专利名称：黑脉羊肚菌菌株的筛选及菌种制备方法
技术领域：
本发明属微生物技术领域，具体涉及羊肚菌的菌株筛选及菌种制备方法。
背景技术：
羊肚菌Morchella是世界著名的名贵野生食用菌，黑脉羊肚菌Morchellaangusticeps是云南产羊肚菌的主要种类之一。羊肚菌的人工栽培小试偶有成功的报道，但栽培试验的重复性差，至今尚不能进行商业化栽培，市场上的羊肚菌均来自野生。近年来野生羊肚菌由于过度采集和采集方式不科学以及无相应的技术措施，造成自然产量大幅下降。研究表明，在产区自然环境条件下，采用人工菌种和配套的技术措施，是解决羊肚菌供需矛盾的最经济有效的途径之一。
在羊肚菌保护扩繁技术中，优良菌种的获得是关键技术环节。羊肚菌菌株的获得通常是利用子实体或孢子进行分离、纯化，直接应用于羊肚菌的栽培或菌丝体生产。现有技术的不足在于羊肚菌菌种不能用出菇的方法进行菌种鉴定，只能根据菌丝形态及分离物来初步确定是否为羊肚菌纯培养物；生产的菌种一般用固体菌种。目前在国内采用液体菌种进行羊肚菌资源的保护扩繁应用不广泛。
发明内容
本发明的主要目的就是克服现有技术不足，利用云南原产地黑脉羊肚菌子实体筛选出优良菌株，采用生物技术进行菌种鉴定，制备羊肚菌液体及固体优良菌种，为羊肚菌野生资源保护扩繁提供优良菌种。
本发明采用的真菌是黑脉羊肚菌Morchella angusticeps M39；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京.中关村；保藏日期2005年08月11日；保藏登记入册的编号CGMCCNO.1436。
黑脉羊肚菌子实体中等大，高6～12cm。子囊果呈锥形或近圆柱形，顶端尖，淡褐色至蛋壳色，棱纹黑色，纵向排列，由横脉交织，边缘与菌柄连接在一起。菌柄近圆柱形，乳白色，上部稍有颗粒，基部往往有凹槽。子囊近圆柱形，子囊孢子8个，单行排列。菌丝生长初期紧贴培养基，无色，有光泽，随着菌落的增大，有叉状或树枝状分支，后期产生菌核及色素。
本发明的技术方案①采集野生羊肚菌子实体；②组织分离或孢子分离；③纯化菌株及菌株鉴定；④生物学特性比较及生产性状比较；⑤确定优良菌株；⑥菌种生产及菌种应用；经过反复筛选，获得菌丝体产量高、抗污染的羊肚菌液体菌种专用菌株M39。
本发明真菌Morchella angusticeps培养方法(以下为重量百分比)菌种分离纯化培养基2％羊肚菌下脚料、0.001％VB1、2％葡萄糖、2％琼脂；羊肚菌菌株分离及鉴定方法1、将羊肚菌子实体组织块或孢子液接种到上述试管琼脂培养基斜面上，于18-24℃下培养5-10天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得羊肚菌分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于18-24℃下培养5-7天，获得羊肚菌纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的黑脉羊肚菌(Morchella.angusticeps)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析确定分离得到的纯培养物为黑脉羊肚菌菌丝体。
本发明羊肚菌菌种的制备方法分为液体培养和固体培养两种。
液体菌种制备方法液体培养基配方为5-10％麸皮、0.5-1％黄豆粉、0.5-1％麦芽糖、1-2％可溶性淀粉，余下为水，pH自然。
1、将羊肚菌的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18-24℃下培养5-7天，获得试管菌种。
2、将试管种接种到500ml三角瓶(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-26℃下摇床培养，转速为120-160r/min，培养时间5-7天。
3、将摇瓶菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1∶0.8v/(v·min)；搅拌转速为120-160r/min；接种量为5-10％；罐压0.04Mpa；pH为6.0；温度为22-26℃；通气培养72-96小时，获得羊肚菌液体菌种。
固体菌种制备方法固体培养基配方为木屑75-90％、麸皮5-20％、磷肥1％、石膏1％、羊肚菌生长地腐殖土3％，含水量60％、pH自然。
1、将羊肚菌的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18-24℃下培养5-7天，获得试管菌种。
2、将试管种接种到500ml三角瓶(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-26℃下摇床培养，转速为120-160r/min，培养时间5-7天。
3、采用前述固体培养基配方。将培养料混合后，加水拌均匀后，装入750ml的大口瓶中，压紧封口后在120℃灭菌60分钟，接入液体菌种，于22-26℃培养15-20天，直到菌丝长满。
具体实施例方式实施例一1、将黑脉羊肚菌子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于18℃下培养10天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得羊肚菌分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于18℃下培养7天，获得羊肚菌纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的黑脉羊肚菌(Morchella.angusticeps)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析确定分离得到的纯培养物为黑脉羊肚菌菌丝体。
4、将Morchella angusticeps M39的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，18℃下培养7天，获得试管种。
5、将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为5％麸皮、0.5％黄豆粉、0.5％麦芽糖、1％可溶性淀粉，余下为水，pH自然。于20℃下摇床培养，转速为120rpm，培养时间7天，获得一级液体菌种。
将一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1∶0.8v/(v·min)；搅拌转速为120r/min；接种量为5％；罐压0.04Mpa；pH为6.0；温度为22℃；通气培养96小时，获得羊肚菌液体菌种。
实施例二菌种制备的步骤与实施例一相同。
1、将黑脉羊肚菌子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于22℃下培养6天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得羊肚菌分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于22℃下培养6天，获得羊肚菌纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的黑脉羊肚菌(Morchella.angusticeps)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析确定分离得到的纯培养物为黑脉羊肚菌菌丝体。
4、将Morchella angusticeps M39的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，22℃下培养6天，获得试管种。
5、将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为6％麸皮、0.6％黄豆粉、0.6％麦芽糖、1.2％可溶性淀粉，余下为水，pH自然。于22℃下摇床培养，转速为140rpm，培养时间6天，获得一级液体菌种。
将一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1∶0.8v/(v·min)；搅拌转速为140r/min；接种量为8％；罐压0.04Mpa；pH为6.0；温度为24℃；通气培养84小时，获得羊肚菌液体菌种。
实施例三1、将黑脉羊肚菌子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于24℃下培养5天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得羊肚菌分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于24℃下培养5天，获得羊肚菌纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的黑脉羊肚菌(Morchella.angusticeps)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析确定分离得到的纯培养物为黑脉羊肚菌菌丝体。
4、将Morchella angusticeps M39的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，24℃下培养5天，获得试管种。
5、将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为10％麸皮、0.5％黄豆粉、0.5％麦芽糖、1％可溶性淀粉，余下为水，pH自然。于26℃下摇床培养，转速为160rpm，培养时间5天，获得一级液体菌种。
将一级液体菌种接种到固体培养基上，培养基配方为木屑75％、麸皮20％、磷肥1％、石膏1％、羊肚菌生长地腐殖土3％，含水量60％、pH自然。将木屑、麸皮、磷肥、石膏、腐殖土按比例称量后混合均匀，加水拌匀后装入750ml的菌种瓶中，每瓶装500ml，120℃灭菌60分钟后，接种后置于26℃培养15天，获得羊肚菌固体菌种。
实施例四1、将黑脉羊肚菌子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于24℃下培养5天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得羊肚菌分离试管种。
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于24℃下培养5天，获得羊肚菌纯化试管种。
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的黑脉羊肚菌(Morchella.angusticeps)Identities＝499/510(97％)，Gaps＝2/510(0％)，分析确定分离得到的纯培养物为黑脉羊肚菌菌丝体。
4、将Morchella angusticeps M39的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，24℃下培养5天，获得试管种。
5、将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装200m1)液体培养基中，培养基配方为8％麸皮、0.5％黄豆粉、1％麦芽糖、1％可溶性淀粉，余下为水，pH自然。于26℃下摇床培养，转速为160rpm，培养时间5天，获得一级液体菌种。
将一级液体菌种接种到固体培养基上，培养基配方为木屑90％、麸皮5％、磷肥1％、石膏1％、羊肚菌生长地腐殖土3％，含水量60％、pH自然。将木屑、麸皮、磷肥、石膏、腐殖土按比例称量后混合均匀，加水拌匀后装入750ml的菌种瓶中，每瓶装500ml，120℃灭菌60分钟后，接种后置于20℃培养20天，获得羊肚菌固体菌种。
权利要求
1.一种黑脉羊肚菌菌株，其特征在于所述菌株为(Morchella angusticeps)M39，该菌株的保藏号为CGMCC NO.1436。
2.根据权利要求1所述的黑脉羊肚菌菌株的制备方法，所述菌株是经过常规的液体和固体发酵培养获得的，其特征在于所述液体和固体发酵培养基配方如下(1)液体培养基配方为5-10％麸皮、0.5-1％黄豆粉、0.5-1％麦芽糖、1-2％可溶性淀粉，余下为水，pH自然；(2)固体培养基配方为木屑75-90％、麸皮5-20％、磷肥1％、石膏1％、羊肚菌生长地腐殖土3％，含水量60％、pH自然。
全文摘要
本发明涉及一种黑脉羊肚菌菌株的筛选及菌种制备方法，属于微生物技术领域。本发明的菌株Morchella angusticeps M39已于2005年08月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.1436。利用该菌株制备的液体及固体优良菌种，应用于羊肚菌野生资源原产地的保护扩繁，提高羊肚菌的自然产量及品质，有着显著的社会、经济、生态效益和广阔的应用前景。
文档编号A01G1/04GK1793316SQ200510048680
公开日2006年6月28日 申请日期2005年12月8日 优先权日2005年12月8日
发明者桂明英, 刘蓓, 朱萍, 郭永红 申请人:云南菌苑科技有限公司, 云南省供销合作社科学研究所