专利名称：一种姬松茸富锌液体培养的方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵领域，具体的说是一种通过液体深层发酵技术进行姬松茸富集微量元素锌的液体培养方法。
背景技术：
姬松茸(Agaricus blazei murill)原产于巴西，美国等地，故名巴西蘑菇，又名小松菇，是一种食药兼用的真菌。近年来国内外实验研究发现姬松茸子实体中含有抗肿瘤多糖、凝集素(lectin)、甾醇、核酸等生理活性成分，引起了极大关注，同时发现姬松茸在降血脂、降血压、治疗糖尿病及维护肝功能等方面具有显著的医疗保健作用，是一种极具开发价值的珍贵食药用真菌。
近十年来，日本对姬松茸进行了较为系统的研究，主要偏重于从姬松茸子实体中提取活性成分以及其实验室水平上药理作用的研究，目前发现姬松茸子实体中的抗肿瘤成分主要有多糖、甾醇、凝集素、不饱和脂肪酸及核酸蛋白复合物等。姬松茸抗癌效果显著，据日本东京大学医学部、国立癌症研究中心报道，姬松茸的抗癌作用明显优于其它11种有抗癌作用的大型真菌，位居抗癌真菌首位，而且具有用量少、抗癌作用强等特点。美国Health-plus’sand Vesta’s公司已生产用子实体提取物做成的胶囊，用于治疗AIDS病。并报道在美国和墨西哥医院用于治疗癌症病人，包括IV期病人。
随着姬松茸液体培养技术的逐步成熟，研究表明液体发酵获得的菌丝体、发酵液的提取物同固体栽培的子实体及子实体提取物有相同活性(T.mizuno，1995)。
相关的姬松茸液体培养方面的专利有龚建华等人建立的一种液体培养姬松茸的方法(申请号00124928.2)；樊美珍等人建立了工业液体发酵生产姬松茸的工艺方法(专利号ZL00135444.2)；李保健等人发明了大规模液体深层生产姬松茸的生产工艺(专利号ZL01129715.8)。
微量元素具有重要的生物学作用，在维持机体健康方面具有重大实用价值，锌是生命必需的微量元素之一，是人体许多活化酸的催化因子，参与体内300余种酸和功能蛋白的组成，具有广泛的生理生化功能。锌对提高智力，提高妇女优生优育率，避免习惯性流产、死胎、早产和先天畸形，有降血压、胆固醇、甘油三酯的作用，还有治疗高血压、冠心病、脑血栓后遗症、糖尿病等保健功能。据资料显示，我国约有60％的儿童每天锌的摄入量为标准量的50％，影响了儿童的正常发育。对老年人的锌营养状况研究表明，锌摄入不足，易致免疫功能的减退，易患肿瘤和感染性疾病。而以无机盐形式补锌，其缺点是难以吸收，且一般游离态金属均具有一定的毒性。
目前锌强化食品的锌源绝大部分为无机锌，不易为人体吸收；有机锌是一种新型的锌源，无机锌有机化之后，形成的金属一有机复合物对人体可产生各种特殊的生理功能和保健功能。研制开发高生物学利用率的补锌产品乃当务之急。
利用姬松茸在生长过程中能富集金属元素的特性，将无机锌生物转化为有机锌，可以大大提高机体对锌的生物利用率。章克昌、邹祥等人进行这方面的研究，使姬松茸富锌率达到8.41％。(无锡轻功大学学报，2003，22(2)48-52)。
发明内容
本发明的目的在于寻求一种姬松茸富锌液体培养的方法，尽可能的提高姬松茸的富锌率，使更多的无机锌转化为有机锌，从而更有利于发挥锌的免疫功能和姬松茸的抗肿瘤及其它疾病病功能。
按照本发明所提供的设计方案，姬松茸富锌液体培养的方法包括下述步骤a、斜面菌种培养取分离纯化的姬松茸菌种接种于斜面培养基中，放入培养箱，25℃培养，待菌丝长满斜面后，转入下一步培养；b、液体种子培养将培养好的斜面菌种接入液体种子培养基中，培养条件为24～28℃，摇床转速120～150转/分钟，培养6～10天；c、富锌发酵培养将培养好的液体种子按5～15％体积比的接种量转接入装有富锌发酵培养基的发酵罐中，24～28℃培养，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌速率90～130转每分钟，通风量1∶0.3～0.8v/v/m，培养3～5天，在富锌发酵培养过程中进行pH控制发酵，即起始pH为5.4～5.8，当发酵液pH下降到4.8～5.0时，补加碱性物质，控制发酵pH维持在4.8～5.1范围内24～48小时，得到富含有机锌的姬松茸发酵液。
所述斜面培养基是普通土豆培养基。将培养好的斜面菌种切割成黄豆大小的小块接种于液体种子培养基中，种子培养基为(单位为克/升)玉米粉10～30，蔗糖15～30，麸皮10～25，磷酸二氢钾0.8～2，硫酸镁0.5～1.5，维生素B10.08～0.1，起始pH为自然pH。
富锌发酵培养的发酵培养基为(单位为克/升)玉米粉10～30，蔗糖5～20，麸皮10～25，磷酸二氢钾1.5～3，硫酸镁1.0～2.5，维生素B10.08～0.1，棕榈酸1.8～2.5，硫酸锌0.15～0.5。
富锌发酵培养的富锌发酵培养过程进行pH控制发酵，即起始pH为5.4～5.8，当发酵液pH下降到4.8～5.0时，补加碱性物质，控制发酵pH维持在4.8～5.1范围内24～48小时。
所述的碱性物质通常采用低浓度氢氧化钠，添加量根据实际情况确定，目的是将发酵液的pH维持在4.8～5.1。
本发明所述的姬松茸菌种购自华中农业大学菌种中心。
本发明步骤2所述的液体种子培养，其培养基放在摇瓶中，摇瓶放于摇床上，液体种子培养基的体积与摇瓶体积之比为1∶5。
本发明步骤3所述的富锌发酵培养，发酵罐培养的发酵液体积与发酵罐体积之比为6～7∶10。
本发明步骤3所述的通风量1∶0.3～0.8v/v/m，是指1个体积的发酵液每分钟通0.3～0.8体积的空气。
本发明步骤3所述的富锌发酵培养结束的标准为发酵液糖浓度下降到小于等于5克/升，发酵液pH下降到4.6。
本发明的优点在于在富锌发酵过程中通过pH控制使姬松茸的富锌率大大提高，富锌率达到11.7～12.2％，从而使更多无机锌转变为有机锌；本发明更有利于发挥锌的免疫功能和姬松茸的抗肿瘤及其它疾病病功能，姬松茸富锌后，它的抗肿瘤活性得到进一步的提高；本发明为今后姬松茸富锌的工业化生产打下了坚实的基础。
具体实施例方式
在下面所述的所有具体实施方式
中糖的测定采用DNS法，该方法在《发酵工业分析》(天津轻工业学院、无锡轻工大学、大连轻工业学院、华南理工大学编著；1980年第1版，2002年第10次印刷)以及其它众多相关的教科书和著作中均有详细的表述，在这里不再详述。锌浓度的测定采用的方法为双硫腙分光光度法GB/T 500914-1996，中华人民共和国国家标准；锌有机化程度分析所采用的方法为静置浸出法(微生物学报，1997，37(1)40-56)。所述实施例中的发酵罐的体积为30升，pH可自动控制。氢氧化钠溶液的浓度为5％(质量百分比)，单独灭菌后供发酵过程流加使用。
实施例1种子培养基的体积为100毫升，装入500毫升的三角瓶中，共9瓶。将斜面长好的菌种接入种子培养基中。种子培养基为(单位为克/升)玉米粉10，蔗糖15，麸皮10，磷酸二氢钾0.8，硫酸镁0.5，维生素B10.08，起始pH为自然pH。培养条件为24℃，摇床转速120转每分钟，培养10天。将培养好的种子接入发酵罐中，接种量为900毫升，发酵液总体积18升。发酵培养基为玉米粉10，蔗糖5，麸皮10，磷酸二氢钾1.5，硫酸镁1.0，维生素B10.08，棕榈酸1.8，硫酸锌0.15。24℃培养，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶0.8v/v/m。发酵起始pH5.4，当发酵液pH降到5.0后，发酵罐自动控制流加氢氧化钠溶液，维持pH在4.8～5.1范围内24小时，培养3天。姬松茸的富锌率为11.7％。
实施例2种子培养基的体积为100毫升，装入500毫升的三角瓶中，共9瓶。将斜面长好的菌种接入种子培养基中。种子培养基为(单位为克/升)玉米粉30，蔗糖30，麸皮25，磷酸二氢钾2，硫酸镁1.5，维生素B10.1，起始pH为自然pH。培养条件为24℃，摇床转速150转每分钟，培养6天。将培养好的种子接入发酵罐中，接种量为900毫升，发酵液总体积18升。发酵培养基为玉米粉30，蔗糖20，麸皮25，磷酸二氢3，硫酸镁2.5，维生素B10.1，棕榈酸2.5，硫酸锌0.5。24℃培养，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶0.8v/v/m。发酵起始pH5.8，当发酵液pH降到4.8后，发酵罐自动控制流加氢氧化钠溶液，维持pH在4.8～5.1范围内48小时，培养5天。姬松茸的富锌率为11.8％。
实施例3
种子培养基的体积为100毫升，装入500毫升的三角瓶中，共21瓶。将斜面长好的菌种接入种子培养基中。种子培养基为(单位为克/升)玉米粉20，蔗糖20，麸皮15，磷酸二氢钾1.2，硫酸镁0.75，维生素B10.09，起始pH为自然pH。培养条件为28℃，摇床转速140转每分钟，培养7天。将培养好的种子接入发酵罐中，接种量为2.1升，发酵液总体积21升。发酵培养基为玉米粉20，蔗糖10，麸皮15，磷酸二氢钾2.0，硫酸镁2.0，维生素B10.09，棕榈酸2.0，硫酸锌0.3。24～28℃培养，发酵罐压力0.05～0.08Mpa，搅拌速率130转每分钟，通风量1∶0.4v/v/m。发酵起始pH5.6，当发酵液pH降到4.9后，发酵罐自动控制流加氢氧化钠溶液，维持pH在4.8～5.1范围内36小时，培养4天。姬松茸的富锌率为11.8％。
实施例4种子培养基的体积为100毫升，装入500毫升的三角瓶中，共24瓶。将斜面长好的菌种接入种子培养基中。种子培养基为(单位为克/升)玉米粉15，蔗糖18，麸皮22，磷酸二氢钾1.8，硫酸镁1.2，维生素B10.08，起始pH为自然pH。培养条件为27℃，摇床转速1425转每分钟，培养9天。将培养好的种子接入发酵罐中，接种量为2.4升，发酵液总体积20升。发酵培养基为玉米粉15，蔗糖15，麸皮18，磷酸二氢钾2.25，硫酸镁1.25，维生素B10.08，棕榈酸2.25，硫酸锌0.2。27℃培养，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌速率120转每分钟，通风量1∶0.5v/v/m。发酵起始pH5.5，当发酵液pH降到4.8后，发酵罐自动控制流加氢氧化钠溶液，维持pH在4.8～5.1范围内40小时，培养4天。姬松茸的富锌率为12.0％。
实施例5种子培养基的体积为100毫升，装入500毫升的三角瓶中，共10瓶。将斜面长好的菌种接入种子培养基中。种子培养基为(单位为克/升)玉米粉25，蔗糖25，麸皮10，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁1.0，维生素B11.0，起始pH为自然pH。培养条件为25℃，摇床转速150转每分钟，培养8天。将培养好的种子接入发酵罐中，接种量为1.0升，发酵液总体积20升。发酵培养基为玉米粉25，蔗糖10，麸皮10，磷酸二氢钾2.5，硫酸镁1.0，维生素B11.0，棕榈酸2.0，硫酸锌0.3。25℃培养，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌速率115转每分钟，通风量1∶0.5v/v/m。发酵起始pH5.6，当发酵液pH降到5.0后，发酵罐自动控制流加氢氧化钠溶液，维持pH在4.8～5.1范围内32小时，培养4天。姬松茸的富锌率为12.2％。
实施例6种子培养基的体积为100毫升，装入500毫升的三角瓶中，共32瓶。发酵罐的接种量为3.15升，发酵液体积21升。当发酵液pH降到4.8后，发酵罐自动控制流加氢氧化钠溶液，维持pH在4.8～5.1范围内24小时，培养3天。其余条件同实施例3。姬松茸的富锌率为11.9％。
实施例7种子培养基的体积为100毫升，装入500毫升的三角瓶中，共30瓶。将斜面长好的菌种接入种子培养基中。种子培养基同实施例1。培养条件为26℃，摇床转速150转每分钟，培养7天。将培养好的种子接入发酵罐中，接种量为3.0升，发酵液总体积20升。发酵培养基同实施例2。26℃培养，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌速率130转每分钟，通风量1∶0.3v/v/m。发酵起始pH5.7，当发酵液pH降到4.8后，发酵罐自动控制流加氢氧化钠溶液，维持pH在4.8～5.1范围内44小时，培养5天。姬松茸的富锌率为11.9％。
实施例8种子培养基的体积为100毫升，装入500毫升的三角瓶中，共18瓶。将斜面长好的菌种接入种子培养基中。种子培养基为同实施例2。培养条件为27℃，摇床转速135转每分钟，培养6天。将培养好的种子接入发酵罐中，接种量为1.8升，发酵液总体积18升。发酵培养基同实施例1。27℃培养，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌速率110转每分钟，通风量1∶0.7v/v/m。发酵起始pH5.8，当发酵液pH降到5.0后，发酵罐自动控制流加氢氧化钠溶液，维持pH在4.8～5.1范围内28小时，培养3天。姬松茸的富锌率为11.8％。
实施例9种子培养基的体积为100毫升，装入500毫升的三角瓶中，共27瓶。将斜面长好的菌种接入种子培养基中。种子培养基为和培养条件同实施例5。将培养好的种子接入发酵罐中，接种量为2.7升，发酵液总体积18升。发酵培养基为硫酸锌0.4，其余成份同同实施例5。发酵条件同实施例5。姬松茸的富锌率为12.1％。
实施例10种子培养基的体积为100毫升，装入500毫升的三角瓶中，共20瓶。将斜面长好的菌种接入种子培养基中。种子培养基为和培养条件同实施例3。将培养好的种子接入发酵罐中，接种量为2.0升，发酵液总体积20升。发酵培养基同实施例4。26℃培养，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌速率125转每分钟，通风量1∶0.4v/v/m。发酵起始pH5.7，当发酵液pH降到4.9后，发酵罐自动控制流加氢氧化钠溶液，维持pH在4.8～5.1范围内36小时，培养4天。姬松茸的富锌率为12.1％。
权利要求
1.一种姬松茸富锌液体培养的方法，其特征在于，a、斜面菌种培养取分离纯化的姬松茸菌种接种于斜面培养基中，放入培养箱，25℃培养，待菌丝长满斜面后，转入下一步培养；b、液体种子培养将培养好的斜面菌种接入液体种子培养基中，培养条件为24～28℃，摇床转速120～150转/分钟，培养6～10天；c、富锌发酵培养将培养好的液体种子按5～15％体积比的接种量转接入装有富锌发酵培养基的发酵罐中，24～28℃培养，搅拌速率90～130转每分钟，通风量1∶0.3～0.8v/v/m，培养3～5天，在富锌发酵培养过程中进行pH控制发酵，即起始pH为5.4～5.8，当发酵液pH下降到4.8～5.0时，补加碱性物质，控制发酵pH维持在4.8～5.1范围内24～48小时，得到富含有机锌的姬松茸发酵液。
2.根据权利要求1所述姬松茸富锌液体培养的方法，其特征在于，液体种子培养基为玉米粉10～30，蔗糖15～30，麸皮10～25，磷酸二氢钾0.8～2，硫酸镁0.5～1.5，维生素B10.08～0.1，单位为克/升，起始pH为自然pH；培养条件为24～28℃，摇床转速120～150转/分钟，培养6～10天。
3.根据权利要求1所述姬松茸富锌液体培养的方法，其特征在于，富锌发酵培养基为玉米粉10～30，蔗糖5～20，麸皮10～25，磷酸二氢钾1.5～3，硫酸镁1.0～2.5，维生素B10.08～0.1，棕榈酸1.8～2.5，硫酸锌0.15～0.5，单位为克/升。
4.根据权利要求1所述姬松茸富锌液体培养的方法，其特征在于，斜面培养基是土豆培养基。
5.根据权利要求1所述姬松茸富锌液体培养的方法，其特征在于，液体种子培养基体积与所用的放置于摇床上的摇瓶体积之比为1∶5。
6.根据权利要求1所述姬松茸富锌液体培养的方法，其特征在于，富锌发酵培养的发酵液体积与发酵罐体积之比为6～7∶10。
全文摘要
本发明涉及生物发酵领域，具体的说是一种通过液体深层发酵技术进行姬松茸富集微量元素锌的液体培养方法。本发明主要通过斜面菌种培养、液体种子培养、富锌发酵培养等三个步骤进行姬松茸富集微量元素锌的液体培养，在富锌发酵培养过程进行pH控制发酵，即起始pH为5.4～5.8，在发酵过程中补加碱性物质，控制发酵pH维持在4.8～5.1范围内24～48小时。本发明的优点在于通过对发酵过程进行pH控制，使姬松茸的富锌率大大提高，富锌率达到11.7～12.2％，从而使更多无机锌转变为有机锌；本发明更有利于发挥锌的免疫功能和姬松茸的抗肿瘤及其它疾病病功能，姬松茸富锌后，它的抗肿瘤活性得到进一步的提高；本发明为今后姬松茸富锌的工业化生产打下了坚实的基础。
文档编号A01H4/00GK1685810SQ20051003883
公开日2005年10月26日 申请日期2005年3月31日 优先权日2005年3月31日
发明者章克昌, 王玉红, 刘坤, 徐柔 申请人:章克昌