第二个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码AHAS小亚基的外源多核苷酸可操作地连接。在又一种实施方式中，启动子中的每个都是种子增强型启动子。在再一种实施方式中，启动子中的每个都选自如下所构成的组napin、7S alpha、7S alpha’、7S beta、USP 88、增强的USP 88、Arcelin 5和Oleosin。在另一种实施方式中，至少有两种不同的种子增强型启动子。在一种实施方式中，第一个盒包含AHAS的大亚基，其包含SEQ ID NO16。在一种实施方式中，该多核苷酸是SEQ ID NO16。在另一种实施方式中，第一个盒包含编码质体转运肽的多核苷酸，其与编码所述AHAS的大亚基的所述多核苷酸可操作地连接。在另一种实施方式中，第二个盒包含编码AHAS小亚基的多核苷酸。在另一种实施方式中，第二个盒包含编码AHAS小亚基的多核苷酸，其包含SEQ ID NO17。在一种实施方式中，该多核苷酸是SEQ ID NO17。在另一种实施方式中，第二个盒包含编码质体转运肽的多核苷酸，其与编码所述AHAS小亚基的所述多核苷酸可操作地连接。
本发明还提供了一种方法，用于制备种子中氨基酸水平增加的转基因双子叶植物，所述水平增加是相对来自相同植物物种的非转基因植物的种子而言的，所述方法包括下述步骤a)向双子叶植物的可再生(regenerable)细胞引入包含构建体的转基因，所述构建体包含编码对反馈不敏感的苏氨酸脱氨酶的多核苷酸；b)令所述可再生的细胞再生为双子叶植物；c)从所述植物获取种子；d)选出具有增加的氨基酸水平的一粒或多粒种子，所述水平是相对来自相同植物物种的非转基因植物的种子而言的；以及e)种植所述种子，其中，如果异亮氨酸以增加的水平存在，那么至少一种额外的氨基酸水平也被增加了。在一种实施方式中，所述双子叶植物是大豆植物(soybeanplant)。在一种实施方式中，氨基酸的水平增加包含下述氨基酸的浓度增加a)Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种和Ile；或b)Arg、Asn、Asp、His、Met、Leu、Val、Gln、Tyr、Thr、Lys、Ala、Ser和Phe中的一种或多种。本发明包括由本方法制造的转基因大豆植物。
本发明包括制备氨基酸含量增加的转基因双子叶植物的方法，包括如下步骤a)向双子叶植物的可再生细胞引入包含构建体的转基因，所述构建体包含编码单体AHAS的多核苷酸，或者所述构建体包含编码AHAS大亚基的多核苷酸和编码AHAS小亚基的多核苷酸；b)令所述可再生的细胞再生为双子叶植物；c)从所述植物获取种子；d)选出具有增加的氨基酸水平的一粒或多粒种子，所述水平是相对来自相同植物物种的非转基因植物的种子而言的；以及e)种植所述种子。在一种实施方式中，所述双子叶植物是大豆植物或油菜(canola)植物。在一种实施方式中，氨基酸的水平增加包含Ser或Val的浓度增加。在一种实施方式中，本发明包括由本方法制造的转基因大豆植物。
本发明还包括从转基因大豆制造的粗磨粉(meal)。
本发明还涉及含有本发明种子的容器。本发明的植物的种子可被放置于容器中，例如，袋子中。本文中使用的容器是任何可以装纳上述种子的物体。优选地，容器中含有超过大约1,000、大约5,000或者大约25,000粒种子，其中，所述种子中的至少大约10％、大约25％、大约50％、大约75％或者大约100％是本发明的种子。优选地，当本发明的种子是大豆的时候，所述容器优选地是袋子，其中含有大约60磅或大约130,000粒豆子。
本发明还涉及从本发明的转基因植物或植物的部分(例如，种子)来生产的动物或人类的食物产品。此类食物产品可以从，例如，谷粒、谷物粗粉(meal)、面粉、种子、谷物等来制备，包括从此类物质制备的中间产物。


图1是质粒pMON53905的限制性图谱。
图2是质粒pMON25666的限制性图谱。
图3是质粒pMON53910的限制性图谱。
图4是质粒pMON53911的限制性图谱。
图5是质粒pMON53912的限制性图谱。
图6通过提供野生型酶对苏氨酸浓度的初始速度图，展示了Arabidopsis的苏氨酸脱氨酶(菱形符号)和E.coli苏氨酸脱氨酶(圆形符号)的动力学特性。
图7提供了E.coli L481等位基因相对异亮氨酸浓度的酶活百分比图。
图8是质粒pMON69657的限制性图谱。
图9是质粒pMON69659的限制性图谱。
图10是质粒pMON69660的限制性图谱。
图11是质粒pMON69663的限制性图谱。
图12是质粒pMON69664的限制性图谱。
图13是质粒pMON58143的限制性图谱。
图14是质粒pMON58138的限制性图谱。
图15是质粒pMON58159的限制性图谱。
图16是质粒pMON58162的限制性图谱。
对核酸和肽序列的说明SEQ ID NO1展示了野生型E.coli苏氨酸脱氨酶的多核苷酸序列。
SEQ ID NO2展示了野生型E.coli苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO3展示了在447位Phe取代Leu的野生型E.coli苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列(Ilv219)。
SEQ ID NO4展示了在481位Phe取代Leu的野生型E.coli苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列(Ilv466)。
SEQ ID NO5展示了在481位Tyr取代Leu的野生型E.coli苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO6展示了在481位Pro取代Leu的野生型E.coli苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO7展示了在481位Glu取代Leu的野生型E.coli苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO8展示了在481位Thr取代Leu的野生型E.coli苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO9展示了在481位Gln取代Leu的野生型E.coli苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO10展示了在481位Ile取代Leu的野生型E.coli苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO11展示了在481位Val取代Leu的野生型E.coli苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO12展示了在481位Met取代Leu的野生型E.coli苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO13展示了在481位Lys取代Leu的野生型E.coli苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO14展示了在447位Phe取代Leu的L447F E.coli苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO15展示了在481位Phe取代Leu的L481F E.coli苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO16展示了ilvG AHAS大亚基的多核苷酸序列。
SEQ ID NO17展示了ilvM AHAS小亚基的多核苷酸序列。
SEQ ID NO18展示了ilvG 5’-片段的多核苷酸序列。
SEQ ID NO19展示了Arabidopsis SSUlA质体转运肽的多核苷酸序列。
SEQ ID NO20展示了ilvG 3’-片段的多核苷酸序列。
SEQ ID NO21展示了野生型E.coli苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列变异体。
SEQ ID NO22展示了Arabidopsis OMR1苏氨酸脱氨酶的多核苷酸序列。
发明详述本发明提供了一种转基因植物，其基因组具有下述经过分离的核酸，所述核酸编码苏氨酸脱氨酶(TD)或其亚基，包括具有酶功能的突变体和亚基。优选地，此类苏氨酸脱氨酶或苏氨酸脱氨酶亚基对游离L-异亮氨酸或异亮氨酸的氨基酸类似物造成的抑制具有抗性。或者，另一种优选的实施方式中，提供了一种编码苏氨酸脱氨酶或其亚基的核酸，其表达方式使得植物中Ile含量和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种的含量增加，不管天然和外源的苏氨酸脱氨酶或其亚基的动力学或抑制特性的不同或相同之处。例如，用本领域公知的技术，可使外源苏氨酸脱氨酶在不同于天然酶所在之处的细胞区室内优势表达。苏氨酸脱氨酶或其亚基的表达可以将植物中Ile的水平以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种的水平提高至超过不存在此类表达时的水平。所述核酸还可以编码异亮氨酸生物合成涉及到的其它酶，例如，天冬氨酸激酶、双功能天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶或乙酰羟酸合酶。
本发明还涉及一种获得植物的方法，所述植物能生产水平被提高的游离Ile以及水平被提高的Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种。此类过量生产是经过分离的编码苏氨酸脱氨酶的核酸的引入和表达的结果。此外，天然的大豆苏氨酸脱氨酶对L-异亮氨酸的反馈抑制是敏感的，并构成了对生物合成途径的调控位点。本发明提供的方法还可被用于通过将编码对此类反馈抑制具有抗性的苏氨酸脱氨酶的核酸引入，在植物中生产水平被提高的游离Ile以及水平被提高的Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种。此类编码苏氨酸脱氨酶的核酸可被引入到一系列植物中，包括双子叶植物(例如豆类)和单子叶植物(例如谷物)。
定义在本文上下文中，将使用大量的术语。术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”和“经过分离的核酸片段”在本文中都可互换使用。上述术语包括了核苷酸序列等。多核苷酸可以是双链或单链的RNA或DNA聚合体，可选地，其含有合成的、非天然的或经过改变的核苷酸碱基。以DNA聚合体形式出现的多核苷酸可以包含cDNA、基因组DNA、合成DNA或其混合物中的一种或多种片断。
本文中使用的在经过转化的植物、植物组织、植物部分或植物细胞中Ile和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种的“经过改变的”水平是指比在相应的未经过转化的植物、植物组织、植物部分或植物细胞中发现的水平更高或更低。通常，Ile和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种的“经过改变的”水平要高于在相应的未经过转化的植物、植物组织、植物部分或植物细胞中发现的水平。
术语“与……互补”在本文中被用于表示核酸链的序列可以与作为参照的多核苷酸序列的全部或一部分杂交。为解释的目的举个例子，核苷酸序列“TATAC”与参照序列5’-TATAC-3’具有100％的相同性(identity)，但其与参照序列5’-GTATA-3’100％互补。
术语“相应”在本文中用于表示多核苷酸序列，例如核酸至少部分地与作为参照的多核苷酸序列的全部或一部分相同(不必要严格进化相关)。
本文中使用的“被去调节的酶”指已被修饰的酶，例如通过诱变、截短等进行的，使得代谢物对该酶催化活性的反馈抑制程度被降低，从而在代谢物存在的情况下该酶能展示出比未经修饰的酶更高的活性。
本文中与苏氨酸脱氨酶相关的部分所用到的短语“其结构域”包括了全长苏氨酸脱氨酶的结构性或功能性片断。结构性结构域包括苏氨酸脱氨酶内部可被确认的(identifiable)结构。结构性结构域的例子包括alpha螺旋、beta片状结构、活性位点、底物或抑制剂结合位点等。功能性结构域包括展现出可被确认的功能的苏氨酸脱氨酶片断，例如异亮氨酸结合口袋、活性位点或底物或抑制剂结合位点。苏氨酸脱氨酶的功能性结构域包括苏氨酸脱氨酶的能催化异亮氨酸生物合成途径中一个步骤的部分。因此，功能性结构域包括苏氨酸脱氨酶的具有酶活性的片段和结构域。苏氨酸脱氨酶的突变体结构域也被包括进来。用于制造突变体结构域的野生型苏氨酸脱氨酶核酸包括，例如，任何编码来自大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)的苏氨酸脱氨酶结构域的核酸。
本文中使用的“外源”苏氨酸脱氨酶是由已经被引入到宿主细胞中的经过分离的核酸编码的苏氨酸脱氨酶。此类“外源”苏氨酸脱氨酶通常与天然的、未经转化状态的该细胞中存在的任何DNA序列都不相同。“内源”或“天然”苏氨酸脱氨酶是天然存在于宿主细胞或生物中的苏氨酸脱氨酶。
在本文中，植物细胞、植物组织、植物部分或植物中游离Ile和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种的“增加的”或“被提高的”水平是未经转化的植物细胞、植物组织、植物部分或植物(即，其基因组未被外源苏氨酸脱氨酶核酸或其结构域的存在而改造)中发现的水平的大约2至100倍的水平，优选为大约5至50倍，更优选为大约10-30倍。例如，用经过转化的植物种子中游离Ile和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种的水平与未经转化的亲本植物种子或与嵌合(chimeric)植物未经转化的种子中它们的水平相比。在植物中发现并在本发明中有所描述的若干种氨基酸的名称、三字母和单字母缩写以及对其进行编码的DNA密码子都列于表1中。
表1.在植物中发现的若干种氨基酸的名称、三字母和单字母缩写以及对其进行编码的DNA密码子

编码苏氨酸脱氨酶的核酸以及编码转运肽(transit peptide)或标记/报道基因的核酸是“经过分离的”，因为它们来自其天然来源，已不再处于它们通常存在的细胞中。此类经过分离的核酸可以经过了至少部分在体外的制备或操作，例如，从它们通常被发现的细胞中将其分离出来，对其进行纯化和扩增。当与外源核酸组合起来的情况下，此类经过分离的核酸还可以是“重组的”。例如，重组DNA可以是与外源启动子或对于选用的宿主细胞来说是内源的启动子可操作地连接的经过分离的DNA。
本文中使用的“天然(native)”基因或核酸表示该基因或核酸没有经过体外的改变或操作，即，其是没有经过过体外分离、纯化、扩增或突变的“野生型”基因或核酸。
术语“质体”指一类植物细胞的细胞器，其包括造粉体、叶绿体、有色体、造油体、eoplast、白色质体(etioplast)、白色体和前质体。上述细胞器是自主复制的，并含有通常被称为“质体基因组”的环状DNA分子，其大小在大约120至大约217kb的范围内，具体取决于植物的种类，并且，其通常含有反向重复区域。
本文中使用的“多肽”指全部通过肽键连接到一起的氨基酸的连续的链，只除了分别具有氨基和羧基的N-末端和C-末端氨基酸之外，它们并不以肽键相连。多肽可以是任何长度的，并可被转录后修饰，例如，通过糖基化或磷酸化进行的修饰。
本文中使用的“对异亮氨酸的氨基酸类似物的抑制具有抗性或耐受性的”植物细胞、植物组织或植物是下述植物细胞、植物组织或植物其中，L-异亮氨酸或L-异亮氨酸的类似物存在的情况下，保留的苏氨酸脱氨酶活性比相应的野生型苏氨酸脱氨酶要多至少大约10％。通常，“对异亮氨酸的抑制具有抗性或耐受性的”植物细胞、植物组织或植物可在存在一定量异亮氨酸氨基酸类似物的环境下生长，所述异亮氨酸的氨基酸类似物的量通常会抑制未经转化的植物细胞、植物组织或植物的生长，这是通过本领域已知的方法测定的。例如，用编码对异亮氨酸的氨基酸类似物具有充分的抗性或耐受性的苏氨酸脱氨酶的DNA分子去转化纯合回交转化过的近交植物，得到的植物能在会对相应的(即高度同基因的)再生的近交植物生长造成抑制的量的异亮氨酸氨基酸类似物的环境下生长。
本文中使用的“对异亮氨酸或异亮氨酸的氨基酸类似物的抑制具有抗性或耐受性的”苏氨酸脱氨酶是下述苏氨酸脱氨酶当所述具有耐受性/抗性的苏氨酸脱氨酶和野生型苏氨酸脱氨酶暴露给同等量的异亮氨酸或异亮氨酸的氨基酸类似物时，所述具有耐受性/抗性的苏氨酸脱氨酶保留的活性要比相应的“野生型”或天然的敏感型苏氨酸脱氨酶多大约10％以上。优选地，所述具有抗性或耐受性的苏氨酸脱氨酶保留的活性比比相应的“野生型”或天然的敏感型苏氨酸脱氨酶多大约20％以上。
一般性概念预先选出来的苏氨酸脱氨酶核酸必须首先经过分离，并且，如果不是植物来源的话，在体外被修饰，以包括进在植物细胞中进行基因表达所需要的调控信号。该外源基因可被修饰，以加入编码质体转运肽序列的序列，以将基因产物引导到上述细胞器中。
为改变Ile和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种的生物合成，编码具有抗性的苏氨酸脱氨酶的核酸(“基因”)必须被直接或间接引入到植物细胞中，并对上述经过转化的细胞进行鉴定。该基因可被稳定地包括进植物细胞的基因组中。基因的转录信号应能被植物细胞识别，并可在植物细胞中具有功能。这意味着，该基因必须被转录为信使RNA，mRNA在植物细胞核中必须是稳定的，可被完整地转运到细胞质中进行翻译。该基因可以具有合适的翻译信号以被植物细胞核糖体识别并对其进行正确的翻译。多肽基因产物必须避开细胞质内显著的蛋白水解攻击，并能具有赋予酶活性的三维构象。苏氨酸脱氨酶还可以进一步地作用于异亮氨酸及其衍生物的生物合成过程中；这意味着，其可定位于催化生物合成(假设在质体中)侧翼步骤的天然植物酶附近，以获得需要的底物，以及传递适当的产物。
即使上述所有条件都能达到，对Ile和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种成功地过量生产也并非可以预见的事情。这需要没有能对苏氨酸脱氨酶步骤调控的减少进行补偿的其它控制机制存在。这意味着不仅不存在其它对生物合成的抑制，也不存在能使积累的氨基酸被破坏的速率增加的机制。Ile和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种必须以不会对植物产生毒性的水平被过量生产。最后，被引入的特性应当是稳定的、可遗传的，以允许进行商业发展和应用。
对编码苏氨酸脱氨酶的多核酸分子的分离和鉴定可通过标准方法对编码苏氨酸脱氨酶的核酸进行鉴定和分离，如Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor，NY(2001)所述。编码苏氨酸脱氨酶的核酸可来自任何原核或真核物种。例如，可通过对来自任何物种的基因组DNA文库进行筛选，或通过对由来自特定细胞类型、细胞系、原代细胞(primarycell)或组织的核酸制得的cDNA文库进行筛选，来鉴定出编码苏氨酸脱氨酶或其亚基的核酸。可用于鉴定和分离苏氨酸脱氨酶的文库的例子包括但不限于，来自A.tumefaciens菌株A348、玉米近交系B73的cDNA文库(Stratagene，La Jolla，California，Cat.#937005，Clontech，Palo Alto，California，Cat.#FL1032a，#FL1032b和FL1032n)，来自玉米近交系Mo17的基因组文库(Stratagene，Cat.#946102)，来自玉米近交系B73的基因组文库(Clontech，Cat.#FL1032d)，或来自Escherichia coli或Salmonella typhimurium的便利菌株的基因组文库。
可用于实施本发明的苏氨酸脱氨酶多核苷酸或多肽分子的例子被描述于表2中。E.coli野生型苏氨酸脱氨酶基因(ilvA)(SEQ ID NO1；gi146450，号码K03503，版本K03503.1)及其相应的多肽序列(SEQ ID NO2)或编码SEQ ID NO21的变异等位基因是获得下表2所述的所有其它突变等位基因的基础基因。
具有与上述苏氨酸脱氨酶核酸分子相关的序列的核酸可通过标准方法获得，包括克隆或聚合酶链式反应(PCR)，所述PCR中使用与本文提供的苏氨酸脱氨酶序列区域互补的寡核苷酸引物。经过分离的苏氨酸脱氨酶核酸的序列可通过杂交、部分序列分析或通过在合适的宿主细胞中表达来验证。
表2.突变等位基因中E.coli ilv苏氨酸脱氨酶的氨基酸取代情况

对编码苏氨酸脱氨酶序列的全部或部分的DNA片段的筛选可以通过PCR来进行，或者通过杂交手段对来自基因组或cDNA文库的噬菌斑进行筛选来进行。探针可来自从本文提供的核酸获得的苏氨酸脱氨酶基因，或者来自其它生物。或者，可针对其与能与苏氨酸脱氨酶特异性结合的抗体的结合，对来自cDNA表达文库的噬菌斑进行筛选。能与来自其它生物的苏氨酸脱氨酶探针杂交的DNA片段和/或携带与苏氨酸脱氨酶抗体具有免疫反应的DNA片段的噬菌斑，可被亚克隆进载体并被测序，和/或用作探针，对编码目标苏氨酸脱氨酶基因的全部或部分的其它cDNA或基因组序列进行鉴定。
cDNA文库可通过下述方法来制备分离mRNA，产生cDNA，将cDNA插入到合适的载体中。可用对苏氨酸脱氨酶具有特异性的抗体或探针对含有cDNA片段的文库进行筛选。编码苏氨酸脱氨酶基因的一部分的DNA片段可被亚克隆，并被测序，以及用作为探针，以对基因组苏氨酸脱氨酶核酸进行鉴定。通过测定与其它已知苏氨酸脱氨酶基因的同源性，或通过与苏氨酸脱氨酶特异性信使RNA杂交，可对编码原核或真核苏氨酸脱氨酶的一部分的DNA片段进行验证。一旦获得了编码苏氨酸脱氨酶5’末端部分、中间部分和3’末端部分的cDNA片段，就可将它们用作为探针，以从基因组文库鉴定和克隆出苏氨酸脱氨酶基因的完整基因组拷贝。
可通过聚合酶链式反应或通过对基因组文库进行筛选，分离出苏氨酸脱氨酶基因的单个或多个基因组拷贝的部分。阳性克隆可被测序，可通过标准方法对基因的5’末端进行鉴定，所述标准方法包括对其它苏氨酸脱氨酶基因的核酸同源性或通过RNAase保护分析来进行，如Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989和2001)所述。对目标基因的3’和5’末端的定位还可用已知的苏氨酸脱氨酶编码区域，通过对基因组序列数据库进行计算机检索来进行。一旦鉴定出了基因的部分，就可用标准方法获得苏氨酸脱氨酶基因的完整拷贝，所述标准方法包括克隆或聚合酶链式反应(PCR)合成，其中使用与该基因的5’或3’末端核酸互补的寡核苷酸引物。可以通过杂交、部分序列分析或通过苏氨酸脱氨酶表达，来验证苏氨酸脱氨酶基因的经过分离的全长拷贝的存在。
下述突变体是想要的，所述突变体苏氨酸脱氨酶活性增加，对异亮氨酸或其类似物导致的反馈抑制的敏感性降低，和/或能够在植物中生产出数量增加的Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种以及Ile。上述突变体可以具有其所展示的活性的类型或水平上的功能性变化，一些时候被称为野生型苏氨酸脱氨酶核酸和多肽的“衍生物”。
然而，本发明还涉及带有“沉默”突变的苏氨酸脱氨酶核酸以及苏氨酸脱氨酶变异体。本文中使用的沉默突变是指改变了苏氨酸脱氨酶的核苷酸序列但不会导致所编码的苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列有所改变的突变。变异体苏氨酸脱氨酶是由突变核酸编码的，所述变异体较之相应的野生型苏氨酸脱氨酶，具有一种或多种不会对苏氨酸脱氨酶活性造成显著改变的氨基酸改变。本发明涉及所有此类衍生物、变异体和带有沉默突变的苏氨酸脱氨酶核酸。
可以通过多种方法来获得编码经过突变的苏氨酸脱氨酶的DNA，所述苏氨酸脱氨酶对L-异亮氨酸或异亮氨酸的氨基酸类似物具有抗性和/或耐受性。所述方法包括但不限于1.自发变异以及在培养物中进行直接的突变体筛选；
2.对植物或组织、种子或任何细胞类型的组织培养物进行直接或间接诱变的方法；3.对克隆得到的苏氨酸脱氨酶基因进行突变，其中使用的方法例如，化学诱变；位点特异性或定点诱变(Sambrook et al.，如前所述)；转座子介导的诱变(Berg et al.，Biotechnology，1417(1983))以及缺失突变(Mitra et al.，Molec.Gen.Genetic.，215294(1989))。
4.对关键残基的突变进行合理设计；以及5.DNA改组(DNA shuffling)，以将感兴趣的突变包含进若干种苏氨酸脱氨酶核酸。
例如，来自可获得的苏氨酸脱氨酶蛋白质的遗传和/或蛋白质结构信息可被用于对苏氨酸脱氨酶突变体进行合理的设计，所述突变体具有增加的活性或者减少的对异亮氨酸或异亮氨酸类似物的敏感性的可能性很高。此类蛋白质结构信息是可获得的，例如，对E.coli苏氨酸脱氨酶的(Gallagher et al.，Structure，6465-475(1998))。对突变的合理设计可通过将选出的苏氨酸脱氨酶氨基酸序列与来自已知结构的(例如，E.coli)苏氨酸脱氨酶的苏氨酸脱氨酶氨基酸序列进行比对来进行。结合对结构信息和序列同源性的了解，可对苏氨酸脱氨酶蛋白质的异亮氨酸结合和催化区域进行预测。例如，异亮氨酸结合口袋中的残基可被确定为下述突变的可能候选者，所述突变是用于改变酶对异亮氨酸反馈抑制抗性的。使用此类结构信息，可在异亮氨酸结合所涉及到的位点或结构域中，合理设计出若干种E.coli苏氨酸脱氨酶突变体。更具体地，对于用于制造对异亮氨酸反馈抑制具有更少敏感性的活性苏氨酸脱氨酶的突变而言，与E.coli苏氨酸脱氨酶中L481类似的氨基酸可能是有用的残基。本发明涉及在任何上述位置的任何氨基酸取代或插入。或者，上述任何位置的氨基酸可被缺失以及被取代。
定点诱变可被用于制造一系列位点上的氨基酸取代、缺失以及插入。在Escherichia coli苏氨酸脱氨酶编码区域中制造的特定突变的例子包括如下突变在447位附近用Phe替换Leu(见，例如SEQ ID NO3)；在481位附近用Phe替换Leu(见，例如SEQ ID NO4)；在481位附近用Tyr替换Leu(见，例如SEQ ID NO5)；
在481位附近用Pro替换Leu(见，例如SEQ ID NO6)；在481位附近用Glu替换Leu(见，例如SEQ ID NO7)；在481位附近用Thr替换Leu(见，例如SEQ ID NO8)；在481位附近用Gln替换Leu(见，例如SEQ ID NO9)；在481位附近用Ile替换Leu(见，例如SEQ ID NO10)；在481位附近用Val替换Leu(见，例如SEQ ID NO11)；在481位附近用Met替换Leu(见，例如SEQ ID NO12)；或在481位附近用Lys替换Leu(见，例如SEQ ID NO13)；通过对将被突变的苏氨酸脱氨酶的氨基酸序列与E.coli苏氨酸脱氨酶氨基酸序列进行比对，可在任何苏氨酸脱氨酶的类似位置进行相似的突变。可用于进行比对的E.coli苏氨酸脱氨酶氨基酸序列的例子是SEQ ID NO1。
还可以通过经典的诱变和遗传选择来鉴定出有用的突变体。可通过将酶暴露给游离L-异亮氨酸或异亮氨酸的氨基酸类似物，对基因编码的酶的活性进行探测，或者通过使用限制性酶图谱或DNA序列分析对DNA分子的变化进行探测，来探测功能性改变。
例如，可从对异亮氨酸类似物耐受的细胞系中分离出编码对异亮氨酸充分耐受的苏氨酸脱氨酶的基因。简言之，在连续暴露给低水平异亮氨酸类似物的情况下，对部分分化的植物细胞培养物进行生长和传代培养。然后在若干传代培养间隔上逐渐增加异亮氨酸类似物的浓度。存在类似物的情况下，对在存在通常为毒性的水平的类似物的情况下生长的细胞或组织进行重复传代培养，并对其特征进行分析。通过如下方法来分析被培养的细胞的耐受特性的稳定性在不存在类似物的情况下，对选出的细胞系进行不同时间段的培养，然后分析将组织暴露给类似物后的生长情况。通过对在存在通常为毒性的(即，生长抑制剂)水平的异亮氨酸类似物的情况下具有酶活性的细胞系进行鉴定，选出依靠具有改变的苏氨酸脱氨酶这一优点从而具有耐受性的细胞系。
可用标准方法，例如U.S.专利4581847中所述(通过引用将该文献包括进本文)，对从对异亮氨酸类似物具有抗性的细胞系中克隆得到的苏氨酸脱氨酶基因，进行关于对同样的或其它的氨基酸类似物的耐受性的检测。
具有对异亮氨酸类似物敏感性降低的苏氨酸脱氨酶的细胞系可被用于分离具有反馈抗性的苏氨酸脱氨酶。可以制造出来自对异亮氨酸类似物具有耐受性的细胞系的DNA文库，通过与编码苏氨酸脱氨酶基因一部分的cDNA探针进行杂交，可以鉴定出编码苏氨酸脱氨酶基因一部分或全部的DNA片段。通过克隆方法，或通过使用合适的引物进行的PCR合成，可以获得被改变的基因的完整拷贝。对编码苏氨酸脱氨酶的被改变的基因的分离可在经过转化的植物细胞中被验证，这是通过如下方法进行的测定正在表达的苏氨酸脱氨酶在被暴露给通常为毒性的水平的异亮氨酸类似物时是否保留有酶活性。例如，见，Anderson et al.，U.S.专利6,118,047。
为在选定的生物，例如选定的植物或其它类型的宿主细胞中表达，本文提供的任何DNA分子的编码区域可被最优化。
在Gruys et al.的U.S专利5,492,660和5,958,745、Asrar et al.，U.S.专利6,091,002和6,228,623以及Slater et al.，Nature Biotechnology，171011(1999)中，也有对制造异亮氨酸去调节的苏氨酸脱氨酶变异体的描述。
转基因(transgene)和载体一旦获得及扩增出编码(例如)苏氨酸脱氨酶或其结构域的核酸，可将其可操作地连接到启动子上，以及，任选地，与其它元件相连，以形成转基因。
大多数基因具有已知是启动子并会对基因表达进行调控的区域。典型地，在原核细胞和真核细胞中，启动子区域被发现于编码序列的上游。启动子序列提供了对下游基因序列转录的调控，并且，典型地，包括从大约50个至大约2000个核苷酸碱基对。启动子序列还含有调控序列，例如增强子序列，其可影响基因表达的水平。一些经过分离的启动子序列可提供异源基因(即，与天然或同源基因不同的基因)的基因表达。还已知，启动子序列可以是强的或弱的或诱导型的。强启动子能提供高水平的基因表达，而弱启动子仅提供非常低水平的基因表达。诱导型启动子是下述类型的启动子其应答于外源加入的试剂或应答于环境或发育刺激，允许开启或关闭基因表达。启动子还可提供组织特异性或发育调控。能提供足够水平的基因表达，并能使得经过转化的细胞易于被检测到和被选择的强启动子可能是有好处的。此外，如果需要的话，此类强启动子可以提供高水平的基因表达。
在本发明的转基因中的启动子可提供对目标基因的表达，例如，由编码苏氨酸脱氨酶的核酸表达苏氨酸脱氨酶。优选地，编码序列被表达，使得植物细胞对游离L-异亮氨酸的反馈抑制的耐受性增加，从而使得细胞中Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种以及Ile的总含量增加。启动子还可以是诱导型的，从而可以通过外源加入的试剂来开启或关闭基因表达。将编码区域与能在植物中提供组织特异性表达或发育调控基因表达的启动子组合起来，也有可能是令人期望的。
可用于本发明的启动子包括但不限于病毒、质体、细菌、细菌噬菌体或植物的启动子。有用的启动子包括CaMV 35S启动子(Odellet al.，Nature，313810(1985))，CaMV 19S(Lawton et al.，Plant Mol.Biol.，931F(1987))，nos(Ebert et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.(U.S.A.)，845745(1987))，Adh(Walker et al.，Proc.Nat.Acad.Sci(U.S.A.)，846624(1987))，蔗糖合酶(Yang et al.，Proc.Nat.Acad.Sci(U.S.A.)，874144(1990))、α-微管蛋白、napin、肌动蛋白(Wang et al.，Mol.Cell.Biol.，123399(1992))、cab(Sullivan et al.，Mol.Gen.Genet.，215431(1989))PEPCase启动子(Hudspeth et al.，Plant Mol Biol.，12579(1989))，7Sα’球聚蛋白(conglycinin)启动子(Beachy et al.，EMBOJ.，43047(1985))，或者与R基因复合体相关的那些(Chandler et al.，The Plant Cell，11175(1989))。优选的启动子包括种子增强型启动子，例如大豆的7sα’、7sα、lea9、Arabidopsis perl和Brassica napusnapin。已考虑到，在本发明的实施中有用的其它启动子也是本领域技术人员可获得的。
还可以使用质体启动子。大多数质体基因含有用于多亚基的质体编码的RNA聚合酶(PEP)以及单亚基的核编码的RNA聚合酶的启动子。核编码的聚合酶(NEP)启动子的共有序列和用于若干种天然质体基因的特定启动子序列的列表可在Hajdukiewicz et al.，EMBO J.，164041-4048(1997)中找到，该文献通过引用被全部包括进本文。
可使用的质体启动子的例子包括Zea mays质体RRN(ZMRRN)启动子。当存在有Arabidopsis thaliana质体RNA聚合酶时，ZMRRN启动子可以驱动基因的表达。类似的可用于本发明的启动子是Glycinemax质体RRN(SOYRRN)和Nicotiana tabacum质体RRN(NTRRN)启动子。上述全部三种启动子可被Arabidopsis质体RNA聚合酶识别。RRN启动子的一般特征在U.S.专利6218145中有所描述。
此外，转录增强子或增强子的重复可被用于增加来自特定启动子的表达。此类增强子的例子包括但不限于，来自CaMV 35S启动子和章鱼碱合酶基因的元件(Last et al.，U.S.专利5290924)。例如，已想到，可对根据本发明来使用的载体进行构建，以包括进ocs增强子元件。该元件最初是作为来自Agrobacterium的章鱼碱合酶(ocs)基因的16bp的回文(palindromic)增强子被鉴定出来的(Ellis et al.，EMBOJ.，63203(1987))，其存在于至少10种其它的启动子中(Bouchez etal.，EMBO J.，84197(1989))。已提出，当用于单子叶植物转化时，使用增强子元件，例如ocs元件，特别是该元件的多个拷贝，能提高来自邻近启动子的转录水平。包括但不限于根细胞启动子的组织特异性启动子(Conkling et al.，Plant Physiol.，931203(1990))和组织特异性增强子(Fromm et al.，The Plant Cell，1977(1989))，也被认为是特别有用的，诱导型启动子，例如ABA-和膨胀-诱导型启动子等也是如此。
鉴于转录起始位点和编码序列起点之间的DNA序列(即未被翻译的引导序列)会影响基因表达，人们也可能希望使用特定的引导序列。优选的引导序列被认为会包括以下这些包括预计能引导所附基因的最佳表达的序列的那些，即包括可以增加或保持mRNA稳定性并能防止翻译被不恰当起始的优选的共有(consensus)引导序列(Joshi，Nucl.Acid Res.，156643(1987))。本领域技术人员可以很容易地进行对此类序列的选择。从在双子叶植物特别是大豆中高度表达的基因获得的序列是优选的。
编码目标基因(即苏氨酸脱氨酶)的核酸，还可包括质体转运肽，以协助将苏氨酸脱氨酶多肽转运到质体中，例如，叶绿体中。编码选定的质体转运肽的核酸通常与苏氨酸脱氨酶的编码序列以框内方式(in-frame)连接。但是，质体转运肽可置于苏氨酸脱氨酶的N-末端或C-末端。
构建体还将包括目标核酸和位于3’末端的核酸，后者发挥信号作用，终止转录，并允许得到的mRNA发生聚腺苷化。3’元件的例子包括来自Agrobacterium tumefaciens章鱼碱合酶基因的那些(Bevan etal.，Nucl.Acid Res.，11369(1983))、来自Agrobacterium tumefaciens章鱼碱合酶基因的T7转录体的终止子以及来自马铃薯或西红柿的蛋白酶抑制子I或抑制子II基因的3’端，虽然本领域技术人员已知的其它3’元件也是可以考虑的。如果需要的话，还可以包括调控元件，例如Adh内含子1(Callis et al.，Genes Develop.，11183(1987))、蔗糖合酶内含子(Vasil et al.，Plant Physiol，915175(1989))或TMV omega元件(Galli et al.，The Plant Cell，1301(1989))。可以按照An，Methodsin Enzymology，153292(1987)所述，来获得这些3’非翻译调控序列，或者，上述序列已存在于可从商业来源获得的质粒中，例如从Clontech，Palo Alto，California获得。可通过标准方法，将3’非翻译调控序列与苏氨酸脱氨酶基因的3’-末端可操作地连接。可用于本发明实施的其它此类调控元件对于本领域技术人员来说是可获得可使用的。
选择性标志基因或报道基因也可用于本发明。此类基因向表达该标志基因的细胞赋予独特的表型，因此使得此类被转化的细胞能与不含有该标志的细胞区分开来。选择性标志基因赋予了这样一种特性人们可以通过化学方法，即通过使用选择性试剂(例如，除草剂、抗生素等)来进行“选择”。报道基因或可筛选的基因则赋予一种特性，使得人们可以通过试验或观察，即通过“筛选”来进行鉴定(例如R-基因座特性)。当然，合适的标志基因的很多例子都是本领域已知的，并可被用于本发明的实施。
可能用于本发明的选择性标志包括但不限于，neo基因(Potrykus etal.，Mol.Gen.Genet.，199183(1985))，其编码新霉素抗性，可使用新霉素、卡纳霉素、G418等来进行选择；bar基因，其编码双丙胺膦(bialaphos)抗性；编码经过改变的EPSP合酶蛋白质(Hinchee et al.，Biotech.，6915(1988))的基因，从而能带来草甘膦抗性；腈水解酶基因，例如来自Klebsiella ozaenae的bxn，其能带来对溴苯腈的抗性(Stalker et al.，Science，242419(1988))；突变体乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其能带来对咪唑啉酮、磺酰脲类或其它ALS抑制性化学物质的抗性(EP 0154204)；甲氨喋呤抗性DHFR基因(Thillet et al.，J.Biol.Chem.，26312500(1988))；茅草枯脱卤酶基因，其能带来对杀虫剂茅草枯的抗性；或经过突变的苏氨酸脱氨酶基因，其能带来对5-甲基异亮氨酸的抗性。当使用突变体EPSP合酶基因时，合适的质体转运肽或叶绿体转运肽(CTP)应与EPSPS编码区域融合。
在一种实施方式中，选择性标志对通常被称为草甘膦的N-膦酰甲基-甘氨酸具有抗性。草甘膦能抑制可导致对芳香族化合物(包括氨基酸和维生素)进行生物合成的莽草酸途径。具体而言，草甘膦通过抑制5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(EPSP合酶或EPSPS)，抑制磷酸烯醇式丙酮酸和3-磷酸莽草酸向5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸的转化。已经显示，可通过将生产更高水平的EPSP合酶(该酶优选是耐草甘膦的)的能力引入到植物基因组中，来生产耐草甘膦的植物(Shah et al.，Science，233478-481(1986))。已分离出了对草甘膦具有耐受性的野生型EPSPS酶的变异体，所述耐受性是EPSPS氨基酸编码序列被改变的结果。见Kishore et al.，Ann.Rev.Biochem.，57627-663(1988)；Schulz et al.，Arch.Microbiol.，137121-123(1984)；Sost et al.，FEBS Lett.，173238-241(1984)；Kishore et al.，Fed.Proc.，451506(1986)。
将编码耐草甘膦EPSP合酶或草甘膦降解酶的核酸引入到植物中可使植物对草甘膦具有耐受性。制造耐草甘膦植物的方法是可获得的，例如，在U.S.专利5776760和5627061以及WO 92/00377中，这几篇文献的内容通过引用被包括进本文中。
能用于对转化子进行选择的系统中的选择性标志基因的另一种阐述性的实施方式是编码草铵膦乙酰转移酶的基因，例如来自Streptomyces hygroscopicus的bar基因或来自Streptomycesviridochromogenes的pat基因(U.S.专利5550318)。草铵膦乙酰转移酶(PAT)能使除草剂双丙胺膦、草铵膦(phosphinothricin，PPT)中的活性成分失活。PPT抑制谷氨酰胺合成酶(Murakami et al.，Mol.Gen.Genet.，20542(1986)；Twell et al.，Plant Physiol.，911270(1989))，导致氨的迅速积累，和细胞死亡。
可使用的可筛选标志包括但不限于，β-葡萄糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，该基因编码的酶已知有多种不同的显色底物；R-座基因，其编码对植物组织中花青素色素(红色)的产生进行调节的产物(Dellaporta et al.，in Chromosome Structure and Function，pp.263-282(1988))；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe，Proc.Nat.Acad.Sci.(U.S.A.)，753737(1978))，其编码已知有多种不同显色底物的酶(例如，PADAC，显色头孢霉素)；xylE基因(Zukowsky et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.(U.S.A.)，801101(1983))，其编码儿茶酚脱氧酶，该酶可以转化显色儿茶酚；α-淀粉酶基因(Ikuta et al.，Biotech.，8241(1990))；酪氨酸酶基因(Katz et al.，J.Gen.Microbiol.，1292703(1983))，其编码能将酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌的酶，其接着再缩合，形成容易探测到的化合物黑色素；β-半乳糖苷酶基因，其编码存在显色底物的酶；荧光素酶(lux)基因(Ow et al.，Science，234856(1986))，其使得生物发光探测得以进行；或者甚至是水母发光蛋白基因(Prasher et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1261259(1985))，其可被用于对钙敏感的生物发光检测，或者是绿色荧光蛋白基因(Niedz et al.，Plant Cell Reports，14403(1995))。使用，例如，X-射线胶片、闪烁计数、荧光光谱分析、低照度摄像机、光子计数摄影机或者多孔发光检测，可探测经转化的细胞中lux基因的存在。还可以预见到，可对该系统进行发展，将其用于生物发光的种群筛选(population screening)，例如在组织培养板上，或者甚至用于整个植物的筛选。
此外，转基因还可被构建和被用于将基因产物靶向到植物细胞内的细胞内间隔，或者引导蛋白质到细胞外环境。这通常可以通过将编码转运或信号肽序列的核酸与特定基因的编码序列接合来得到。得到的转运或信号肽会将蛋白质分别转运到特定的细胞内或细胞外目的地。在很多情况下，在协助蛋白质被转运入细胞区室后，要去除转运或信号肽。转运或信号肽是通过协助蛋白质通过细胞内的膜来发挥作用的，例如，液泡、泡囊、质体和线粒体膜，而信号肽引导蛋白质通过细胞外的膜。通过协助蛋白质转运到细胞内或外的区室中，上述序列可以增加基因的积累。
此类用途的一个特定的例子涉及，将感兴趣的基因，例如苏氨酸脱氨酶引导到特定的细胞器中，例如质体而非细胞质。这可以通过对Arabidopsis SSU1A转运肽的使用来进行例示，其使得蛋白质能特异性地靶向到质体。或者，转基因可以包含编码质体转运肽的核酸，或者编码rbcS(RuBISCO)转运肽的核酸，其可操作地连接于启动子和编码苏氨酸脱氨酶的核酸之间(参见，Heijne et al.，Eur.J.Biochem.，180535(1989)；Keegstra et al.，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，40471(1989))。如果转基因要被引入到植物细胞中，该转基因还可以含有植物的转录终止和聚腺苷酸化信号，以及翻译信号，所述信号与植物苏氨酸脱氨酶基因的3’-末端连接在一起。
外源质体转运肽可以使用，其并非被编码于天然植物苏氨酸脱氨酶基因内的。典型地，质体转运肽为40至70个氨基酸长，在翻译后发挥作用，引导蛋白质进入质体。可在进入质体以产生成熟蛋白质的期间或紧接着进入质体之后，将转运肽切下来。编码植物苏氨酸脱氨酶的基因的完整拷贝可以含有质体转运肽序列。在这种情况下，就不必须将外源获得的质体转运肽序列组合到转基因中了。
外源质体转运肽的编码序列可从多种不同的植物核基因中获得，只要基因产物作为包含氨基末端转运肽的前蛋白质表达，并被转运到选定的质体中去。已知包括此类转运肽序列的植物基因产物的例子包括但不限于，核糖体二磷酸羧化酶的小亚基、铁氧还蛋白、叶绿素a/b结合蛋白、核基因编码的叶绿体核糖体蛋白、某些热休克蛋白、氨基酸生物合成酶(例如，乙酰乳酸合酶、3-烯醇式丙酮酸磷酸莽草酸合酶、二氢二吡啶合酶(dihydrodipicolinate)等)。或者，可以从转运肽的已知序列，例如，上文所列出的那些，整个或部分地对编码转运肽的DNA片段进行化学合成。
不考虑编码转运肽的DNA片段的来源，其应当包括翻译起始密码子，并能表达为可被宿主植物的质体识别并能在其中正确发挥作用的氨基酸序列。还应当注意到转运肽和苏氨酸脱氨酶之间连接处的氨基酸序列，在此进行切割，以产生成熟的酶。某些保守的氨基酸序列已被鉴定出来，可用作为指导。编码转运肽的序列与苏氨酸脱氨酶编码区域的精确融合可能要求对其中一条或全部两条核酸进行操作，以引入例如方便的限制性位点。这可以通过下述方法来完成，所述方法包括定点诱变、插入化学合成的寡核苷酸接头等。
一旦获得了质体转运肽序列，可通过标准方法，将其适当地连接到转基因中的启动子和苏氨酸脱氨酶编码区域上。可构建出或从商业来源获得含有在植物细胞中有功能的启动子并具有下游多克隆位点的质粒。用限制性酶，可将质体转运肽序列插入到启动子的下游。然后，可将编码苏氨酸脱氨酶的区域插入到质体转运肽序列3’-末端的紧邻下游，并在其读码框内，使得质体转运肽可以翻译的方式被融合到苏氨酸脱氨酶的氨基末端。转基因一旦形成，就可将其亚克隆到其它质粒或载体中。
已考虑到，将基因产物靶向到植物细胞内的细胞内区室还可通过将基因直接运送到细胞内区室来获得。例如，P.Maliga(CurrentOpinion in Plant Biology，5164-172(2002)；Heifetz(Biochimie，82655-666(2000))；Bock(J.Mol.Biol.，312425-438(2001))；andDaniell et al.，(Trends in Plant Science，784-91(2002))描述了植物的质体转化。
含有苏氨酸脱氨酶基因和/或其它感兴趣的基因的转基因构建完成后，然后可将该盒引入到植物细胞中。将编码苏氨酸脱氨酶的DNA引入到植物细胞中，可以赋予其对异亮氨酸或异亮氨酸的氨基酸类似物的耐受性，并且改变植物细胞中的异亮氨酸含量，这取决于植物细胞的种类、基因表达的水平以及该基因编码的酶的活性。
表3中描述了被包括到本发明中的若干种构建体。
表3.包括在本发明中的构建体


使用核酸的组合本发明的一种实施方式涉及编码苏氨酸脱氨酶的核酸与编码AHAS(乙酰羟酸合酶)的E.Coli的ilvG和/或ilvM基因的组合。此类乙酰羟酸合酶基因不受氨基酸反馈抑制，并且对作为底物的2-酮丁酸具有优先性。在一种实施方式中，该活性被限制到单条融合多肽上。另一种实施方式涉及，对氨基酸不敏感的天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶(AK-HSDH)与苏氨酸脱氨酶以及可能的与AHASII的组合。在一种实施方式中，来自S.marcescens的thrA1基因的突变体(Omori andKomatubara，J.Bact.，175959(1993))是AK-HSDH等位基因。上述核酸可以翻译方式融合到质体转运肽上。
AHAS酶已知存在于所有高等植物中，并且被发现于多种不同的微生物中，例如酵母Saccharomyces cerevisiae，以及肠细菌E.coli和Salmonella typhimurium(U.S.专利5731180)中。用于在大量上述物种中生产普通AHAS的遗传基础也已得到了很好的分析。例如，在E.coli和Salmonella typhimurium中，存在有AHAS的三种同工酶；其中两种对除草剂敏感，而第三种不敏感。上述同工酶均具有一个大的和一个小的蛋白质亚基；在图谱上定位于IlvIH、IlvGM和IlvBN操纵子上。酵母中，已将单个AHAS同工酶定位到ILV2基因座上。在每种情况中，已鉴定出了敏感的和具有抗性的形式，若干等位基因的序列也已得到了测定(Friden et al.，Nucl. AcidRes.，133979-3998(1985)；Lawther etal.，PNAS USA，78922-928(1982)；Squires et al.，Nucl.Acids Res.，8115299-5313(1983)；Wek et al.，Nucl.Acids Res.，134011-4027(1985)；Falco and Dumas，Genetics，10921-35(1985)；Falco et al.，Nucl.Acids Res.，134011-4027(1985))。
在烟草中，AHAS的功能是由两个不连锁的基因，SuRA和SuRB编码的。这两个基因之间有高度相同性，表现在核苷酸水平和成熟蛋白质的氨基酸水平上，虽然N-末端，推定的转运区域的变化更大(Leeet al.，EMBO J.，71241-1248(1988))。另一方面，拟南芥具有单条AHAS基因，其已被完全测序(Mazur et al.，Plant Physiol.851110-1117(1987))。对高等植物中AHAS基因序列的比较显示出该序列某些区域具有高水平的保守性；具体而言，至少有10个具有序列保守性的区域。以前已假设，这些保守区域对酶的功能来说是关键的，并且，功能的保留取决于充分的序列保守性。因此，本发明涉及AHAS在植物中的过量表达，以增加其中的Ile水平和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种的水平。
天冬氨酸激酶(AK)是催化苏氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸生物合成第一个步骤的酶。植物中，天冬氨酸家族的氨基酸的生物合成发生于质体中(见，Bryan(1980)InThe Biochemistry ofPlants，Vol.5，B.Miflin(Ed.)Acedamic Press，NY，p.403)。以前已显示，去调节的苏氨酸过量表达能使游离L-苏氨酸的细胞内水平在叶片中增加55％(Shaul and Galili，Plant Physiol.，1001157(1992))，在种子中增加15倍(karchi et al.，Plant J.，3721(1993))。
野生型或被去调节的天冬氨酸激酶的过量表达将增加质体中可用的游离苏氨酸库的量。当组合有野生型、突变体或被去调节的苏氨酸脱氨酶时，被转化成异亮氨酸的苏氨酸的量会被增加。除天冬氨酸激酶(AK)之外，高丝氨酸脱氢酶(HSD)和苏氨酸合酶也可被用于进一步增加游离苏氨酸的水平。
可用于本发明的被去调节的天冬氨酸激酶可以具有一定水平的苏氨酸不敏感性，使得在存在0.1mM苏氨酸时的天冬氨酸的Km浓度下，展示出的天冬氨酸激酶活性要比不存在苏氨酸的试验条件下高10％。可用于本发明的被去调节的高丝氨酸脱氢酶优选具有一定水平的苏氨酸不敏感性，使得在0.1mM苏氨酸和天冬氨酸半醛的Km浓度下，该酶展示出的活性要比不存在苏氨酸的试验条件下高10％。天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶的Vmax值可以在其相应的野生型酶的0.1-100倍之间。天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶的Km值可以在其相应的野生型酶的0.01-10倍之间。
苏氨酸合酶是参与磷酸高丝氨酸向苏氨酸转化的酶，其已显示出在Methylobacillus glycogenes中过量表达时，能将苏氨酸的水平相对内源水平增加大约10倍(Motoyama et al.，Appl.Microbiol.Biotech.，4267(1994))。此外，在烟草细胞培养物中过量表达的E.coli苏氨酸合酶使得从苏氨酸合酶总活性的6倍增长得到了苏氨酸水平的10倍增长(Muhitch，Plant Physiol.，108(2Suppl.)71(1995))。因此，本发明涉及苏氨酸合酶在植物中的过量表达，以增加其中的苏氨酸水平。这可以用于本发明，以确保苏氨酸的供应增加，用于苏氨酸脱氨酶进行的对Ile和Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种的生产。
宿主细胞的转化包含目标基因，例如苏氨酸脱氨酶基因的转基因可被亚克隆到已知的表达载体中，可对苏氨酸脱氨酶的表达进行探测和/或定量。该筛选方法可用于鉴定苏氨酸脱氨酶基因的表达，以及苏氨酸脱氨酶在经过转化的植物细胞质体中的表达。
质粒载体包括能提供如下功能的额外核酸，所述功能包括容易的筛选、扩增以及将转基因转化到原核和真核细胞中，所述载体例如pUC衍生载体，例如pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pUC23、pUC119和pUC120，pSK衍生载体、pGEM衍生载体，pSP衍生载体或pBS衍生载体。额外的核酸包括用于载体在细菌宿主中进行自主复制的复制起点、优选编码抗生素或除草剂抗性的选择性标志基因、提供用于插入转基因中编码的核酸或基因的多个位点的独特的多克隆位点以及增强原核和真核细胞转化的序列。
可用于在植物和原核细胞中进行表达的另一种载体是二元Ti质粒(binary Ti plasmid)，如Schilperoort et al.，U.S.专利4940838所公开的，载体pGA582是其例子。该二元Ti质粒载体以前已由前文引用过的An进行过表征。该二元Ti载体可在原核细菌，例如E.coli或Agrobacterium中进行复制。Agrobacterium质粒载体也可被用于将转基因体转移进植物细胞。二元Ti载体优选包括胭脂碱T DNA右边界和左边界以提供有效的植物细胞转化、选择性标志基因、T边界区域的独特的多克隆位点、colE1复制起点和广宿主范围的复制子。携带有本发明的转基因的二元Ti载体可被用于转化原核和真核细胞，但优选用于转化植物细胞，例如，见Glassman et al.，U.S.专利5258300。
然后可通过可获得的方法将表达载体引入到原核或真核细胞中。对双子叶植物特别有效的转化方法包括但不限于对未成熟胚的微粒轰击(U.S.专利5990390)或II型胚胎发生愈伤组织细胞，如W.J.Gordon-Kamm et al.，Plant Cell，2603(1990)；M.E.Fromm et al.，Bio/Technology，8833(1990)；and D.A.Walters et al.，Plant MolecularBiology，18189(1992)所述；或者通过对I型胚胎发生愈伤组织的电穿孔，如D’Halluin et al.，The Plant Cell，41495(1992)所述，或如Krzyzek，U.S.专利5384253所述。通过与包裹有DNA的钨晶须震荡混合对植物细胞进行转化(Coffee et al.，U.S.专利5302523)以及通过将细胞暴露给含有DNA的脂质体进行的转化也是可以使用的。
筛选过量生产异亮氨酸的细胞系的策略用组织培养技术，对想要的对异亮氨酸类似物具有抗性的过量生产异亮氨酸的变异体的有效筛选需要仔细确定筛选条件。上述条件被最优化，以使得对异亮氨酸或异亮氨酸类似物具有抗性的过量生产异亮氨酸的细胞能在培养基中生长和积累，而细胞群体大部分(bulk ofthe cell population)的生长会受到抑制。群体中单个细胞的生存力高度依赖于邻近细胞的生存力，这一事实将这种状态变得复杂化。
将细胞培养物暴露给异亮氨酸或异亮氨酸类似物的条件是由化合物与组织之间的相互作用的特点来决定的。此类因素，例如毒性程度以及抑制率应当被考虑。培养物中细胞对化合物的积累以及化合物在培养基和细胞中的持续性和稳定性也需要被考虑。
对异亮氨酸或异亮氨酸类似物对培养物生存力和形态的影响进行仔细的评估。尤其重要的是，要选择对培养物的植物再生能力没有影响的类似物暴露条件。对类似物暴露条件的选择还会受到类似物会杀死细胞还是仅对细胞分裂加以抑制的影响。
对筛选方案的选择取决于上述考虑。下文中简单描述的方案可被用于筛选过程。例如，为选出对异亮氨酸或其类似物造成的生长抑制具有抗性的细胞，将在液体悬浮培养物中被精细分开的细胞在短时间内暴露给高水平的异亮氨酸或其类似物。然后回收或收集存活的细胞，随后再将其暴露更长的时间。或者，在连续暴露给最初为低水平的游离L-异亮氨酸或其类似物的情况下，对有组织的部分分化的细胞培养物进行生长和传代培养。然后在若干传代培养间隔上逐渐增加浓度。虽然上述方案可被用于筛选过程，但本发明并不局限于这些过程。
对具有抗性的细胞系的筛选和分析进行筛选，直到回收到下述细胞或组织，所述细胞或组织能被观察到在存在有通常会造成抑制的异亮氨酸类似物水平的情况下，能生长良好。在存在有一种或多种异亮氨酸类似物的情况下，对上述细胞“系”进行额外的若干次传代培养，以除去没有抗性的细胞，然后再进行表征。通过在存在多种类似物浓度的情况下，比较上述细胞系与未经筛选的细胞或组织的生长情况，可以测定出已获得的抗性的量。被培养的细胞的抗性特征的稳定性可通过如下方式来评估在不存在类似物的情况下，对选出的细胞系简单地进行不同时间的培养，然后再将组织暴露给类似物来分析生长情况。还可以使用体外化学研究来评估具有抗性的细胞系，以验证类似物反应位点在苏氨酸脱氨酶内，和/或是否有突变形成以及形成了什么样的突变来使得对异亮氨酸类似物造成的抑制敏感度较低。
可在经过转化的细胞中对苏氨酸脱氨酶基因的瞬间(transient)表达进行探测和定量。可以通过反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)分析、定量Western印记分析(使用对被克隆的苏氨酸脱氨酶具有特异性的抗体)或通过在存在异亮氨酸或异亮氨酸的氨基酸类似物的情况下对酶活进行探测，来对基因表达进行定量。可以通过免疫化学染色方法(其中使用对被克隆的苏氨酸脱氨酶具有特异性的抗体)或亚细胞分级分离，以及随后的生化和/或免疫分析，来确定被克隆的苏氨酸脱氨酶的组织和亚细胞定位。被克隆的苏氨酸脱氨酶对试剂的敏感性也可被测定。然后，可以使用提供苏氨酸脱氨酶或对游离L-异亮氨酸或异亮氨酸的氨基酸类似物造成的抑制具有耐受性的苏氨酸脱氨酶的表达的转基因来转化单子叶和/或双子叶植物组织细胞并使转化的植物和种子再生。可针对选择性标志基因或报道基因的存在来对经过转化的细胞进行筛选，例如通过除草剂抗性来进行。可以使用对被克隆的苏氨酸脱氨酶具有特异性的抗体，或者通过RT-PCR分析，在转基因胚胎产生愈伤组织中对苏氨酸脱氨酶基因的瞬间表达进行探测。
用于植物修饰的基因如前文所述，作为选择性标志基因和报道基因发挥作用的基因在本发明的转基因、载体和植物中，可与编码苏氨酸脱氨酶或其结构域的核酸可操作地组合。此外，还可向本发明的转基因、载体和植物加入其它农艺学特性。此类特性包括但不限于，昆虫抗性或耐受性；疾病抗性或耐受性(病毒、细菌、真菌、线虫)；胁迫抗性或耐受性，其例子包括对干旱、热、寒冷、冰冻、过于潮湿、盐胁迫、氧化胁迫的抗性或耐受性；增加的产量；食物含量和组成；物理外观；雄性不育；干化(drydown)；可站立性(standability)；丰产性；淀粉性质；油的数量和质量等。可将一种或多种带有上述特性的基因插入到本发明的植物中。
对环境或胁迫的抗性或耐受性可通过基因表达来实现植物对多种环境胁迫耐受能力的提高。例如，可通过引入“抗冻”蛋白，例如Winter Flounder所述(Cutler et al.，J Plant Physiol.，135351(1989))，或者其合成基因衍生物，来增加对冰冻温度的抗性。增强的对寒冷的耐受性可通过在质体中增加甘油-3-磷酸乙酰转移酶的表达来获得(Wolter et al.，EMBO J.，114685(1992))。对氧化胁迫的抗性可通过超氧化物歧化酶的表达来获得(Gupta et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，901629(1993))，并可被谷胱甘肽还原酶提高(Bowler et al.，Ann Rev.Plant Physiol.，4383(1992))。
已考虑到，对植物的水含量、总水势、渗透势以及膨胀有有利影响的基因的表达将能增强植物对干旱的耐受能力，因此将会是有用的。例如，已提出，编码具有渗透活性的溶质的生物合成的基因的表达，可能赋予针对干旱的保护。此类基因包括编码甘露醇脱氢酶(Leeand Saier，J.Bacteriol.，25810761(1982))和海藻糖-6-磷酸合酶(Kaasen et al.，J.Bacteriol.，174889(1992))的基因。
类似地，其它代谢物可能保护酶的功能或膜的完整性(Loomis etal.，J.Expt.Zoology，2529(1989))，因此编码这些化合物的生物合成的基因的表达可能会以与甘露醇类似或互补的方式提供对干旱的抗性。具有渗透活性和/或能在干旱和/或干燥期间提供某些直接保护作用的天然存在的代谢物的其他例子包括果糖、赤藓醇、山梨糖醇、半乳糖醇、甘油葡萄糖、蔗糖、水苏糖、蜜三糖、脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱、芒柄醇(ononitol)和松醇。例如，见，U.S.专利6281411。
基于结构相似性，已发现了三类胚胎发生晚期蛋白质(参见，Dureet al.，Plant Molecular Biology，12475(1989))。来自全部三组LEA的结构基因的表达都可以带来对干旱的耐受性。可能有用的在水胁迫期间被诱导的其它类型的蛋白质包括硫醇蛋白酶、醛缩酶、跨膜转运蛋白，在干旱胁迫期间它们可以带来多种不同的保护性和/或修复性的功能。例如，见，PCT/CA99/00219(Na+/H+交换多肽基因)。实现脂类生物合成的基因在带来干旱抗性的方面也可能是有用的。
涉及到能够增加从干旱土壤中吸取水的特定形态特性的基因的表达也可能是有用的。在胁迫期间增强繁殖适合度(reproductivefitness)的基因也可能是有用的。还提出，在胁迫期间使种子败育最小化的基因的表达能增加将要收获的谷物的量并因此有价值。
通过基因的引入和表达，使植物能更为有效地利用水，在土壤水分的可获得程度并非限制因素之时，可以提高植物的整体表现。通过引入能提高植物下述能力的基因，可实现产量稳定性或产量表现的一致性，所述能力为在所有与水可获得性相关的胁迫中对水的利用程度最大化的能力。
植物组分或质量植物的组分可被改变，例如，以提高氨基酸的平衡，这可以通过多种方法来进行，其中包括增加天然蛋白质的表达、降低组成不好的蛋白质的表达、改变天然蛋白质的组分或者引入编码具有较好组分的全新蛋白质的基因。见，例如，U.S.专利6160208(对种子贮藏蛋白质表达的改变)。引入能改变植物中油的含量的基因也是有价值的。例如，见，U.S.专利6069289和6268550(ACCase基因)。可以引入增加植物淀粉成分营养价值的基因，例如，通过增加分支度来进行，从而通过延缓代谢使得淀粉在牛中的利用性提高。
植物农艺学特征确定植物能生长于何处的因素中的两个是生长季节期间的平均日常温度和霜冻之间的时间长度。对植物发育进行的调节中涉及到的基因的表达可能是有用的，例如已在玉米中被鉴定出的无叶舌(liguleless)和粗糙鞘的基因。
能提高可站立性(standability)和其它植物生长特性的基因可被引入到玉米中。能使得茎更强壮、根系统被改善或能预防或减少穗损失的基因的表达对于农民来说将是有价值的。
营养利用对可获得的营养物质利用的能力对于植物生长来说可能是限制性因素。通过引入基因来改变营养物吸收，对pH极限的耐受，植物中的流动，贮藏库(storage pools)以及代谢活性的可获得性是可能的。上述修饰会使植物能更有效地利用可获得的营养物质。例如，通常存在于植物中并涉及到营养物质的利用的酶的活性增加，可以增加营养物质的可获得性。此类酶的一个例子是植酸酶。
雄性不育雄性不育对于生产杂交种子来说是有用的，可以通过基因表达来获得雄性不育。通过转化引入TUFR-13，以将雄性不育与疾病敏感性分开是可能的。见，Levings，(Science，250942-947，(1990))。因为可能必须要为了繁育目的和谷物生产使雄性恢复生育力，因此还可以引入编码使雄性生育力复原的基因。
植物再生和对种子的生产经过转化的胚胎发生愈伤组织、分生组织(meristemate tissue)、胚、叶盘等，可被用于产生转基因植物，所述植物能展示出对经过转化的苏氨酸脱氨酶基因的稳定的遗传性。通过本领域已知的方法，对能展示出对异亮氨酸的氨基酸类似物或游离L-异亮氨酸具有满意耐受性水平的植物细胞系使用植物再生方案，以获得表达出耐受性特征的成熟植物和种子(例如，见U.S.专利5990390和5489520；以及Laursen etal.，Plant Mol.Biol.，2451(1994))。植物再生方案允许体胚(somaticembryo)发育，以及随后长出根和芽。
为确认耐受性特征表达于经过分化的植物器官中，而非仅限于未经分化的细胞培养物中，对被再生的植物进行检测，检测针对植物多个部分中存在的Ile水平以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种的水平进行，所述水平是相对于再生的未经转化的植物而言的。使用标准方法，可从下述经过转化的细胞和组织中获得转基因植物和种子，所述细胞和组织展示出Ile含量以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种的含量的变化，或者对异亮氨酸类似物的抗性。叶片或种子中，Ile含量以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种含量的增加是特别优选的。存在抑制量的异亮氨酸或其类似物的情况下，酶的比活性的改变可通过对经过转化的细胞中的酶活性进行测量来测定，如Widholm，Biochimica et Biophysica Acta，27948(1972)所述。Ile以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种的总含量的改变还可以通过标准方法来进行检测，例如，如Jones et al.，Analyst，106968(1981)所述。
然后可从已知能表达上述特性的细胞系来获得成熟的植物。如果可能的话，被再生的植物是自授粉的。此外，从被再生的植物获得的花粉可被杂交给农艺学上重要的近交系的由种子长出的植物。在一些情况下，来自上述近交系的植物的花粉可用于向被再生的植物授粉。通过对第一代和后代植物中该特性的分离情况进行评估，可从遗传学角度来对该特性进行表征。如果所述特性是可用于商业用途的话，那么，从组织培养物中选出的特性在植物中的遗传性和表达是特别重要的。
如果可获得很多种不同的杂交组合用于销售的话，在大豆、其它豆类、谷物和其它植物中，对Ile以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种进行过量生产的商业价值会达到最大。典型地，农民种植不止一种的杂交植物，基于成熟期、可站立性或其它农艺学特性。此外，适用于一部分农村的杂交植物不适用于另一部分，因为上述特性，例如成熟期、对疾病和昆虫的抗性会有不同。因此，必须要将对Ile以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种的过量生产引入大量的亲本近交系，从而获得多种杂交组合。
通过将最初的过量生产系与普通的原种品系(elite line)杂交，然后再将后代与普通亲本回交，来进行一种转变过程(回交)。来自这种杂交的后代将会分离，从而一些植物带有用于过量生产的基因，而一些不带。带有上述基因的植物将再次与普通亲本杂交，再一次得到按照过量生产和普通生产进行分离的后代。对此进行重复，直到最初的普通亲本转变为能过量生产的品系，并拥有最初在普通亲本中发现的其它所有重要品质。对将被转化为对Ile以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种进行过量生产的品系的所有原种品系进行单独的回交程序。
回交之后，对新的过量生产系和能产生好的商业杂交植物的品系的适当组合进行关于过量生产以及一组重要农艺学特性的评估。生产出对最初的普通系和杂交植物的类型来说是正确的过量生产系和杂交植物。这需要在一系列环境条件(其中，所述的系和杂交植物通常被商业化生长)下来进行评估。为生产具有高含量的Ile以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种的大豆，以下条件可能是必需的杂交植物种子的两个亲本在高含量Ile以及Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种的特性方面是纯合的。使用标准的杂交种子生产方法，增加表现令人满意的杂交植物的亲本系，将其用于杂交植物的生产。
我们期待本文中产生的转基因植物能用于多种商业和研究用途。可为着在传统农业中应用的目的来生产转基因植物，所述植物具有下述特性，所述特性对于从植物中收获的谷物的消费者来说是有好处的(例如，人类食物或动物饲料中增加的营养物的含量)。在此类用途中，通常是为其谷物在人类或动物食品中的用途来对植物进行生长的。但是，所述植物的其它部分，包括茎、壳、根、块茎、花、营养部分等可能也有用途，包括用作为动物青贮饲料、发酵给料、生物催化的一部分，或者用于观赏用途。
转基因植物还可用于对蛋白质或其它分子进行商业生产，其中感兴趣的分子提取或纯化自植物的部分、种子等。还可对来自植物的细胞或组织进行培养、体外培育或发酵以生产此类分子。
转基因植物还可用于商业繁育计划，或可与相关作物物种的植物进行杂交或繁育。由重组DNA编码的改进可被转移，例如从大豆细胞到其它物中的细胞，例如通过原生质体融合。
下述实施例被用于进一步的阐述本发明的某些方面。
实施例1本实施例涉及对下述植物表达载体的构建，所述载体含有编码苏氨酸脱氨酶的多核苷酸等位变异体。
具体而言，选用氨基酸L481对被去调节的苏氨酸脱氨酶进行合理的设计。产生若干突变等位基因，其中每个都具有较之ilvA L481F突变等位基因更高或更低的IC50Ile值。上述等位基因被用于测定苏氨酸脱氨酶的反馈不敏感性范围，用于转基因植物。表2(上文中)列出了在ilvA的第481位氨基酸进行的氨基酸取代。
在本文所述的实施例中，DNA修饰酶，包括限制性酶，都购自NewEngland Biolabs(Beverly，MA)。寡核苷酸引物是由Invitrogen LifeTechnologies(Carlsbad，California)合成的。所有其它的化学物质都购自Sigma-Aldrich(St Louis，MO)。蛋白质测定是按照(Bradford，Anal.Biochem.，72248-254(1976))所述进行的。
使用的ilvA等位基因来源于野生型的E.coli ilv苏氨酸脱氨酶基因(SEQ ID NO1)，其编码可从GenBank数据库获得的SEQ ID NO2(编号K03503；Lawther et al.，Nucleic Acids Res.，152137(1987))。通过对E.coli进行诱变并分离来产生异亮氨酸去调节的苏氨酸脱氨酶变异体，按照(Gruys et al.，U.S.专利5942660；Asrar et al.，U.S.专利6091002和6228623；和Slater et al.，Nature Biotechnology，71011-1016(1999))所述。含有ilvA219(L447F)突变的经诱变的E.coli苏氨酸脱氨酶基因的核苷酸序列是SEQ ID NO14，其对应的经翻译的多肽序列是SEQ ID NO3。含有ilvA466(L481F)突变的经诱变的E.coli苏氨酸脱氨酶基因的核苷酸序列是SEQ ID NO15。所有突变都是通过DNA序列分析加以验证的。
用限制性内切酶BamHI对质粒pMON53905(图1)进行消化，产生5.9Kbp主链片段。该片段作为下文所述的构建体的通用主链片段。
用BamHI对质粒pMON25666(图2)进行消化，以产生分别为3.8和2.8Kbp的两条片段。将2.8Kbp的片段连接到来自pMON53905的5.9Kbp的主链片段上，产生名为pMON53910的质粒(图3)。该质粒含有野生型ilvA基因(SEQ ID NO1)，被用作为对照。
用BamHI对质粒pMON25694进行消化，以产生分别为3.8和2.8Kbp的两条片段。将2.8Kbp的片段连接到(来自pMON53905的)5.9Kbp的主链片段上，产生名为pMON53911的质粒(图4)。该质粒含有经过诱变的E.coli苏氨酸脱氨酶基因，ilvA219(L447F)(SEQ IDNO14)。
用BamHI对质粒pMON25695进行消化，以产生分别为3.8和2.8Kbp的两条片段。将2.8Kbp的片段连接到5.9Kbp的主链片段上，产生名为pMON53912的质粒(图5)。该质粒含有经过诱变的E.coli生物合成苏氨酸脱氨酶基因，ilvA466(L481F)(SEQ ID NO15)。
实施例2在用转基因植物中经过分离的ilvA等位基因进行进一步的转化实验之前，将每个等位基因都在E.coli中过量表达，以测定其动力学参数。表4展示了含有多种突变的苏氨酸脱氨酶的动力学数据，以及与可从来自Arabidopsis的苏氨酸脱氨酶获得的数据的比较。将E.coliilvA481变异体亚克隆进pSE380(invitrogen，Carlsbad，California)，用0.2mM IPTG在37℃处理3小时来诱导表达。如SDS-PAGE所示，E.coli等位基因的表达很高，而且相当一致。每种变异体苏氨酸脱氨酶占到了E.coli中可溶蛋白总量的50％以上。唯一的例外是L481K变异体苏氨酸脱氨酶，其表达很少，酶活也很低。
通过在存在和不存在L-异亮氨酸的情况下进行稳定态动力分析，对ilvA中Leu481上的氨基酸取代的影响进行评价。用于在体外动力学研究中使用的苏氨酸脱氨酶多肽提取自E.coli细胞，提取在试验缓冲液中进行，所述缓冲液含有50mM磷酸钾(pH7.5)、1mM二硫苏糖醇(DTT)和0.5mM的乙二胺四乙酸。使用连续试验的方法在230nm处对α-酮丁酸的形成进行直接监测(ε230(pH7.5)＝540M-1cm-1，而苏氨酸吸收可以忽略不计(～1％))。通过向含有L-苏氨酸(2.5mM至50mM)的试验容器中加入20μl经过120v/v稀释的粗提取物，来起动试验，终体积为1mL。为造成L-异亮氨酸抑制，加入0mM至20mM之间的L-异亮氨酸。使用GraFit 4.0软件(Erithacus Software，Surrey，UK)，将数据点代入公式，对动力学参数进行测定。为进行比较，将L481等位基因的kcat值归一化为野生型IlvA酶的kcat值。上述分析的结果展示于图6和7中。图7中列出的酶是野生型E.coli苏氨酸脱氨酶(圆圈)、L481Y TD酶(菱形)、L481F TD酶(三角形)和L481T TD酶(方形)。表4也对多种E.coli ilvA等位基因生产的变异体苏氨酸脱氨酶的动力学参数进行了概括。
表4.某些表达于E.coli中的苏氨酸脱氨酶的动力学数据

所有L481等位基因都展示出与底物结合成正协同性(S型曲线)，而Arabidopsis的苏氨酸脱氨酶却显示出没有依赖性的活性(典型的双曲线)(图6)。突变体协同性的程度(Hill系数)在1.1(pMON25868，L481Y)至1.6(pMON25865，L481Q；pMON25861，L481I)之间(表4)。有趣的是，通过F-检测(JMP统计软件(SAS Institute，Cary，NC)，可将关于L481Y的动力学数据曲线(n＝1.1)归为双曲线，置信度为99％。存在异亮氨酸时，L481突变体酶的活性会受到抑制，IC50值从97μM(pMON25867，L481V)至1600μM(pMON25868，L481Y)(图7和表4)。L481突变体中没有一种会在更高的IC50值下，对底物结合亲和度(Km)产生不良影响(表4)。因此，比较起来，底物结合亲和度(Km)并未受到残基481位上异亮氨酸结合口袋突变的影响。与L481突变体不同，L447F ilvA219突变体显示出了负协同性(n＝0.5)，虽然该突变体仅受异亮氨酸的轻微抑制(IC50＞20,000μM)。
基于上述动力学数据，IC50Ile在100μM(L481M)至1600μM(L481Y)范围内的四种L481等位基因被选用于Arabidopsis转化。
然后将每种L481等位基因从上表4中所述的E.coli表达质粒中亚克隆到种子特异性的植物表达质粒中，用于向Arabidopsis植物中转化。将E.coli ilvA481等位基因从表4所列的E.coli表达质粒上切下，克隆到作为盒的中间载体中，所述中间载体含有种子增强型启动子(7Sα’；Doyle et al.，J.Biol.Chem.，2619228-9238(1986))；编码ArabidopsisSSUIA转运肽(Stark et al.，Science，258287(1992))的开放阅读框，所述转运肽与含有五种ilvA481等位基因之一的开放阅读框融合；以及3’非翻译区域(NOS；Depicker et al.，J.Mol.Appl.Genet.，1(4)361-370(1982))。通过Agrobacterium介导的侵入反应(infiltration)，将得到的二元植物转化质粒pMON69657(L481P)(图8)、pMON69659(L481Y)(图9)、pMON69660(L481F)(图10)、pMON69663(L481I)(图11)和pMON69664(L481M)(图12)转化到Arabidopsis中(Beachtold et al.，C.R.Acad.Sci.Ser.111，3161194-1199(1993))。在50μM草甘膦存在的情况下对转化子进行筛选。
用比色终点试验(Szamosi et al.，Plant Phys.，101999-1004(1993))，对经转化的植物的提取物进行关于苏氨酸脱氨酶活性的筛选。终点试验在含有100mM Tris-HCl(pH9.0)、100mM KCl、12.5mM L-苏氨酸的反应缓冲液中进行。通过加入50μl酶提取液至终体积为333μl，来起始反应。反应在37℃下温育30分钟，用333μl处于1N HCl中的0.05％DNPH(二硝基苯肼)来终止。在室温下温育10分钟，之后用333μl 4N的NaOH来进行中和。将反应产物转移到一次性的小管(Sarstedt)中，用HP8453二极管阵列分光光度计在540nm处进行读取。若干独立事件(event)产生，其中含有各种L481等位基因。用pMON69657(L481P)(图8)进行的转化具有异乎寻常低的转化频率。较低的转化效率被归因于转化筛选条件，而非所用的特定的苏氨酸脱氨酶等位基因(数据未显示)。所有存活的经过各种L481等位基因转化过的植物在表型上与对照无法区分，它们都具有正常的结籽率(seed set)，这显示，苏氨酸脱氨酶等位基因的表达不会对植物的健康产生有害影响。
为测定经转化的植物中异亮氨酸的浓度，收集变干的成熟的Arabidopsis种子和其它营养组织，对其进行标准的氨基酸分析。简言之，通过在室温振荡混合15分钟，在100μl5％三氯乙酸中对5mg非种子的植物组织进行提取。在16,000g对提取液进行15分钟的离心，将上清液转到HPLC管中，用于根据Agilent进行的分析(TechnicalPublication，2000年4月)。通过荧光光谱，在激发波长为340nm和发射为450nm处，对氨基酸浓度进行测量。
为测定种子中的氨基酸浓度，将20mg成熟的Arabidopsis种子、500μl 0.5mm的锆/二氧化硅珠粒(Boise Products，Inc.)和400μL提取缓冲液(100mM磷酸钾(pH7.4)、5mM氯化镁、1mM EGTA、2mMDTT、2mM 4-2-氨基乙基苯磺酰氟(AEBSF)、100μM亮抑酶肽、10％甘油)分装到2mL带螺旋盖的管中。在4℃，珠磨式组织研磨器(Biospec Products，Inc.)中，最高设置下，对种子进行两次45秒的研磨。在4℃，16000g下，对细胞匀浆进行10分钟的离心，通过荧光光谱，在激发波长为340nm和发射为450nm处，对上清液进行分析。
表5A-5B显示了pMON69659(L481Y)(图9)、pMON69660(L481F)(图10)、pMON69663(L481I)(图11)和pMON69664(L481M)(图12)事件的R2代种子中的异亮氨酸积累情况(ppm)。和预期的一样，来自不同事件的转基因植物中异亮氨酸的积累情况呈现广泛的分布。用pMON69659(L481Y)转化的事件产生的Ile平均为85.9±37.4ppm，范围为38.1至153.9ppm。用pMON69660(L481F)转化的事件产生的Ile平均为319.6±397.4ppm，范围为41.4至2592ppm。用pMON69663(L481I)转化的事件产生的Ile平均为204.3±159.1ppm，范围为55.4至728.2ppm。用pMON69664(L481M)转化的事件产生的Ile平均为168.1±232.0ppm，范围为42.3至1308.6ppm。未经过编码苏氨酸脱氨酶的基因转化过的对照事件产生平均为73.75±2.5ppm的Ile。一种事件，其基于L481F(ilvA466)等位基因，能产生增加23倍的Ile，这是观察到的最大增加。
大部分转化体都无法积累异亮氨酸，以相对于对照增加水平。此外，IC50ILe和转基因植物中积累的异亮氨酸的量之间没有显示出任何关联。例如，用pMON69659(L481Y)转化过的品系具有最高的IC50ILe，但却没有出现任何异亮氨酸水平显著增加的事件。
表5A.用四种不同的苏氨酸脱氨酶构建体转化过的Arabidopsis植物中Ile的浓度(ppm)


表5B.用四种不同的苏氨酸脱氨酶构建体转化过的Arabidopsis植物中Ile的浓度(ppm)


为确定产生的异亮氨酸的水平和苏氨酸脱氨酶的相对表达水平之间是否有任何关联，对若干种具有高异亮氨酸积累和低异亮氨酸积累的品系进行Western印记和酶活性分析。简言之，将大约10μg可溶的粗制提取物上样至4％-20％梯度的SDS-PAGE凝胶(Zaxis)上。将蛋白质转移到PVDF膜(Biorad)上。用TBST(Tris缓冲盐水，具有0.05％Tween 20)中5％的牛奶对印记进行1小时的封闭。用含有针对纯化的酶的多克隆抗体的1∶3000稀释过的(用含有0.5％BSA的TBST)兔血清(MR324)，对印记进行1小时的探测(probe)。用抗兔碱性磷酸酶缀抗体进行探测之后，用Sigma Fast BCIP/NBT片剂(Sigma，St.Louis，MO)对膜进行显色。
结果显示，表达、活性和异亮氨酸积累之间没有明显的关联(数据未显示)。仅在含有最高水平苏氨酸脱氨酶积累的品系中能探测到活性，虽然所有的L481等位基因都显示能积累Western阳性信号。为探测更低表达的品系中的活性，可以使用更为敏感的试验方法(Gruyset al.，1999)。
实施例3本实施例展示了一种在Arabidopsis植株中增加异亮氨酸和缬氨酸浓度的方法，所述方法是通过将异亮氨酸去调节的苏氨酸脱氨酶(TD)(ilvA466，SEQ ID NO15)与缬氨酸和异亮氨酸生物合成途径中涉及到的另外的酶组合起来来实现的，所述另外的酶即，编码E.coli ilvG乙酰乳酸合酶大亚基(EC2.2.1.6；SEQ ID NO16)和ilvM乙酰乳酸合酶II小亚基(EC2.2.1.6；SEQ ID NO17)的多核苷酸分子。
用SmaI和PvuII限制性酶，从pMON53912中切下苏氨酸脱氨酶E.coli IlvA466等位基因(SEQ ID NO15)，将其连接到基础载体pMON38207上的SamI和PmeI限制性位点上，产生pMON58143。将载体pMON58143(图13)用于由Agrobacterium介导的转化，所述转化在卡纳霉素筛选下进行。
通过聚合酶链式反应(PCR)，分离出编码ilvG和ilvM的基因，其中使用基于其分别的一级序列的引物对。pMON58131含有ilvG基因(SEQ ID NO16)。将SEQ ID NO16连接到pGEM-Teasy载体(Promega Corporation，USA)上，得到载体TTFAGA018992。用BspHI和KpnI限制性酶，从TTFAGA018992上切下ilvG基因的5’多核苷酸片段(SEQ ID NO18)，将其连接到含有Arabidops SSU1A转运肽(SEQID NO9；Stark et al.，Science，258287(1992))的中间载体上，产生pMON58145。然后用KpnI和NcoI限制性酶，切下可操作地连接的SSU1A转运肽(SEQ ID NO19)和ilvG基因片段(SEQ ID NO18)，将其连接到pMON58132中。然后用BglII和KpnI限制性酶，从pMON58132中切下可操作地连接的SEQ ID NO18和19，将其连接到穿梭载体pMON36220中，用SamI和KpnI限制性酶进行切割，连接到pMON58146中。用KpnI和EcoRI限制性酶，从TTFAGA018992上切下剩余的3’ilvG多核苷酸片段(SEQ ID NO20)，将其连接到与SEQ ID NO18和19可操作地连接的pMON58146中，产生pMON58147。然后用NotI和EcoRI限制性酶，从pMON58147上切下SSU1A转运肽(SEQ ID NO19)和完整的ilvG编码区域(SEQ ID NO16)，将其连接到pMON64205中。接着用PmeI和BglII，从pMON64205上切下SSU1A转运肽/ilvG盒，然后将其可操作地连接到7s-alpha启动子(U.S.Publication No.2003/0093828)和arcelin53’非翻译区域(WO02/50295-A2)上，产生pMON58136。用NotI和BspHI从pMON58136上切下完整的盒，将其连接到转化载体pMON38207上，产生pMON58138。
pMON58133含有ilvM多核苷酸序列(SEQ ID NO17)。将SEQID NO17连接到pGEM-Teasy(Promega，见上文)中，产生pMON58137。然后用BspHI和NotI限制性酶，从pMON58137上切下SEQ ID NO17，将其连接到pMON58129(先用PmeI和NcoI消化过)。这会使SEQ ID NO17可操作地连接到Napin启动子(U.S.专利5420034)、Arabidopsis SSU1A转运肽和ADR123’-非翻译区域(U.S.专利5981841)上。该质粒被称为pMON58140。用BspHI和NotI限制性酶，切下表达盒，将其连接到植物转化载体pMON38207(先用限制性酶NotI消化过)中，产生pMON58151。
用NotI和BspHI限制性酶从中间载体pMON58140上切下ilvM盒，将其连接到含有ilvG盒和植物转化主链的pMON58138中，产生pMON58159。此外，用PvuII和SmaI限制性酶从pMON53912上切下ilvA466，将其可操作地连接到来自pMON58159的ilvG和ilvM盒上，产生pMON58162(图16)。
通过Agrobacterium介导的侵入反应，将得到的二元植物转化质粒pMON58143(ilvA466)(图13)、pMON58159(ilvG+ilvM)(图14)和pMON58162(ilvA466+ilvG+ilvM)(图15)转化到Arabidopsis中(Beachtold et al.，C.R.Acad.Sci.Ser.111，3161194-1199(1993))。在存在卡纳霉素的情况下对转化子进行筛选。
为测量种子中氨基酸的浓度，将5mg成熟的种子组织研磨成细粉，通过振荡混合，在室温，于100μl 5％的三氯乙酸中，对所述的粉进行15分钟的提取。在16,000g下对提取液进行15分钟的离心，将上清液转移到HPLC管中，按照厂商所述进行分析(AgilentTechnologies，USA)。通过荧光光谱，在激发波长为340nm和发射为450nm处，对氨基酸浓度进行测量。
对于每种构建体而言，产生了若干种独立的事件。对于每种事件，收集变干的成熟的分散开的Arabidopsis种子作为库，将其用于氨基酸分析。用ilvA466(pMON58143)转化过的植物的种子具有增加的异亮氨酸水平，其较之未用ilvA466转化的植物的种子中发现的平均异亮氨酸水平，有大约69倍的增长(表6A)。还观察到了，与其它游离氨基酸(包括精氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸)浓度的正关联，其定义为Pearson’s关联系数(r)为0.60或更高(Snedecor and Cochran，InStatistical Methods，1980)。
来自用ilvG、ilvM(pMON58159)转化过的植物的种子含有升高的缬氨酸水平，其大约比不含ilvG和ilvM的对照种子高大约15倍，并与色氨酸、丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸和酪氨酸具有正关联(r＞0.60)(表6B)。
来自用ilvG、ilvM和ilvA466(pMON58162)转化过的植物的种子含有升高的异亮氨酸(增加了15倍)和缬氨酸(增加了19倍)水平，并且，相对异亮氨酸与赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸具有正关联(r＞0.60)，相对缬氨酸，与丙氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和酪氨酸具有正关联(r＞0.60)(表6C)。
表6A表达E.coli ilvA466等位基因的Arabidopsis植物中的氨基酸浓度以及与Ile浓度的关联性

表6B表达ilvG和ilvM的Arabidopsis植物中的氨基酸浓度以及与Ile和Val浓度的关联性


表6C表达ilvA466、ilvG和ilvM的Arabidopsis植物中的氨基酸浓度以及与Ile和Val浓度的关联性

实施例4本实施例展示了用含有苏氨酸脱氨酶突变等位基因的表达载体对大豆植物进行的转化，其中使用颗粒轰击和农杆菌(Agrobacterium)介导的方法。
对商业可获得的大豆种子(Asgrow A3244、A4922)进行过夜发芽处理(大约16-24小时)，切下分生组织外植体。将初生叶移下，以暴露分生组织，外植体被置于靶向培养基中，其中分生组织被放置于与颗粒运送的方向垂直的方向上。含有不同的ilvA等位基因的编码区域的转化载体pMON53190、pMON53900和pMON53912被用CaCl2和亚精胺沉淀到细微金颗粒上，随后重新悬浮于乙醇中。悬浮液被涂布到Mylar片层上，然后将其放置到放电装置上。通过在大约60％电容条件下放电，将颗粒加速到植物组织中。
轰击之后，将外植体置于加有75mM草甘膦的Woody PlantMedium(WPM)(McCown & Lloyd，Proc.International PlantPropagation Soc.，30421(1981))中，放置5-7周，使得转基因的芽可被筛选和培育。轰击之后大约5-7周，收获草甘膦阳性的芽，将其置于加有25mM草甘膦的选择性豆类生根培养基(Bean Rooting Media，BRM)中，放置2-3周。BRM的组分显示于表7中。将能长出根的芽转移到温室中，种植于土壤中。将在筛选过程中保持健康但却不能产生根的芽转移到非选择性的生根培养基(没有草甘膦的豆类生根培养基(“BRM”))中，再放置2周。对来自在筛选中(off the selection)能产生根的任何芽的根进行关于草甘膦选择性标志表达的测试，之后将其转移到温室，种植于土壤中。植物被保持于标准温室条件下，直到收获种子，该种子被定义为R1种子。
表7.豆类生根培养基(BRM)的组分及制备

将该培养基在加或不加草甘膦(典型地，0.025mM或0.040mM)的条件下使用。所有成分一次溶解一种。用灭菌蒸馏水对混合物进行定容，将其贮藏于锡纸包住的瓶中，于4℃，不超过一个月。
用Agrobacterium介导的转化方法(如Martinell et al.，U.S.专利6384301所述)，还用pMON58028、pMON58029和pMON58031对大豆植物进行转化。对此方法而言，使用本领域技术人员已知的标准方法，将含有包括目标基因的质粒的Agrobacterium tumefaciens的过夜培养物培养至对数阶段，然后稀释至最终光密度为0.3至0.6。上述培养物被用于向制备的大豆胚外植体进行接种，如下文所述。
简言之，该方法是向切下的大豆胚分生组织中的个体大豆细胞中直接进行种系的转化。表面灭菌和种子出芽之后，将大豆胚移开。然后将外植体置于OR培养基上，这是按照Barwal et al.，Plants，167473-481(1986)所述改良过的标准MS培养基，其中加有3mg/LBAP、200mg/L的羧苄青霉素、62.5mg/L的头孢氨噻肟和60mg/L的苯菌灵(Benomyl)，在黑暗中于15℃下贮藏过夜。第二天，用解剖刀片将外植体划伤，用按照上文所述制备的Agrobacterium培养物对其进行接种。然后将经过接种的外植体在室温下培养3天。
转化后培养之后，接着将分生组织区域置于标准植物组织培养基上进行培养，其中存在有除草剂草甘膦(Monsato Company，St.Louis，MO)，草甘膦作为选择性试剂和诱导芽的激素发挥双重作用。在Martinell et al.，U.S.专利6384301中有对培养基组分和培养长度的详细描述。5至6周后，将具有阳性表型的存活的外植体转移到土壤中，在温室条件下对其进行培养，直到成熟。
对5种个别的分离的R1种子的异亮氨酸浓度(如实施例2所示)进行测定，将具有高浓度的那些事件生长成R1植物。对每种事件而言，种植24粒种子。收获得到的R2种子，对异亮氨酸浓度进行测量，对转基因的存在情况进行分析。对R2种子、R2植物和R3种子进行同样的分析。
实施例5本实施例展示了对用苏氨酸脱氨酶基因构建体转化过的大豆植物的鉴定。为测定苏氨酸脱氨酶活性，在100μL 1X碾磨缓冲液(表8)中对单粒(～100mg)种子进行碾磨。然后对混合物在最高速度下进行2-3分钟的离心。通过施加到Bio-Rad Bio-Gel P-30脱盐柱对得到的上清液脱盐。
经过脱盐的蛋白质提取物(25-50μL)被加入到5X试验混合物(表8)中，至终体积为100μL。在37℃下对混合物进行30分钟的培养。通过加入100μL 1N HCl中的0.05％二硝基苯肼来终止反应，接着在室温再培育10分钟。然后加入100μL的4N NaOH的等分试样，通过分光光度计在540nm处测量吸收值。
表8.用于苏氨酸脱氨酶试验的缓冲液


种子中游离异亮氨酸的浓度通过如下方法来测量碾碎大约50mg的种子，将碾碎的材料置于离心管中，然后称重。向每只样品管中加入1mL 5％的三氯乙酸。用振荡混合仪，在室温对样品进行15分钟的混合。然后在14000rpm下于微离心管中对样品进行15分钟的旋转离心。取出上清液中的一些，置于HPLC管中，并密封上。分析之前，样品被放置于4℃。
对所有的R1大豆种子进行一次样品分析，每种事件5粒种子，每粒种子一次注射。对于代表R2和R3种子的后代而言，使用较大规模的试验，每种事件10粒种子，每种事件一次注射。
用Agilent Technologies 1100系列的HPLC系统，对样品进行分析。用2.5μL的OPA试剂(硼酸缓冲液中的邻苯二醛和3-巯基丙酸，Hewlett-Packard PN 5061-3335)，在10μL的pH10.2的0.4N硼酸缓冲液(Hewlett-Packard PN 5061-3339)中，对样品的0.5μL的等分试样进行衍生化。将衍生物注射到Agilent Technologies EclipseXDB-C183.5μm，4.6×75mm，流速为2mL/min。
表9.HPLC实验条件

HPLC缓冲液A95％40mM Na2HPO4，pH＝7.8+5％缓冲液B+0.01％NaN3HPLC缓冲液B45％∶45％∶10％甲醇∶乙腈∶水用荧光探测来测量异亮氨酸浓度(340nm处激发，450nm处发射)，通过在10至800μg/mL范围内的标准曲线对值进行计算。
对经过转化的大豆植物中游离异亮氨酸浓度的评估结果显示，空对照中游离异亮氨酸浓度为种子中大约100μg/g，而用ilvA219和ilvA466等位基因转化过的植物分别具有超过大约600和1300μg/g。上述数据显示，较之未经过转化的植物，用去调节的苏氨酸脱氨酶基因转化过的植物中游离异亮氨酸水平显著更高。
为确定经过苏氨酸脱氨酶构建体转化的大豆植物中是否存在苏氨酸脱氨酶蛋白质，从野生型和异亮氨酸去调节的苏氨酸脱氨酶突变体等位基因产生的品系获得成熟的大豆种子，对其进行Western印记分析。将大豆种子干燥，碾碎成粉。向20mg的粉中加入200μl的1XSDS-PAGE样品缓冲液，在旋转下，于4℃对混合物进行4小时的培养。通过煮沸5-10分钟，来终止反应。然后在14000rpm下对混合物进行10分钟的离心。得到的上清液置于一旁，重复进行离心。将上清液部分合并，用Bio-Rad蛋白质试验试剂盒(Bio-Rad)对其进行关于蛋白质的试验。
然后使用10％的Tris-HCl缓冲液，通过SDS-PAGE来分离上清液部分。加入样品染色剂(10％v/v)后，向每个样品孔上样1mL制备的样品。在Tris-甘氨酸-SDS缓冲液中，140伏下，跑胶1小时。然后将凝胶中的蛋白质转移到预先用甲醇和转移缓冲液润湿过的PVDF膜上。向软片(cartridge)上样后，在冷的Tris-甘氨酸-甲醇缓冲液中，100伏下进行1小时的转移。用10％牛奶溶液(5g脱脂奶粉，在总体积为50mL的含有0.1％Tween 20的TBS缓冲液(20mM Tris，pH7.5和150mM NaCl)中)来进行封闭步骤。
一级抗体是多克隆兔抗苏氨酸脱氨酶抗体，用含有1％Tween 20和1％牛奶溶液的TBS缓冲液对其进行1∶1000的稀释。在室温下培养1小时或者4℃下培养过夜。次级抗体是从Sigma Chemical Co.获得的多克隆抗兔抗体。然后进行显色步骤用含有1％Tween 20的TBS洗3次，每次10分钟，接着用TBS洗10分钟，然后进行染色。
对来自经转化的大豆植物的R3种子提取物进行Western印记分析，其中取三种不同阶段的种子成熟度，对杂合品系和空品系(nullline)进行，结果显示，突变体蛋白质的浓度随种子成熟而增加。在得到的凝胶中，相应于突变体苏氨酸脱氨酶蛋白质的条带位置是可见的，该条带出现于经转化的植物对应的孔道，而在空品系对应的孔道中则不存在。此外，条带的强度随着成熟由早期到晚期明显增加。
实施例6本实施例展示了对经过编码苏氨酸脱氨酶的多核苷酸序列转化的R3大豆种子的氨基酸分析的结果。表10A-10R提供了使用JMP统计软件(SAS Institute，Cary，NC，USA)得到的结果，所述结果是在用苏氨酸脱氨酶转化过的R3大豆事件中测得的氨基酸浓度的统计平均值和误差。
表10A.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的Ile水平

表10B.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的Asp水平

表10C.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的Glu水平

表10D.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的Asn水平

表10E.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的Ser水平

表10F.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的Gln水平

表10G.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的His水平

表10H.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的Gly水平

表10I.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的Thr水平

表10J.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的Arg水平

表10K.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的Ala水平

表10L.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的Tyr水平

表10M.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的Val水平

表10N.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的Met水平

表10O.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的Trp水平

表10P.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的Phe水平

表10Q.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的Leu水平

表10R.表达苏氨酸脱氨酶的大豆植物中的Lys水平

表10A至10R中列出的对氨基酸的分析结果显示，在用编码苏氨酸脱氨酶的多核苷酸转化过的大豆植物中，大量氨基酸的浓度都有所增加。接合性使得数据分离。还提供了一种经过综合的评估，其中除去了接合性的影响。用Pearson的方法(Snedecor and Cochran，InStatistical Methods，1982；JMP统计软件(SAS Institute，Cary，NC，USA))，对数据进行关联性分析。数字的值代表着Pearson’s关联系数(r)。0.60或更高的正值显示氨基酸浓度与Ile浓度正关联。在杂合条件下，氨基酸Asn、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Val、Met、Phe、Leu和Lys都和Ile水平正关联。在纯合条件下，Phe和Lys和Ile浓度正关联。
表11.Ile浓度与其它氨基酸的关联情况

所有公开物和专利都通过引用的方式被包括进本文，这和通过引用单独包括进本文的一样。本发明不限于所示的和所述的具体细节，而应当这样理解，在由声明所限定的本发明的精神和范围之内，可以进行很多种变化和改良。
序列表<110>Weaver，Lisa MMitsky，Timothy ARapp，William DGruys，Kenneth JLiang，Jihong<120>一种或多种氨基酸的水平增加的植物<130>REN-00-095<140>US 60/468,727<141>2003-05-07<160>22<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1714<212>DNA<213>大肠杆菌<400>1ctcgaggtga caaagcctgg acgccgaaaa atcgtgaacg tcaggtctcc tttgccctgc60gtgcttatgc cagcctggca accagcgccg acaaaggcgc ggtgcgcgat aaatcgaaac120tggggggtta ataatggctg actcgcaacc cctgtccggt gctccggaag gtgccgaata180tttaagagca gtgctgcgcg cgccggttta cgaggcggcg caggttacgc cgctacaaaa240aatggaaaaa ctgtcgtcgc gtcttgataa cgtcattctg gtgaagcgcg aagatcgcca300gccagtgcac agctttaagc tgcgcggcgc atacgccatg atggcgggcc tgacggaaga360acagaaagcg cacggcgtga tcactgcttc tgcgggtaac cacgcgcagg gcgtcgcgtt420ttcttctgcg cggttaggcg tgaaggccct gatcgttatg ccaaccgcca ccgccgacat480caaagtcgac cggctgcgcg gcttcggcgg cgaagtgctg ctccacggcg cgaactttga540tgaagcgaaa cgcaaagcga tcgaactgtc acagcagcag gggttcacct gggtgccgcc600gttcgaccat ccgatggtga ttgccgggca aggcacgctg gcgctggaac tgctccagca660ggacgcccat ctcgaccgcg tatttgtgcc agtcggcggc ggcggtctgg ctgcttgcgt720ggcggtgctg atcaaacaac tgatgccgca aatcaaagtg atcgccgtag aagcggaaga780ctccgcctgc ctgaaagcag cgctggatgc gggtcatccg gttgatctgc cgcgcgtagg840gctatttgct gaaggcgtag cggtaaaacg catcggtgac gaaaccttcc gtttatgcca900
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<223>变异等位基因<400>15atggctgact cgcaacccct gtccggtgct ccggaaggtg ccgaatattt aagagcagtg60ctgcgcgcgc cggtttacga ggcggcgcag gttacgccgc tacaaaaaat ggaaaaactg120tcgtcgcgtc ttgataacgt cattctggtg aagcgcgaag atcgccagcc agtgcacagc180tttaagctgc gcggcgcata cgccatgatg gcgggcctga cggaagaaca gaaagcgcac240ggcgtgatca ctgcttctgc gggtaaccac gcgcagggcg tcgcgttttc ttctgcgcgg300ttaggcgtga aggccctgat cgttatgcca accgccaccg ccgacatcaa agtcgaccgg360ctgcgcggct tcggcggcga agtgctgctc cacggcgcga actttgatga agcgaaacgc420aaagcgatcg aactgtcaca gcagcagggg ttcacctggg tgccgccgtt cgaccatccg480atggtgattg ccgggcaagg cacgctggcg ctggaactgc tccagcagga cgcccatctc540gaccgcgtat ttgtgccagt cggcggcggc ggtctggctg cttgcgtggc ggtgctgatc600aaacaactga tgccgcaaat caaagtgatc gccgtagaag cggaagactc cgcctgcctg660aaagcagcgc tggatgcggg tcatccggtt gatctgccgc gcgtagggct atttgctgaa720ggcgtagcgg taaaacgcat cggtgacgaa accttccgtt tatgccagga gtatctcgac780gacatcatca ccgtcgatag cgatgcgatc tgtgcggcga tgaaggattt attcgaagat840gtgcgcgcgg tggcggaacc ctctggcgcg ctggcgctgg cgggaatgaa aaaatatatc900gccctgcaca acattcgcgg cgaacggctg gcgcatattc tttccggtgc caacgtgaac960ttccacggcc tgcgctacgt ctcagaacgc tgcgaactgg tcgaacagcg tgaagcgttg1020ttggcggtga ccattccgga agaaaaaggc agcttcctca aattctgcca actgcttggc1080gggcgttcgg tcaccgagtt caactaccgt tttgccgatg ccaaaaacgc ctgcatcttt1140gtcggtgtgc gcctgagccg cggcctcgaa gagcgcaaag aaattttgca gatgctcaac1200
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<223>变异体多核苷酸<400>21Met Ala Asp Ser Gln Pro Leu Ser Gly Ala Pro Glu Gly Ala Glu Tyr1 5 10 15Leu Arg Ala Val Leu Arg Ala Pro Val Tyr Glu Ala Ala Gln Val Thr20 25 30Pro Leu Gln Lys Met Glu Lys Leu Ser Ser Arg Leu Asp Asn Val Ile35 40 45Leu Val Lys Arg Glu Asp Arg Gln Pro Val His Ser Phe Lys Leu Arg50 55 60Gly Ala Tyr Ala Met Met Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Ala His65 70 75 80Gly Val Ile Thr Ala Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Phe85 90 95Ser Ser Ala Arg Leu Gly Val Lys Ala Leu Ile Val Met Pro Thr Ala100 105 110Thr Ala Asp Ile Lys Val Asp Ala Val Arg Gly Phe Gly Gly Glu Val
115 120 125Leu Leu His Gly Ala Asn Phe Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ile Glu130 135 140Leu Ser Gln Gln Gln Gly Phe Thr Trp Val Pro Pro Phe Asp His Pro145 150 155 160Met Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gln165 170 175Asp Ala His Leu Asp Arg Val Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu180 185 190Ala Ala Gly Val Ala Val Leu Ile Lys Gln Leu Met Pro Gln Ile Lys195 200 205Val Ile Ala Val Glu Ala Glu Asp Ser Ala Cys Leu Lys Ala Ala Leu210 215 220Asp Ala Gly His Pro Val Asp Leu Pro Arg Val Gly Leu Phe Ala Glu225 230 235 240Gly Val Ala Val Lys Arg Ile Gly Asp Glu Thr Phe Arg Leu Cys Gln245 250 255Glu Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Thr Val Asp Ser Asp Ala Ile Cys Ala260 265 270Ala Met Lys Asp Leu Phe Glu Asp Val Arg Ala Val Ala Glu Pro Ser275 280 285Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Met Lys Lys Tyr Ile Ala Leu His Asn290 295 300Ile Arg Gly Glu Arg Leu Ala His Ile Leu Ser Gly Ala Asn Val Asn305 310 315 320Phe His Gly Leu Arg Tyr Val Ser Glu Arg Cys Glu Leu Gly Glu Gln325 330 335Arg Glu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ile Pro Glu Glu Lys Gly Ser Phe340 345 350
Leu Lys Phe Cys Gln Leu Leu Gly Gly Arg Ser Val Thr Glu Phe Asn355 360 365Tyr Arg Phe Ala Asp Ala Lys Asn Ala Cys Ile Phe Val Gly Val Arg370 375 380Leu Ser Arg Gly Leu Glu Glu Arg Lys Glu Ile Leu Gln Met Leu Asn385 390 395 400Asp Gly Gly Tyr Ser Val Val Asp Leu Ser Asp Asp Glu Met Ala Lys405 410 415Leu His Val Arg Tyr Met Val Gly Gly Arg Pro Ser His Pro Leu Gln420 425 430Glu Arg Leu Tyr Ser Phe Glu Phe Pro Glu Ser Pro Gly Ala Leu Leu435 440 445Arg Phe Leu Asn Thr Leu Gly Thr Tyr Trp Asn Ile Ser Leu Phe His450 455 460Tyr Arg Ser His Gly Thr Asp Tyr Gly Arg Val Leu Ala Ala Phe Glu465 470 475 480Leu Gly Asp His Glu Pro Asp Phe Glu Thr Arg Leu Asn Glu Leu Gly485 490 495Tyr Asp Cys His Asp Glu Thr Asn Asn Pro Ala Phe Arg Phe Phe Leu500 505 510Ala Gly<210>22<211>592<212>PRT<213>拟南芥<400>22Met Asn Ser Val Gln Leu Pro Thr Ala Gln Ser Ser Leu Arg Ser His1 5 10 15
Ile His Arg Pro Ser Lys Pro Val Val Gly Phe Thr His Phe Ser Ser20 25 30Arg Ser Arg Ile Ala Val Ala Val Leu Ser Arg Asp Glu Thr Ser Met35 40 45Thr Pro Pro Pro Pro Lys Leu Pro Leu Pro Arg Leu Lys Val Ser Pro50 55 60Asn Ser Leu Gln Tyr Pro Ala Gly Tyr Leu Gly Ala Val Pro Glu Arg65 70 75 80Thr Asn Glu Ala Glu Asn Gly Ser Ile Ala Glu Ala Met Glu Tyr Leu85 90 95Thr Asn Ile Leu Ser Thr Lys Val Tyr Asp Ile Ala Ile Glu Ser Pro100 105 110Leu Gln Leu Ala Lys Lys Leu Ser Lys Arg Leu Gly Val Arg Met Tyr115 120 125Leu Lys Arg Glu Asp Leu Gln Pro Val Phe Ser Phe Lys Leu Arg Gly130 135 140Ala Tyr Asn Met Met Val Lys Leu Pro Ala Asp Gln Leu Ala Lys Gly145 150 155 160Val Ile Cys Ser Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Leu Ser165 170 175Ala Ser Lys Leu Gly Cys Thr Ala Val Ile Val Met Pro Val Thr Thr180 185 190Pro Glu Ile Lys Trp Gln Ala Val Glu Asn Leu Gly Ala Thr Val Val195 200 205Leu Phe Gly Asp Ser Tyr Asp Gln Ala Gln Ala His Ala Lys Ile Arg210 215 220Ala Glu Glu Glu Gly Leu Thr Phe Ile Pro Pro Phe Asp His Pro Asp225 230 235 240
Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Val Gly Met Glu Ile Thr Arg Gln Ala245 250 255Lys Gly Pro Leu His Ala Ile Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu260 265 270Ile Ala Gly Ile Ala Ala Tyr Val Lys Arg Val Ser Pro Glu Val Lys275 280 285Ile Ile Gly Val Glu Pro Ala Asp Ala Asn Ala Met Ala Leu Ser Leu290 295 300His His Gly Glu Arg Val Ile Leu Asp Gln Val Gly Gly Phe Ala Asp305 310 315 320Gly Val Ala Val Lys Glu Val Gly Glu Glu Thr Phe Arg Ile Ser Arg325 330 335Asn Leu Met Asp Gly Val Val Leu Val Thr Arg Asp Ala Ile Cys Ala340 345 350Ser Ile Lys Asp Met Phe Glu Glu Lys Arg Asn Ile Leu Glu Pro Ala355 360 365Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Ala Glu Ala Tyr Cys Lys Tyr Tyr Gly370 375 380Leu Lys Asp Val Asn Val Val Ala Ile Thr Ser Gly Ala Asn Met Asn385 390 395 400Phe Asp Lys Leu Arg Ile Val Thr Glu Leu Ala Asn Val Gly Arg Gln405 410 415Gln Glu Ala Val Leu Ala Thr Leu Met Pro Glu Lys Pro Gly Ser Phe420 425 430Lys Gln Phe Cys Glu Leu Val Gly Pro Met Asn Ile Ser Glu Phe Lys435 440 445Tyr Arg Cys Ser Ser Glu Lys Glu Ala Val Val Leu Tyr Ser Val Gly450 455 460Val His Thr Ala Gly Glu Leu Lys Ala Leu Gln Lys Arg Met Glu Ser
465 470 475 480Ser Gln Leu Lys Thr Val Asn Leu Thr Thr Ser Asp Leu Val Lys Asp485 490 495His Leu Arg Tyr Leu Met Gly Gly Arg Ser Thr Val Gly Asp Glu Val500 505 510Leu Cys Arg Phe Thr Phe Pro Glu Arg Pro Gly Ala Leu Met Asn Phe515 520 525Leu Asp Ser Phe Ser Pro Arg Trp Asn Ile Thr Leu Phe His Tyr Arg530 535 540Gly Gln Gly Glu Thr Gly Ala Asn Val Leu Val Gly Ile Gln Val Pro545 550 555 560Glu Gln Glu Met Glu Glu Phe Lys Asn Arg Ala Lys Ala Leu Gly Tyr565 570 575Asp Tyr Phe Leu Val Ser Asp Asp Asp Tyr Phe Lys Leu Leu Met His580 585 590
权利要求
1.一种DNA构建体，所述构建体包含多个植物表达盒，其中第一个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，该启动子与编码对反馈不敏感的苏氨酸脱氨酶的外源多核苷酸可操作地连接，第二个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，该启动子与编码AHAS的外源多核苷酸可操作地连接。
2.一种DNA构建体，所述构建体包含多个植物表达盒，其中第一个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，该启动子与编码对反馈不敏感的苏氨酸脱氨酶的外源多核苷酸可操作地连接，第二个表达盒包含AHAS的大亚基，第三个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，该启动子与编码AHAS小亚基的外源多核苷酸可操作地连接。
3.如权利要求1或2所述的DNA构建体，其中所述的启动子中的每一种都是种子增强型启动子。
4.如权利要求1或2所述的DNA构建体，其中所述的启动子中的每一种都选自由napin、7S alpha、7S alpha’、7S beta、USP 88、增强的USP 88、Arcelin 5和Oleosin所构成的组。
5.如权利要求3所述的DNA构建体，其中存在至少两种不同的种子增强型启动子。
6.如权利要求1或2所述的DNA构建体，其中，所述第一个盒包含编码对反馈不敏感的包含SEQ ID NO22的苏氨酸脱氨酶的多核苷酸。
7.如权利要求1或2所述的DNA构建体，其中，所述第一个盒包含编码苏氨酸脱氨酶变异等位基因或其亚基的外源多核苷酸，所述变异等位基因或其亚基包含L447F或L481F或L481Y或L481P或L481E或L481T或L481Q或L481I或L481V或L481M或L481K位上的氨基酸取代。
8.如权利要求1或2所述的DNA构建体，其中，所述编码苏氨酸脱氨酶变异等位基因的多核苷酸是SEQ ID NO2，其中包含L447F或L481F或L481Y或L481P或L481E或L481T或L481Q或L481I或L481V或L481M或L481K位上的氨基酸取代。
9.如权利要求1或2所述的DNA构建体，其中，所述第一个盒还包含编码质体转运肽的多核苷酸，所述多核苷酸与编码所述苏氨酸脱氨酶的多核苷酸可操作地连接。
10.如权利要求2所述的DNA构建体，其中，所述第二个表达盒包含编码AHAS大亚基的多核苷酸。
11.如权利要求10所述的DNA构建体，其中，所述编码AHAS大亚基的多核苷酸包含SEQ ID NO16。
12.如权利要求10所述的DNA构建体，其中，编码质体转运肽的多核苷酸与编码所述AHAS大亚基的所述多核苷酸可操作地连接。
13.如权利要求2所述的DNA构建体，其中，所述第三个表达盒包含编码AHAS小亚基的多核苷酸。
14.如权利要求13所述的DNA构建体，其中，所述编码AHAS小亚基的多核苷酸包含SEQ ID NO17。
15.如权利要求13所述的DNA构建体，其中，编码质体转运肽的多核苷酸与编码所述AHAS小亚基的所述多核苷酸可操作地连接。
16.一种DNA构建体，所述构建体包含多个植物表达盒，其中第一个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码对反馈不敏感的苏氨酸脱氨酶的外源多核苷酸可操作地连接，第二个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码AHAS大亚基的外源多核苷酸可操作地连接。
17.如权利要求16所述的DNA建体，其中所述的启动子中的每一种都是种子增强型启动子。
18.如权利要求17所述的DNA构建体，其中所述的种子增强型启动子中的每一种都选自由napin、7S alpha、7S alpha’、7S beta、USP88、增强的USP 88、Arcelin 5和Oleosin所构成的组。
19.如权利要求16或17所述的DNA构建体，其中存在至少两种不同的种子增强型启动子。
20.如权利要求16所述的DNA构建体，其中，所述第一个盒包含编码对反馈不敏感的包含SEQ ID NO22的苏氨酸脱氨酶的多核苷酸。
21.如权利要求16所述的DNA构建体，其中，所述第一个盒包含苏氨酸脱氨酶变异等位基因，所述变异等位基因包含L447F或L481F或L481Y或L481P或L481E或L481T或L481Q或L481I或L481V或L481M或L481K位上的氨基酸取代。
22.如权利要求16所述的DNA构建体，其中，所述编码苏氨酸脱氨酶变异等位基因的多核苷酸是SEQ ID NO2，其中包含L447F或L481F或L481Y或L481P或L481E或L481T或L481Q或L481I或L481V或L481M或L481K位上的氨基酸取代。
23.如权利要求16所述的DNA构建体，其中，所述第一个盒包含编码质体转运肽的多核苷酸，所述多核苷酸与所述编码苏氨酸脱氨酶的多核苷酸可操作地连接。
24.如权利要求16所述的DNA构建体，其中，所述第二个表达盒包含编码AHAS大亚基的多核苷酸。
25.如权利要求24所述的DNA构建体，其中，所述编码AHAS大亚基的多核苷酸包含SEQ ID NO16。
26.如权利要求25所述的DNA构建体，其中，编码质体转运肽的多核苷酸与编码所述AHAS大亚基的所述多核苷酸可操作地连接。
27.一种DNA构建体，所述DNA构建体包含多个植物表达盒，其中一个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码单体AHAS的外源多核苷酸可操作地连接。
28.一种DNA构建体，所述DNA构建体包含多个植物表达盒，其中第一个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码AHAS大亚基的外源多核苷酸可操作地连接，第二个表达盒包含在植物细胞中有功能的启动子，其与编码AHAS小亚基的外源多核苷酸可操作地连接。
29.如权利要求28所述的DNA建体，其中所述的启动子中的每一种都是种子增强型启动子。
30.如权利要求28所述的DNA构建体，其中所述的种子增强型启动子中的每一种都选自由napin、7S alpha、7S alpha’、7S beta、USP88、增强的USP 88、Arcelin 5和Oleosin所构成的组。
31.如权利要求28所述的DNA构建体，其中存在至少两种不同的种子增强型启动子。
32.如权利要求28所述的DNA构建体，其中，所述第一个盒包含AHAS的大亚基，其由SEQ ID NO16构成。
33.如权利要求29所述的DNA构建体，其中，所述第一个盒包含编码质体转运肽的多核苷酸，其与编码AHAS的所述大亚基的所述多核苷酸可操作地连接。
34.如权利要求28所述的DNA构建体，其中，所述第二个盒包含编码AHAS小亚基的多核苷酸。
35.如权利要求28所述的DNA构建体，其中，所述第二个盒包含编码AHAS小亚基的多核苷酸，其由SEQ ID NO17构成。
36.如权利要求35所述的DNA构建体，其中，所述第二个盒包含编码质体转运肽的多核苷酸，其与编码所述AHAS小亚基的所述多核苷酸可操作地连接。
37.一种方法，用于制备种子中氨基酸水平增加的转基因双子叶植物，所述水平增加是相对来自相同植物物种的非转基因植物的种子而言的，所述方法包括下述步骤a)向双子叶植物的可再生细胞中引入包含如权利要求1或2所述的构建体的转基因；b)令所述可再生的细胞再生为双子叶植物；c)从所述植物获取种子；d)选出具有增加的氨基酸水平的一粒或多粒种子，所述水平是相对来自相同植物物种的非转基因植物的种子而言的；以及e)种植所述种子，其中，如果异亮氨酸以增加的水平存在，那么至少一种额外的氨基酸水平也被增加了。
38.如权利要求37所述的方法，其中，所述双子叶植物是大豆植物。
39.如权利要求37所述的方法，其中，氨基酸的水平增加包含下述氨基酸的浓度增加a)Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种和Ile；或b)Arg、Asn、Asp、His、Met、Leu、Val、Gln、Tyr、Thr、Lys、Ala、Ser和Phe中的一种或多种。
40.由如权利要求37所述的方法制造的转基因大豆植物。
41.一种用于制备种子中氨基酸含量增加的转基因双子叶植物的方法，所述增加是相对来自同样的植物物种的非转基因植物的种子而言的，所述方法包括下述步骤a)向双子叶植物的可再生细胞引入包含如权利要求16所述的构建体的转基因；b)令所述可再生的细胞再生为双子叶植物；c)从所述植物获取种子；d)选出具有增加的氨基酸水平的一粒或多粒种子，所述水平是相对来自相同植物物种的非转基因植物的种子而言的；以及e)种植所述种子，其中，如果异亮氨酸以增加的水平存在，那么至少一种额外的氨基酸水平也被增加了。
42.如权利要求41所述的方法，其中，所述双子叶植物是大豆植物或油菜植物。
43.如权利要求41所述的方法，其中，氨基酸的水平增加包含下述氨基酸的浓度增加a)Arg、Asn、Asp、His、Met、Ala、Leu、Thr、Val、Gln、Tyr、Lys、Ser和Phe中的一种或多种和Ile；或b)Arg、Asn、Asp、His、Met、Leu、Val、Gln、Tyr、Thr、Lys、Ala、Ser和Phe中的一种或多种。
44.由权利要求41所述的方法制造的转基因大豆植物。
45.一种用于制备种子中氨基酸含量增加的转基因双子叶植物的方法，所述增加是相对来自同样的植物物种的非转基因植物的种子而言的，所述方法包括下述步骤a)向双子叶植物的可再生细胞引入包含如权利要求27或28所述的构建体的转基因；b)令所述可再生的细胞再生为双子叶植物；c)从所述植物获取种子；d)选出具有增加的氨基酸水平的一粒或多粒种子，所述水平是相对来自相同植物物种的非转基因植物的种子而言的；以及e)种植所述种子。
46.如权利要求45所述的方法，其中，所述双子叶植物是大豆植物或油菜植物。
47.如权利要求45所述的方法，其中，氨基酸的水平增加包含Ser或Val的浓度增加。
48.由如权利要求45所述的方法制造的转基因大豆植物。
49.从如权利要求40、44或48所述的大豆生产出的粗磨粉。
全文摘要
本发明提供了如下DNA构建体，所述DNA构建体包含编码苏氨酸脱氨酶和/或AHAS的外源多核苷酸。本发明还提供了用所述构建体转化过的转基因植物，以及从上述植物获得的种子和后代。所述转基因植物较之同样物种的非转基因植物，一种或多种氨基酸的水平有所增加。
文档编号A01H1/00GK1820073SQ200480019478
公开日2006年8月16日 申请日期2004年5月6日 优先权日2003年5月7日
发明者L·M·韦弗, T·A·米特斯基, W·D·拉普, K·J·格鲁伊斯, J·梁, G·瓦杜瓦 申请人:雷尼森有限责任公司