专利名称：草坪草生物技术育种平台的制作方法
技术领域：
本发明涉及草坪草生物技术育种与常规育种手段相结合从而实现快速高效育种的一套技术平台。
背景技术：
草产业在我国是“朝阳产业”，起步晚但是发展迅速；而草坪业的发展是草业的一个重要方面，在城市绿化、环境建设与运动场草坪建设中起着重要的作用。我国的草业育种工作远远落后于国外发达国家；草坪所需的草种基本上都是依赖于进口，国家每年为此花费大量外汇。在国外，诸如美国、新西兰、荷兰等，将草坪业的发展与草坪草育种紧密地联系起来，其育种手段以传统育种为基础，将新发展的生物技术应用于其中，以求获得期望的优良草坪草单倍体植株和具有特定外源目的基因的栽培品系，因而每年都能为世界各地提供一批优良的草坪草新品种或品系。
我国野生草坪草种质资源丰富，草种的抗逆性、抗病力在我国的气候条件下明显优于国外品种。在草坪草育种工作方面，我国的李俊龙等对多花黑麦草和苇状羊茅进行属间杂交，获得属间杂种，并提出利用苇状羊茅的抗热性能改变多花黑麦草的抗旱、耐热性能的可能性。张新全等进行坪用黑麦草‘Derby’和高羊茅‘Houndog’的属间杂交，未经胚培养就获得杂种，并从染色体配对表明，‘Derby’和‘Houndog’染色体间存在一定程度的亲缘关系，这进一步证明对高羊茅和黑麦草的属间杂交改良是完全可行的。同时，新发展的组培技术和体细胞融合技术也为草坪草育种提供了另一可能成功的途径。陈文品等将苇状羊茅12日龄幼胚接种到MS+3mg/L 2，4-D培养基上，28d后形成愈伤组织，并在这些愈伤组织中成功地诱导出一块能分化长成具幼叶和根毛的植株。支月娥等以高羊茅为对象研究其组织培养条件，结果发现，以MS附带一定浓度的BA和2，4-D的培养基对高羊茅愈伤组织有很高的诱导率。朱根发等以草地早熟禾的幼穗和胚轴为外植体诱导和分化愈伤组织，发现用幼穗作外植体的适宜长度为0.5～1.0cm，适宜的2，4-D浓度为1mg/L以下；培养基中添加1.5mg/L生物素或将KH2PO4浓度提高到400mg/L，可能对草地早熟禾胚性愈伤组织的诱导和筛选有一定作用。马忠华等以早熟禾种子成熟胚为外植体，进行愈伤组织诱导和分化，发现3mg/L和0.1mg/L 2，4-D是早熟禾诱导愈伤组织和分化愈伤组织成苗的最佳浓度组合。Kuo等用含1～5mg/L 2，4-D MS基本培养基诱导钝叶草，用0.25mg/L 2，4-D+0.5mg/L KT的MS培养基分化钝叶草，14h/10h的光周期，分化率为33％，最后在1/2MS无激素培养基中分化长根情况良好。Lee Hyoshin等利用鸭茅属的鸡脚草(Dactylis glomerata)的成熟胚诱导培养出愈伤组织并分化得到再生植株。Chaudhury等发现，用0.044mmol/L的6-BA对杂交狗牙根“Tifgreen”(Cynodon dactylon×Cynodon transvaalensis)和一个普通种狗牙根“Savannah”(Cynodon dactylon)的幼花序作外植体，诱导出致密、结节状胚胎发生结构，然后再分化效果甚佳。
以上这些实验说明了草坪草愈伤组织可由种子、幼穗、幼花序等诱导产生，但是产生率很低。本发明正是针对生物技术育种中愈伤组织材料供应的紧缺而提出的以悬浮细胞系与体细胞胚体系的建立来确保优良愈伤细胞与愈伤组织的供应。同时，应用悬浮细胞系进行育种与筛选，避免了在其他受体的诱导育种、辐射育种、基因工程育种中嵌合体的存在。
发明内容
通过草坪草种子、幼穗、茎尖或根尖、幼花序诱导的愈伤组织细胞进行培养获得草坪草悬浮细胞体系。在悬浮细胞体系的基础上进一步诱导培养草坪草体细胞胚，建立草坪草体细胞胚培养体系。本发明建立悬浮细胞系的目的是可以快速获得来源于同一细胞的众多克隆，为快速育种提供充足的遗传背景一致的材料。所有育种操作方式即可以此悬浮细胞系或体细胞胚为受体材料。具体可用育种手段分别如下1.诱导育种利用悬浮细胞系和体细胞胚的高变异特性，通过对悬浮细胞系或体细胞胚施加相应的诱导选择压，稳定与我们育种目标相一致的变异类型，并通过悬浮培养的高增殖速率达到扩繁的目的。
2.辐射育种将悬浮细胞或体细胞胚直接采用一定频率与强度的射线进行照射，对照射后的细胞进行继续培养。
3.倍性育种在悬浮细胞系中施加秋水仙素等抑制剂抑制细胞的分裂，将细胞停留在染色体加倍阶段。从而获得染色体倍性增加的细胞。
4.体细胞杂交通过纤维素酶、果胶酶等消化去除细胞壁，得到原生质体，进行原生质体培养和细胞融合得到杂交细胞。再经过细胞壁再生形成悬浮细胞系。
5.基因工程通过导入外源基因获得遗传性状改良的新细胞系。
通过草坪草悬浮细胞系或体细胞胚体系的分化培养，获得再生小植株或小胚芽，再进一步固定培养，得到再生植株。
具体实施例方式
1.结缕草成熟胚愈伤组织的诱导及改造种子置于离心管中，加入1-2滴表面活性剂吐温，然后加次氯酸钠至离心管体积的四分之三左右，放置在90-1双向磁力搅拌器上搅拌1小时，用无菌水冲洗3-5次，置于4℃冰箱中放置2-3天，每天及时更换无菌水。接种前再用次氯酸钠消毒20分钟，然后用无菌水冲洗3-5次，以备接种。
消毒处理过的种子接种在MS2培养基上，28℃黑暗培养，接种10天后进行拔芽。接种4周后对诱导出的愈伤进行继代，此时愈伤多为水状，不适合挑选。将其接种到筛选培养基，培养两个月以后，愈伤生长状态有所改善，但此时愈伤仍多为非胚性愈伤，对其进行分块，继代。培养三个月，进行愈伤挑选。此时的愈伤组织可分为三种I为质地坚硬、块状、颜色鲜黄的胚性愈伤组织，即通常所说的胚性愈伤组织。II为质地疏松、易分散、不分泌黏液的颗粒状胚性愈伤组织。III为柔软、水渍、形状不规则、颜色淡白的非胚性愈伤组织。弃掉愈伤III，保留愈伤I和II继续培养，II型愈伤为适合悬浮培养的愈伤。对I型愈伤继续进行改良，缩短继代周期，每20天左右继代一次，将其逐渐改良为II型愈伤。
将II型愈伤接种于MS2液体培养基中。置于转速为90-110r/min的全温震荡培养箱(型号为HZQ-F)中，黑暗条件下振荡培养，温度控制在27℃左右。进行悬浮培养每3-4天换一次培养液。每次继代时条件培养基与新鲜培养基的比例为1∶2。待培养1月左右，每5-6天继代一次，此时对条件培养基与新鲜培养基比例没有特别要求。
2.体细胞胚的诱导在悬浮体系建立的基础上，在继代过程中调整培养基配方，基本上用MS2液体培养基作为主导培养基，在其中每月用MS2+BA0.1进行1-2次穿插培养，提高细胞分裂能力，保持其胚性。悬浮物颜色淡黄、培养液较澄清、愈伤为颗粒状且大小均匀。采用固体预培养和直接再生分化的途径来诱导愈伤分化。并调整琼脂浓度、培养基中大量元素的含量、蔗糖的浓度等来改变渗透势，让其尽快适应从液体到固体的环境转变，提高再生频率。同时在MS基本再生培养基的基础上添加不同的细胞分裂素来观察其对再生的影响，在此基础上确立最佳分化、再生培养基。
随着悬浮继代时间的延长，在继代过程中用加细胞分裂素的液体培养基进行继代，如(MS2+BA0.1，MS2+KT0.2)调整培养体系的生长状态，并在一定程度上加强了其细胞同步化，促进了细胞再生。体系中的悬浮物逐渐由原来松散的大颗粒变成颗粒状的小块愈伤，大小均一，颜色淡黄，此时状态为适合再生。此种状态下的体细胞胚性较高。
权利要求
1.草坪草生物技术育种平台，包括以下技术体系(1)愈伤组织的诱导；(2)悬浮细胞体系的建立；(3)体细胞胚体系的建立；(4)胚性细胞的芽再生诱导；(5)再生芽的生长与分化培养；(6)再生植株的生根培养；(7)植物辐射育种、诱导育种、倍性育种与基因工程育种。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于本育种平台应用于草坪草，草坪草是指能够形成草皮或草坪的禾本科植物。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，愈伤组织的诱导由种子、幼穗、根尖或茎尖、幼叶经脱分化诱导培养产生。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，悬浮细胞体系由经脱分化产生的愈伤组织经过液体振荡培养或过筛后振荡培养产生。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，体细胞胚由悬浮细胞经过诱导培养产生；
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，再生芽由体细胞胚经过进一步的分化产生；
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，再生芽的生长与分化是进行快速繁殖与壮苗形成小植株的过程。。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，再生植株经过诱导可以形成自己的根系。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，辐射育种、诱导育种、倍性育种与基因工程育种手段可以应用于本平台的悬浮细胞体系或体细胞胚体系，从而大大提高育种效率。
全文摘要
本发明涉及草坪草生物技术育种与常规育种手段相结合从而实现快速高效育种的一套技术平台。本发明通过建立草坪草悬浮细胞体系来解决禾本科植物愈伤组织再生困难，生物技术育种中受体材料不足或受体遗传背景不一致的问题。通过草坪草种子、幼穗、幼花序、幼根等诱导愈伤，获得可悬浮培养的细胞材料，并诱导形成体细胞胚及再生植株。通过悬浮培养的简并操作获得大量生物技术育种材料；结合诱导育种、辐射育种、倍性育种、细胞杂交、基因工程育种等手段，并利用其高变异性，大大加快育种速率。本平台应用于草坪草育种，可与常规育种手段以及现代生物技术育种手段相结合，推动草坪草育种进度。
文档编号A01G1/00GK1663347SQ20051006787
公开日2005年9月7日 申请日期2005年4月29日 优先权日2005年4月29日
发明者曾会明, 韩烈保, 方文娟 申请人:北京林业大学, 韩烈保, 曾会明