专利名称：新型苯并噻二唑衍生物及其合成方法和诱导烟草抗烟草花叶病毒的活性的制作方法
技术领域：
本发明的技术方案涉及与碳环稠合的含1，2-二唑的杂环化合物，具体地说是涉及苯并噻二唑衍生物。
背景技术：
植物抗病激活剂本身及其代谢物无直接的杀菌活性，但能诱导植物的免疫系统产生广谱、持久和滞后的系统获得抗病性能。S-甲基苯并[1，2，3]噻二唑-7-硫代羧酸酯(英文缩写为BTH，英文通用名称acibenzolar-S-methyl)是目前一种商品化最成功的植物抗病激活剂，它能激发植物的免疫系统而诱导植物产生具有广谱、持久和滞后的系统获得抗病性能(SAR)(Kunz等，The chemistry of benzothiadiazole plant activators.Pestic.Sci.，1997，50，275-282.)。BTH的基本骨架比较简单，对BTH的结构修饰和诱导抗病活性的报道可用如1-5所示的通式描述(US 4931581、US 4968344、US 5066661、US 5051436、US 5126358、US 5248683、US 5384321)，文献报道的生测结果显示，该类化合物能诱导植物对多种病害产生抗性，如霜霉病稻瘟病、炭疽病等。其中效果相对较好的是结构式1中Z为羰基上连接被甲基或氟取代的苯基，或连有丙醇基和氨基等基团；结构式2中，氨基氰上连有烷氧基、烷硫基、呋喃基等基团；结构式3中，R为羰基，A为磺酰基等基团；结构式4中，羰基上连有被羟基、烷基、苯基取代的环己酮基；结构式5中，A为乙氰基、苯甲酸甲酯基、带氰基的丙烯酸甲酯基、羟胺乙腈等基团的化合物。它们可以使作物对病菌的感染率降低到0-20％。Moriya等在专利WO 9937636中报道了一类有较好诱导抗性效果的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物，能诱导多种植物抵御稻瘟病、灰斑病、炭疽病等多种真菌、细菌和病毒引起的疾病，其结构通式见6，其中R3是氢原子、被氯原子取代的4-异烟酸基，R1、R2为噻唑等基团时效果较好，可使作物对病菌的感染率降低到20％左右。Yoshio等报道了另外一类苯并[1，2，3]噻二唑衍生物的诱导抗性，生测结果显示该类化合物对根肿菌纲、卵菌纲、担子菌纲等有较好的诱抗效果(US 6153763)。Oostendorp等报道了该类化合物也能够保护和免疫植物抗害虫、螨类和线虫，其结构通式见7，其中当Het为噻唑、咪唑、三唑等基团时诱导效果较好(US 2001/0031774 A1)。国内对BTH的结构修饰较少见，有文献合成了新的N-烷基-苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰胺类和苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰肼类衍生物，其中部分化合物表现出诱导黄瓜抗黄瓜灰霉病的诱导抗性，其结构通式见8，其中当R为异丁基或己基时效果较好，对黄瓜灰霉病菌的抑制率达到70-80％(CN 1389114A；侯学太等，N-烷基-苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰胺类化合物的合成及生物活性农药学学报，2001，3(2)19-23)。申请者的专利200510013111.7报道了7种氰基取代的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氨衍生物，2种含苯并[1，2，3]噻二唑取代基的双酰肼衍生物，4种苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰胺衍生物及1种硫代苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸酯的合成方法及其诱导抗病活性，并建立了科学合理和规范化的植物抗病激活剂生物活性筛选和评价体系。筛选结果发现，部分氨基腈取代的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸的衍生物有较好的直接的抗病毒活性，部分酰肼和磺酰肼与苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯反应的衍生物具有较好的诱导活性。
以上专利公开的苯并噻二唑衍生物除了申请者自己的专利外均未涉及其诱导烟草抗烟草花叶病毒(简称TMV)的活性，也未进行过相关的生物活性筛选的研究，为了进一步开发有价值的新的抗TMV活性物质，本发明专利在上一专利的基础上进行了进一步的结构衍生。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供诱导烟草抗烟草花叶病毒的苯并噻二唑衍生物及其合成方法和诱导抗病活性的筛选。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是诱导烟草抗烟草花叶病毒的苯并噻二唑衍生物具有以下的化学结构式I.含苯并[1，2，3]噻二唑取代基的双酰肼衍生物类
II.3-(4’-氟苯基)-6-(苯并-1”，2”，3”-噻二唑)-1，2，4，5-四嗪类化合物 III.苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰胺衍生物类 本发明的诱导烟草抗烟草花叶病毒的苯并噻二唑衍生物的合成方法如下总的合成路线是
具体分为以下步骤A.苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的制备在500mL的三口瓶中加入所需量的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸、及经过无水处理的甲苯、DMF和二氯亚砜，每克苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸约加入7.4mL经过无水处理的甲苯、0.037mL的DMF和0.7mL的二氯亚砜，缓慢升温度至80～90℃，保持此温度继续反应6小时，冷却后过滤，滤液减压蒸除多余的二氯亚砜并脱溶得产品苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯，产品无须纯化并保存在干燥器中备下一步反应直接使用；B.诱导烟草抗烟草花叶病毒的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物的制备I.含苯并[1，2，3]噻二唑取代基的双酰肼衍生物的制备在100mL的三口瓶中加入5mmol酰肼、3滴DMF，10mL无水1，2-二氯乙烷和7.2mmol三乙胺，加热回流下慢慢滴加5mmol苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯与10mL 1，2-二氯乙烷的溶液，滴完后，保持反应温度80～90℃，继续反应3小时，冷却，分别用稀盐酸，饱和碳酸氢钠水溶液，水洗后，无水硫酸钠干燥，过滤后，减压脱溶得粗产物，用体积比为甲醇∶DMSO＝5∶1的溶液重结晶得到纯品，上述化合物的用量可以按相应比例扩大或缩小；II.3-(4’-氟苯基)-6-(苯并-1”，2”，3”-噻二唑)-1，2，4，5-四嗪的合成(1).N-(4’-氟-7’-氯苯亚甲基)-N’-(7-氯苯并-1，2，3-噻二唑亚甲基)肼合成将6.2g PCl5溶于1，2-二氯苯中加热到110℃，再将2.28g N-(4’-氟苯甲酰基)-苯并-1，2，3，-噻二唑甲酰肼的1，2-二氯苯溶液滴加到其中，110℃搅拌反应1小时，减压下脱PCl5和1，2-二氯苯得化合物N-(4’-氟-7’-氯苯亚甲基)-N’-(7-氯苯并-1，2，3-噻二唑-7-亚甲基)肼，甲醇重结晶，得淡黄色晶体0.8g，产率31.4％，熔点231～233℃，该化合物的用量可以按相应比例扩大或缩小； (2)3-(4’-氟苯基)-6-(苯并-1”，2”，3”-噻二唑-7-基)-1，2-二氢-1，2，4，5-四嗪的合成将0.36g的水合肼加入乙醇中回流，再将2.32g N-(4’-氟-7’-氯苯亚甲基)-N’-(7-氯苯并-1，2，3-噻二唑亚甲基)肼的乙醇溶液逐滴滴加，回流反应30分钟，将乙醇旋干，产物用乙醇/水重结晶，得到桔黄色固体1.42g，产率69.2％。熔点225～227℃，该化合物的用量可以按相应比例扩大或缩小；
(3)3-(4’-氟苯基)-6-(苯并-1”，2”，3”-噻二唑)-1，2，4，5-四嗪的合成在100mL的三口瓶的中加入3-(4’-氟苯基)-6-(苯并-1”，2”，3”-噻二唑)-1，2-二氢-1，2，4，5-四嗪0.55g，2.4g的10％NaNO2水溶液，20mL乙醚，搅拌30分钟，取10％的乙酸水溶液2.0g在室温下逐滴滴入三口瓶中，室温下反应5小时，过滤用乙醇重结晶，得紫红色固体I80.54g，产率18％，熔点252～253，该化合物的用量可以按相应比例扩大或缩小； III.苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰胺衍生物的制备在100mL的三口瓶中加入5mmol胺、绝对无水四氢呋喃25mL和6mmol氢化钠，制备相应胺的钠盐悬浮液，回流3小时并冷却混合物，在冰浴下滴加5mmol苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL绝对无水四氢呋喃溶液，冷却下搅拌2小时，逐渐升温并回流6小时，冷却后过滤，滤液在旋转蒸发仪上减压浓缩，用硅胶柱层析纯化得纯品，所用洗脱剂为60～90℃的石油醚和乙酸乙酯，它们的体积比为3∶1，上述化合物的用量可以按相应比例扩大或缩小；本发明的苯并噻二唑衍生物诱导烟草抗烟草花叶病毒活性的筛选方法如下I.标准植物抗病激活剂的选择选择苯并噻二唑和DL-β-氨基丁酸为标准的植物抗病激活剂，离体筛选采用2000μg/mL；直接的活体抗病效果筛选采用500μg/mL；活体诱导效果的评价苯并噻二唑采用100μg/mL，DL-β-氨基丁酸采用2000μg/mL；II.离体直接抗病毒活性的筛选方法将供试化合物配制成含微量表面活性剂土温80的500μg/mL溶液，用磷酸缓冲液将TMV病毒粗提液稀释至适宜的浓度，摩擦接种TMV后，将叶片沿中脉对剖，左右半叶分别浸入供试化合物溶液和清水中，分别代表处理和空白对照，30分钟后取出，置23±1℃的光照下保湿培养，3天后观察其产生枯斑的数量，记录发病情况，按下式计算出供试化合物抗TMV的直接相对效果，每一处理设3次重复，除空白对照外再设计标准药剂处理对照；测试化合物的相对效果分为4级A、B、C、D，具体数据为，A级相对效果＞50％，为优；B级相对效果30～50％，为良；C级相对效果20～30％，为中；D级相对效果＜20％，为差X=CK-ACK×100]]>其中，X为化合物对TMV的直接抑制率或相对效果，单位％CK为清水对照半叶的平均枯斑数，单位个A为药剂处理半叶的平均枯斑数，单位个；
III.活体直接抗病毒活性的筛选方法将苗龄一致的普通烟，3盆为一组，先在烟叶上摩擦接种TMV，立即喷施供试化合物溶液，将烟苗置于其生长适宜温度及光照下培养3天后，检查发病情况，综合病斑数目，按下式计算出供试化合物对TMV的直接抗病毒效果，每一处理设3次重复，对照分空白对照和标准药剂处理对照2种；测试化合物的直接抗病毒效果分为4级A、B、C、D，具体数据为A级抗病毒效果＞50％，为优；B级抗病毒效果50～30％，为良；C级抗病毒效果20～30％，为差；D级抗病毒效果＜20％视为无直接的抗病毒效果，Y=CK-TCK×100]]>其中，Y为新化合物抗TMV活性的直接效果，单位％CK为清水对照叶片的平均枯斑数，单位个T为经化合物处理后叶片的平均枯斑数，单位个；IV.活体诱导抗病毒活性的筛选方法将苗龄一致的普通烟，3盆为一组，分别于接种前7天前处理过的烟苗，处理方式包括喷施供试化合物溶液2到3次，每次20mL，第7天于新长出的烟叶上摩擦接种TMV，将烟苗置于其生长适宜温度及光照下培养3天后，检查发病情况，综合病斑数目按下式计算出供试化合物对TMV的诱导抗病毒效果，每一处理设3次重复，对照分空白对照和标准药剂处理对照2种；测试化合物的相对效果分为4级A、B、C、D，具体数据为A级诱导效果＞70％，为优；B级诱导效果70～50％，为良；C级诱导效果30～50％，为差；D级诱导效果＜30％视为无诱导效果，R=CK-ICK×100]]>其中，R为新化合物对烟草抗TMV的诱导效果，单位％CK为清水对照叶片的平均枯斑数，单位个I为经化合物诱导处理后叶片的平均枯斑数，单位个。
本发明的有益效果是苯并噻二唑是一种标准的植物抗病激活剂，利用申请者前一发明专利建立筛选体系，在成功诱导了烟草植株对TMV产生很好的抗病毒活性的基础上，本发明进一步成功的运用了该体系进行诱导抗病活性的筛选，并进一步用抗病相关酶活性的测定验证了该体系的正确性。发现部分化合物具有较好的诱导活性。
具体实施例方式
实施例1苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的制备在500mL的三口瓶中加入27.0g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸，200mL经过无水处理的甲苯，1mL的DMF，20mL的SOCl2，缓慢升温度至80～90℃，保持此温度继续反应6小时，冷却后过滤，滤液减压脱溶得产品苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯28g，产品无须纯化并保存在干燥器中备下一步反应直接使用。
实施例2I2的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.77g对氟苯磺酰肼、3滴DMF，10mL无水1，2-二氯乙烷和0.3mL吡啶，加热回流下慢慢滴加0.8g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯与10mL 1，2-二氯乙烷的溶液，滴完后，保持反应温度80～90℃，继续反应3h。冷却，分别用稀盐酸，饱和碳酸氢钠水溶液，水洗后，无水硫酸钠干燥，过滤后，减压脱溶得粗产物1.04g，收率73.5％，用甲醇∶DMSO＝5∶1的溶液重结晶得到纯品。测定熔点和1H NMR，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，该化合物1H NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M+1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰。
实施例3I3的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.8g苯磺酰肼、3滴DMF，10mL无水1，2-二氯乙烷和0.4mL吡啶，加热回流下慢慢滴加0.92g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯与10mL 1，2-二氯乙烷的溶液，滴完后，保持反应温度80～90℃，继续反应3h。冷却，分别用稀盐酸，饱和碳酸氢钠水溶液，水洗后，无水硫酸钠干燥，过滤后，减压脱溶得粗产物1.18g，收率76％，用甲醇∶DMSO＝5∶1的溶液重结晶得到纯品。测定熔点和1H NMR，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，该化合物1H NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M-1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰在317.0nm。
实施例4I4的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.82g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰肼、3滴DMF，10mL无水1，2-二氯乙烷和0.35mL吡啶，加热回流下慢慢滴加1g二氯菊酰氯与10mL 1，2-二氯乙烷的溶液，滴完后，保持反应温度80～90℃，继续反应3h。冷却，分别用稀盐酸，饱和碳酸氢钠水溶液，水洗后，无水硫酸钠干燥，过滤后，减压脱溶得粗产物0.9g，收率53.2％，用甲醇∶DMSO＝5∶1的溶液重结晶得到纯品。测定熔点和1H NMR，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，该化合物1H NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M-1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰在316.0nm。
实施例5I5的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.85g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰肼、5滴DMF，10mL无水1，2-二氯乙烷和1mL三乙胺，加热回流下慢慢滴加0.76gN-2-甲基-3-乙基吡唑-5-甲酰氯与10mL 1，2-二氯乙烷的溶液，滴完后，保持反应温度80～90℃，继续反应3h。冷却，分别用稀盐酸，饱和碳酸氢钠水溶液，水洗后，无水硫酸钠干燥，过滤后，减压脱溶得粗产物0.97g，收率65.7％，用甲醇∶DMSO＝5∶1的溶液重结晶得到纯品。测定熔点和1H NMR，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，该化合物1H NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M-1的m/z峰。
实施例6I6的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.7g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰肼、5滴DMF，10mL无水1，2-二氯乙烷和1mL三乙胺，加热回流下慢慢滴加0.72g 2，6-二甲氧基苯甲酰氯与10mL 1，2-二氯乙烷的溶液，滴完后，保持反应温度80～90℃，继续反应3h。冷却，分别用稀盐酸，饱和碳酸氢钠水溶液，水洗后，无水硫酸钠干燥，过滤后，减压脱溶得粗产物0.98g，收率82.3％，用甲醇∶DMSO＝5∶1的溶液重结晶得到纯品。测定熔点和1H NMR，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，该化合物1H NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M-1的m/z峰。
实施例7I8的合成和结构鉴定将5mmol的顺式二氯菊酰氯，7.5mmol的硫氰酸钾，0.17mmol的PEG-400以及15mL的二氯甲烷置于50mL反应瓶中，电磁搅拌，于室温反应1小时后加入4.9mmol的苯并-1，2，3-噻二唑-7-甲酰肼，继续于室温下搅拌30分钟，反应过程中很快就有大量沉淀出现，加入适量的水溶解无机盐，过滤，沉淀干燥后，用DMF-EtOH-H2O混合溶剂重结晶，得到无色晶体I81.66g，收率84.0％，测定熔点和1H NMR，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，该化合物1H NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M-1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰在308.0nm和336.0nm。
实施例8N-(4’-氟-7’-氯苯亚甲基)-N’-(7-氯苯并-1，2，3-噻二唑亚甲基)肼合成将6.2g PCl5溶于1，2-二氯苯中加热到110℃，再将2.28g N-(4’-氟苯甲酰基)-苯并-1，2，3，-噻二唑甲酰肼的1，2-二氯苯溶液滴加到其中，110℃搅拌反应1小时，减压下脱PCl5和1，2-二氯苯得化合物N-(4’-氟-7’-氯苯亚甲基)-N’-(7-氯苯并-1，2，3-噻二唑-7-亚甲基)肼，甲醇重结晶，得淡黄色晶体0.8g，产率31.4％，熔点231～233℃；3-(4’-氟苯基)-6-(苯并-1”，2”，3”-噻二唑-7-基)-1，2-二氢-1，2，4，5-四嗪的合成将0.36g的水合肼加入乙醇中回流，再将2.32g N-(4’-氟-7’-氯苯亚甲基)-N’-(7-氯苯并-1，2，3-噻二唑亚甲基)肼的乙醇溶液逐滴滴加，回流反应30分钟，将乙醇旋干，产物用乙醇/水重结晶，得到桔黄色固体1.42g，产率69.2％。熔点225～227℃；I9的合成在100mL的三口瓶的中加入3-(4’-氟苯基)-6-(苯并-1”，2”，3”-噻二唑)-1，2-二氢-1，2，4，5-四嗪0.55g，2.4g的10％NaNO2水溶液，20mL乙醚，搅拌30分钟，取10％的乙酸水溶液2.0g在室温下逐滴滴入三口瓶中，室温下反应5小时，过滤用乙醇重结晶，得紫红色固体I80.54g，产率18％，测定熔点和1H NMR，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，该化合物1H NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M-1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰在272.0nm。
实施例9II4的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.99g 2-氨基-3-氯-5-三氟甲基吡啶、绝对无水四氢呋喃25mL和0.24g氢化钠，有氢气放出，并形成钠盐悬浮液，回流3小时后，冷却，冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL绝对无水四氢呋喃溶液，冷却下搅拌2小时，然后回流6小时，冷却后过滤，滤液在旋转蒸发仪上减压浓缩得粗产物0.58g，收率35.2％，然后用硅胶柱层析纯化得纯品，洗脱剂为60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1。测定熔点和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，元素分析结果在允许的误差范围内。该化合物1H NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M-1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰在246.0nm和318.0nm。
实施例10II5的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.99g 3-三氟甲基-4-氯苯氨、绝对无水四氢呋喃25mL和0.24g氢化钠，有氢气放出，并形成钠盐悬浮液，回流3小时后，冷却，冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL绝对无水四氢呋喃溶液，冷却下搅拌2小时，然后回流6小时，冷却后过滤，滤液在旋转蒸发仪上减压浓缩得粗产物0.77g，收率42.5％，然后用硅胶柱层析纯化得纯品，洗脱剂为60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1。测定熔点和1HNMR、元素分析和IR及MS，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，元素分析结果在允许的误差范围内。该化合物1H NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M-1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰在254.0nm和320.0nm。
实施例11II6的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.92g 2，4-二硝基苯氨、绝对无水四氢呋喃25mL和0.24g氢化钠，有氢气放出，并形成钠盐悬浮液，回流3小时后，冷却，冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL绝对无水四氢呋喃溶液，冷却下搅拌2小时，然后回流6小时，冷却后过滤，滤液在旋转蒸发仪上减压浓缩得粗产物1.17g，收率67.2％，然后用硅胶柱层析纯化得纯品，洗脱剂为60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1。测定熔点和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，元素分析结果在允许的误差范围内。该化合物1H NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M-1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰在321.0nm。
实施例12II7的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.90g 2，6-二氟-3，5-二氯-4-硝基吡啶、绝对无水四氢呋喃20mL和0.22g氢化钠，有氢气放出，并形成钠盐悬浮液，回流3小时后，冷却，冰浴下滴加0.9g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL绝对无水四氢呋喃溶液，冷却下搅拌2小时，然后回流6小时，冷却后过滤，滤液在旋转蒸发仪上减压浓缩得粗产物0.72g，收率43.7％，然后用硅胶柱层析纯化得纯品，洗脱剂为60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1。测定熔点和1HNMR、元素分析和IR及MS，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，元素分析结果在允许的误差范围内。该化合物1H NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M-1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰在321.0nm。
实施例13II9的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.69g N-乙基-4-甲基嘧啶-2-氨、绝对无水四氢呋喃25mL和0.24g氢化钠，有氢气放出，并形成钠盐悬浮液，回流3小时后，冷却，冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL绝对无水四氢呋喃溶液，冷却下搅拌2小时，然后回流6小时，冷却后过滤，滤液在旋转蒸发仪上减压浓缩得粗产物0.76g，收率52.1％，然后用硅胶柱层析纯化得纯品，洗脱剂为60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1。测定熔点和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，元素分析结果在允许的误差范围内。该化合物1H NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，紫外扫描的最大吸收峰在256.0nm和318.0nm。
实施例14II10的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.83g N-正丁基-4-甲基嘧啶-2-氨、绝对无水四氢呋喃25mL和0.24g氢化钠，有氢气放出，并形成钠盐悬浮液，回流3小时后，冷却，冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL绝对无水四氢呋喃溶液，冷却下搅拌2小时，然后回流6小时，冷却后过滤，滤液在旋转蒸发仪上减压浓缩得粗产物1.11g，收率67.4％，然后用硅胶柱层析纯化得纯品，洗脱剂为60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1。测定熔点和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，元素分析结果在允许的误差范围内。该化合物1H NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M+1的m/z峰，IR出现相应的骨架吸收峰，紫外扫描的最大吸收峰在256.0nm和321.0nm。
实施例15II11的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.90g N-正戊基-4-甲基嘧啶-2-氨、绝对无水四氢呋喃25mL和0.24g氢化钠，有氢气放出，并形成钠盐悬浮液，回流3小时后，冷却，冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL绝对无水四氢呋喃溶液，冷却下搅拌2小时，然后回流6小时，冷却后过滤，滤液在旋转蒸发仪上减压浓缩得粗产物1.03g，收率59.8％，然后用硅胶柱层析纯化得纯品，洗脱剂为60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1。测定熔点和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，元素分析结果在允许的误差范围内。该化合物1H NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，MS测定出现相应M+1的m/z峰，紫外扫描的最大吸收峰在242.0nm和315nm。
实施例16II12的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.90g N-异戊基-4-甲基嘧啶-2-氨、绝对无水四氢呋喃25mL和0.24g氢化钠，有氢气放出，并形成钠盐悬浮液，回流3小时后，冷却，冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL绝对无水四氢呋喃溶液，冷却下搅拌2小时，然后回流6小时，冷却后过滤，滤液在旋转蒸发仪上减压浓缩得粗产物1.07g，收率62.1％，然后用硅胶柱层析纯化得纯品，洗脱剂为60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1。测定熔点和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，元素分析结果在允许的误差范围内。该化合物1H NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，紫外扫描的最大吸收峰在237.0nm和311.0nm。
实施例17II13的合成和结构鉴定在100mL的三口瓶中加入0.83g N-异丁基-4-甲基嘧啶-2-氨、绝对无水四氢呋喃25mL和0.24g氢化钠，有氢气放出，并形成钠盐悬浮液，回流3小时后，冷却，冰浴下滴加1g苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL绝对无水四氢呋喃溶液，冷却下搅拌2小时，然后回流6小时，冷却后过滤，滤液在旋转蒸发仪上减压浓缩得粗产物0.75g，收率45.3％，然后用硅胶柱层析纯化得纯品，洗脱剂为60～90℃的石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1。测定熔点和1H NMR、元素分析和IR及MS，其化学结构式和理化参数见表1和表2，由表1和表2可见，元素分析结果在允许的误差范围内。该化合物1H NMR显示与其结构相应的化学位移，H的数目与其结构吻合，紫外扫描的最大吸收峰在317.0nm。
实施例18本发明的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物的诱导抗病效果半叶枯斑法的试验结果见表3。表3表明，标准的植物抗病激活剂BTH和BABA以及SA和本发明的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物在离体条件下均对TMV无抑制作用，其离体TMV的直接作用效果均小于20％，因此，这类化合物无直接的抑制作用。叶面喷雾诱导活性测定的结果(表3)表明，I9、II4、II7、II10和II13没有诱导活性，I2、I3、I5、I6和II6、II9有较好的诱导效果，其诱导效果与商品化的品种BTH的诱导活性基本相当。
实施例19本发明的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物的诱导烟草抗TMV后苯丙氨酸解氨酶(PAL)的提取和活性测定取经上述化合物诱导后新长出的并接种MV的烟草叶片待测，加3mL 0.2mol/L硼砂缓冲液(pH8.8，含0.005mol/L的巯基乙醇，0.001mol/L的EDTA)及约样品重量1/10的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，在冰浴中匀浆。10000转/分钟，4℃下离心20分钟，上清液作酶活测定。测定系统由2mL 0.2mol/LpH8.8的硼砂缓冲液。1mL0.02mol/LL-苯丙氨酸和0.8mL酶液组成。测定OD290后，于37℃水浴反应1小时，再测定OD290值，对照为硼砂缓冲液3mL加酶液0.8mL。蛋白质含量的测定采用考斯亮蓝G250法，以BSA为标准蛋白。PAL测定的结果见图1，由图1可见，化合物I2、I3、I9和II10、II13诱导后烟草体内PAL酶活性的提高最显著，提高的程度超过商品制剂BTH的诱导结果，部分系列I化合物的PAL活性测定结果与生物活性测定结果基本一致，而部分II系列化合物的PAL活性测定结果与生物活性测定结果存在较大的差异，PAL是植物产生诱导抗性的重要酶之一，产生这一差异的原因有待进一步的研究。
实施例20聚丙烯酰胺凝胶电泳取经化合物诱导后的叶片0.5g加提取液5mL，加少量石英砂后在冰浴中研磨，匀浆液在10000g，4℃下离心15分钟，取上清0.2ml加0.2ml样品缓冲液稀释后将蛋白质液加热到100℃，3-5分钟，冷却后上样到聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中，每孔30μL。然后在浓缩胶稳压100伏特，分离胶稳流400伏特的条件下电泳，整个过程大约需要2小时，再用考马斯亮蓝G-250染色1小时，冰醋酸脱色3次，每次约8小时。
选择诱导效果较好的部分化合物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见图2，由图2可以看出，经过标准的植物诱导抗病激活剂BTH和TMV诱导后在14KD处出现一条病程相关蛋白的条带，而CK没有该蛋白条带，本专利的化合物I5、I6和I9以及II6在此也出现一条病程相关蛋白的条带，这进一步证明了这些化合物的诱导抗病活性。
表1本发明化合物的理化参数
表2本发明化合物的1H NMR和MS以及IR数据
表3本发明中的化合物诱导烟草抗烟草花叶病毒的活性
注表中数据是5次实验的平均结果
图1，经化合物诱导后烟草体内PAL酶活性的变化(图中数据是3次实验的平均结果)。
图2，部分高诱导活性的化合物病程相关蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
权利要求
1.苯并噻二唑衍生物，其特征在于具有以下的化学结构式
2.权利要求1所述的苯并噻二唑衍生物的合成方法，其特征在于总的合成路线是 具体分为以下步骤A.苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的制备在500mL的三口瓶中加入所需量的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸、及经过无水处理的甲苯、DMF和二氯亚砜，每克苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酸约加入7.4mL经过无水处理的甲苯、0.037mL的DMF和0.7mL的二氯亚砜，缓慢升温度至80～90℃，保持此温度继续反应6小时，冷却后过滤，滤液减压蒸除多余的二氯亚砜并脱溶得产品苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯，产品无须纯化并保存在干燥器中备下一步反应直接使用；B.诱导烟草抗烟草花叶病毒的苯并[1，2，3]噻二唑衍生物的制备I.氰基取代的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氨衍生物的制备在100mL的三口瓶中加入5mmol氨基氰、20mL二氯甲烷和8mmol的三乙胺，在冰浴下滴加5mmol的苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯与10mL二氯甲烷溶液，滴完后室温反应2小时，回流3小时，冷却，反应液依次用稀盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液和水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤后，减压脱溶得粗产物，然后用硅胶柱层析纯化得纯品，所用洗脱剂为60～90℃的石油醚和乙酸乙酯，它们的体积比为2∶1，上述化合物的用量可以按相应比例扩大或缩小；I.含苯并[1，2，3]噻二唑取代基的双酰肼衍生物的制备在100mL的三口瓶中加入5mmol酰肼、3滴DMF，10mL无水1，2-二氯乙烷和7.2mmol三乙胺加热回流下，慢慢滴加5mmol苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯与10mL 1，2-二氯乙烷的溶液，滴完后，保持反应温度80～90℃，继续反应3小时，冷却，分别用稀盐酸，饱和碳酸氢钠水溶液，水洗后，无水硫酸钠干燥，过滤后，减压脱溶得粗产物，用体积比为甲醇∶DMSO＝5∶1的溶液重结晶得到纯品，上述化合物的用量可以按相应比例扩大或缩小；II.3-(4’-氟苯基)-6-(苯并-1”，2”，3”-噻二唑)-1，2，4，5-四嗪的合成在100mL的三口瓶的中加入3-(4’-氟苯基)-6-(苯并-1”，2”，3”-噻二唑)-1，2-二氢-1，2，4，5-四嗪0.55g，2.4g的10％NaNO2水溶液，20mL乙醚，搅拌30分钟，取10％的乙酸水溶液2.0g在室温下逐滴滴入三口瓶中，室温下反应5小时，过滤用乙醇重结晶得产物，该产物的合成量可以按相应比例扩大或缩小；其中，3-(4’-氟苯基)-6-(苯并-1”，2”，3”-噻二唑-7-基)-1，2-二氢-1，2，4，5-四嗪的合成为将0.36g的水合肼加入乙醇中回流，再将2.32g N-(4’-氟-7’-氯苯亚甲基)-N’-(7-氯苯并-1，2，3-噻二唑亚甲基)肼的乙醇溶液逐滴滴加，回流反应30分钟，将乙醇旋干，产物用乙醇/水重结晶得桔黄色固体，该化合物的用量可以按相应比例扩大或缩小；原料N-(4’-氟-7’-氯苯亚甲基)-N’-(7-氯苯并-1，2，3-噻二唑亚甲基)肼的合成为将6.2g PCl5溶于1，2-二氯苯中加热到110℃，再将2.28gN-(4’-氟苯甲酰基)-苯并-1，2，3，-噻二唑甲酰肼的1，2-二氯苯溶液滴加到其中，110℃搅拌反应1小时，减压下脱PCl5和1，2-二氯苯得化合物N-(4’-氟-7’-氯苯亚甲基)-N’-(7-氯苯并-1，2，3-噻二唑-7-亚甲基)肼，甲醇重结晶得淡黄色晶体，该化合物的用量可以按相应比例扩大或缩小；III.苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰胺衍生物的制备在100mL的三口瓶中加入5mmol胺、绝对无水四氢呋喃25mL和5mmol氢化钠，制备相应胺的钠盐悬浮液，回流3小时并冷却混合物，在冰浴下滴加5mmol苯并[1，2，3]噻二唑-7-甲酰氯的15mL绝对无水四氢呋喃溶液，冷却下搅拌2小时，逐渐升温并回流6小时，冷却后过滤，滤液在旋转蒸发仪上减压浓缩，用硅胶柱层析纯化得纯品，所用洗脱剂为60～90℃的石油醚和乙酸乙酯，它们的体积比为3∶1，上述化合物的用量可以按相应比例扩大或缩小。
3.权利要求1所述的苯并噻二唑衍生物用于诱导烟草抗烟草花叶病毒，其诱导抗病活性的筛选方法如下I.标准植物抗病激活剂的选择选择苯并噻二唑和DL-β-氨基丁酸为标准的植物抗病激活剂，离体筛选采用2000μg/mL；直接的活体抗病效果筛选采用500μg/mL；活体诱导效果的评价苯并噻二唑采用100μg/mL，DL-β-氨基丁酸采用2000μg/mL；II.离体直接抗病毒活性的筛选方法将供试化合物配制成含微量表面活性剂土温80的500μg/mL溶液，用磷酸缓冲液将TMV病毒粗提液稀释至适宜的浓度，摩擦接种TMV后，将叶片沿中脉对剖，左右半叶分别浸入供试化合物溶液和清水中，分别代表处理和空白对照，30分钟后取出，置23±1℃的光照下保湿培养，3天后观察其产生枯斑的数量，记录发病情况，按下式计算出供试化合物抗TMV的直接相对效果，每一处理设3次重复，除空白对照外再设计标准药剂处理对照；测试化合物的相对效果分为4级A、B、C、D，具体数据为，A级相对效果＞50％，为优；B级相对效果30～50％，为良；C级相对效果20～30％，为中；D级相对效果＜20％，为差X=CK-ACK×100]]>其中，X为化合物对TMV的直接抑制率或相对效果，单位％CK为清水对照半叶的平均枯斑数，单位个A为药剂处理半叶的平均枯斑数，单位个；III.活体诱导抗病毒活性的筛选方法将苗龄一致的普通烟，3盆为一组，分别于接种前7天前处理过的烟苗，处理方式包括喷施供试化合物溶液2到3次，每次20mL，第7天于新长出的烟叶上摩擦接种TMV，将烟苗置于其生长适宜温度及光照下培养3天后，检查发病情况，综合病斑数目按下式计算出供试化合物对TMV的诱导抗病毒效果，每一处理设3次重复，对照分空白对照和标准药剂处理对照2种；测试化合物的相对效果分为4级A、B、C、D，具体数据为A级诱导效果＞70％，为优；B级诱导效果70～50％，为良；C级诱导效果30～50％，为差；D级诱导效果＜30％视为无诱导效果，R=CK-ICK×100]]>其中，R为新化合物对烟草抗TMV的诱导效果，单位％CK为清水对照叶片的平均枯斑数，单位个I为经化合物诱导处理后叶片的平均枯斑数，单位个。
全文摘要
一种苯并噻二唑双酰肼的衍生物、苯并噻二唑四嗪的衍生物和苯并噻二唑N取代酰氨的衍生物及其合成方法和诱导烟草抗烟草花叶病毒的活性，涉及与碳环稠合的含1，2－二唑的杂环化合物，它们具有如上化学结构式，其中包括6种含苯并[1，2，3]噻二唑取代基的双酰肼衍生物，1种含苯并噻二唑四嗪的衍生物，9种N－取代的苯并[1，2，3]噻二唑－7－甲酰胺衍生物。本发明公开了这些化合物的合成方法及其诱导烟草抗烟草花叶病毒的活性。
文档编号A01N43/828GK1743322SQ200510014378
公开日2006年3月8日 申请日期2005年7月5日 优先权日2005年7月5日
发明者范志金, 刘凤丽, 刘秀峰, 范志银, 鲍丽丽, 张永刚, 苑建勋, 石祖贵 申请人:南开大学