专利名称：一种添加苦瓜的鸡腿蘑液体发酵工艺及发酵产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵领域，具体的说本发明涉及一种添加苦瓜的鸡腿磨液体深层发酵工艺，该工艺包括以鸡腿蘑为出发菌株，进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和添加苦瓜的发酵培养。本发明还涉及由该工艺制备的添加了苦瓜的鸡腿蘑深层发酵液。本发明的工艺解决了鸡腿蘑大规模液体培养的难题，大大提高了发酵液的活性，对于鸡腿蘑的产业开发具有重要的意义。
背景技术：
鸡腿蘑(Coprinus comatus)，又名鸡腿菇、毛头鬼伞，其肉质细嫩，鲜美可口。鸡腿蘑还含有20种氨基酸，其中包括8种人体必需的氨基酸。经常食用有助于消化、增加食欲和治疗痔疮的作用。我国传统医学对其药性有过不少记载“甘、平、无毒”，“主小儿寒热痫”(《别录》)，“和醋敷肿毒、恶疮”(《本草拾遗》)。
据载，鸡腿蘑热水提取物对小白鼠肉瘤180和艾氏癌抑制率分别为100％和90％。另据阿斯顿大学报道，鸡腿蘑含有治疗糖尿病的有效成分，能明显降低血糖浓度，是糖尿病人食疗选择的理想菇种。
鸡腿蘑发展潜力很大，已被确定为联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)要求的新的菌类进行推广。鸡腿蘑在我国的发展很快，目前已初具规模，前景十分广阔。
从60年代起，德国、捷克斯洛伐克和英国的食用菌研究人员就开始了鸡腿蘑的驯化工作。近年荷兰、法国等相继栽培成功。目前一些国家已开始大规模商业化栽培。根据已掌握的资料，目前国外对鸡腿蘑的研究主要集中在几个方面①对于环境的意义，它可富集环境中的铅，因此可作为环境污染的指示植物，它还可以将环境中的汞甲基化，减少汞的危害；②环境中散布的鸡腿蘑和过敏症及哮喘病的关系；③鸡腿蘑的酒精提取液对肝损坏的抑制作用，以及鸡腿蘑的子实体和菌丝体的提取液抗诱变的作用；④鸡腿蘑是纤维素酶的良好来源，它所分泌的纤维素酶活力较高。此外，国外有学者研究利用鸡腿蘑来转化生产利福霉素。
近些年国内对鸡腿蘑的研究主要集中于它的驯化栽培、营养成分分析等方面，对于鸡腿蘑的液体培养国内也有研究和报道。由于鸡腿蘑多糖的医疗功效，一些学者从培养基、培养条件和糖类等营养因子对鸡腿蘑胞外多糖的影响进行了深入的研究，但未见有关大规模鸡腿蘑深层发酵的报道，而在鸡腿蘑发酵培养基中添加中药也未见报道。
对于鸡腿蘑的降血糖功能，山东大学的王玉萍等进行了富铬鸡腿蘑菌丝体发酵液降血糖作用的研究，证明了其发酵液开发成预防和治疗糖尿病的保健品和(或)药品的可能性；韩春超等人进行了鸡腿蘑发酵液与钒酸钠协同抑制小鼠血糖升高作用的研究，结果表明，鸡腿蘑钒酸钠溶液能抑制小鼠血糖的升高。
苦瓜(Momordica charantia L.；Bitter Melon)别名锦荔枝、癞葡萄、凉瓜、红羊，是葫芦科苦瓜属蔓性一年生蔬菜，喜温怕寒，在我国南方栽培历史悠久。苦瓜营养价值高，嫩果中含有丰富的矿物质、氨基酸和多种维生素。此外，苦瓜也是一种传统的中药材，关于苦瓜的记载最早始于明代《滇南本草》，以后又有许多记载。《本草纲目》曰“去邪热，解劳乏，清心明目。”苦瓜性苦寒，具有清热解毒，滋养强壮等功效。
目前，鸡腿蘑主要以子实体的形式在市场上销售，而有关鸡腿蘑的保健品也只局限于其子实体粉末。而目前也尚无添加苦瓜的鸡腿磨大规模液体深层发酵工艺方面的论文和专利报道。
本发明人经过深入的研究提供了一种鸡腿蘑大规模深层发酵工艺，以及由该工艺获得的鸡腿蘑发酵液，该发酵液在药物和/保健品的制备方面具有广阔的前景，例如可用于制备预防和治疗糖尿病、癌症等疾病的药物和/或保健品，特别适用于制备预防和/或治疗糖尿病的药物和/或保健品。
发明内容
本发明的目的是提供了一种鸡腿蘑大规模液体深层发酵工艺，其特征是在所述的发酵工艺中添加了中药苦瓜。
本发明的液体深层发酵工艺包括以鸡腿蘑为出发菌株，进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和发酵培养，其特征在于在所述的一级种子培养和发酵培养中添加了苦瓜物质，所述的苦瓜物质是由普通的苦瓜经过预处理后获得的。
具体地，在本发明添加苦瓜的鸡腿磨深层发酵工艺中，所述摇瓶培养的培养基组成为(单位为克/升)葡萄糖15～35，玉米粉10～20，麸皮5～10，酵母膏1～4，玉米浆2～5，KH2PO4 2～4，MgSO4 3～6，加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0；摇瓶培养的培养条件是培养温度22～30℃，转速120～160转/分钟，培养时间120～140小时。
本发明添加苦瓜的鸡腿磨深层发酵工艺中，所述扩大培养的培养基组成为(单位为克/升)葡萄糖15～35，玉米粉10～20，麸皮5～10，KH2PO4 2～4，MgSO4 3～6，加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0；扩大培养的培养条件是接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，转速120～160转/分钟，培养时间90～96小时。
本发明添加苦瓜的鸡腿磨深层发酵工艺中，所述一级种子培养的培养基组成为(单位为克/升)葡萄糖15～30，玉米粉15～25，麸皮5～10，苦瓜物质0～7.5，KH2PO4 2～4，MgSO4 1～3，加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0；一级种子培养的培养条件是接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间80～90小时。
本发明添加苦瓜的鸡腿磨深层发酵工艺中，所述发酵培养的培养基组成为(单位为克/升)葡萄糖10～20，玉米粉10～20，麸皮5～10，苦瓜物质5～20，KH2PO4 2～4，MgSO4 1～3，加水至适当体积，pH值为6.0～7.0；发酵培养的培养条件是接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～125转/分钟，通风量1∶0.3～0.8v/v/m，培养时间90～120小时。
由本发明添加苦瓜的鸡腿磨深层发酵工艺所得到的发酵液的菌丝体干重可达7～10克每升，对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率可达93～98％。
蛋白质非酶糖基化是指葡萄糖与蛋白质的游离氨基酸进行的一系列非酶促反应，它是糖尿病患者体内的一种非正常的生理生化反应，最终形成糖基化末端产物(advanced end-products，AGEs)，造成蛋白质结构改变、功能降低和老化，引起糖尿病慢性并发症。而糖尿病慢性并发症是糖尿病患者致残和死亡的主要原因。因此，非酶糖基化(AGEs)的抑制率可作为糖尿病治疗效果的指示参数之一。
在本发明的鸡腿磨深层发酵工艺中，苦瓜的添加量对鸡腿蘑的发酵有一定的影响。当苦瓜添加量过大时会抑制鸡腿蘑的生长，从而抑制了有效物质的产生；当添加量适中时可以促进鸡腿蘑有效物质的产生。但具体的影响机理还需要进一步研究。以发酵培养阶段为例，当培养基中苦瓜的添加量小于5克/升克/升时对发酵基本没有影响，而当培养基中苦瓜的添加量大于20克/升时则会抑制鸡腿蘑的生长，从而也会影响到发酵液的功效。因此，在发酵培养阶段，苦瓜物质的添加量以5～20克/升为宜，优选7.5-12.5克/升。
本发明添加苦瓜的鸡腿磨深层发酵工艺中，所述发酵培养工艺适于在500～2000L的发酵罐中进行发酵。
更具体地，本发明的发酵工艺通过以下步骤来实现(1)取出鸡腿蘑菌种的斜面菌种接入新配制的斜面培养基中，培养温度22～30度，培养时间140～240小时；(2)将步骤1中的斜面菌种转接入装有上述摇瓶培养基的三角瓶中，22～30度培养，转速120～160转每分钟，培养时间120～140小时，然后进行摇瓶扩大培养；(3)将步骤2中的摇瓶菌种按5～10％的接种量转接入装有上述摇瓶扩大培养基的三角瓶中进行扩大培养，22～30℃培养，转速120～160转每分钟，90～96小时后转接入一级种子罐进行培养；(4)将步骤3中的摇瓶菌种按5～10％的接种量转接入装有上述一级种子培养基的种子罐中，22～30℃培养，种子罐压力0.05Mpa，搅拌速率90～150转每分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养80～90小时后接入发酵罐进行发酵；和(5)将种子罐中的菌种按5～10％的接种量转接入装有上述发酵培养基的发酵罐中，22～30℃培养，发酵罐压力0.05Mpa，搅拌速率90～125转每分钟，通风量1∶0.3～0.8v/v/m，培养90～120小时。
其中所述的斜面培养基配方为土豆培养基，该培养基在多种教科书和论文中均有表述，这里不再详细列出其组成；所述的摇瓶培养基、一级种子培养基和发酵培养基如上文所述。
本发明所使用的鸡腿蘑菌种可选用任意一种鸡腿蘑菌种，例如可购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)的CGMCCNo.5.156，CGMCC No.5.252和CGMCC No.5.258。
本发明步骤2中的摇瓶培养基与三角瓶容积之比可以是3∶10左右。
本发明步骤3中的扩大培养基与三角瓶容积之比可以是3∶10左右。
当本发明步骤4中的一级种子罐的容积为50～100L时，其中装有的一级种子培养基的量相应为30～70L。
当本发明步骤5中的发酵罐的容积为500～2000L时，其中装有的发酵培养基的量相应为300～1400L。
本发明的工艺适于在500～2000L的发酵罐规模进行的发酵培养工艺，结合本领域的基本知识可以进一步根据生产需要扩大发酵规模。
本发明一级种子培养和发酵培养中所使用的苦瓜物质由普通苦瓜经过预处理后获得，其可以是固体，或者是浆状物的形式。所述的苦瓜物质可通过下述二种预处理方法制备(1)将苦瓜切片去籽，在60℃左右烘干后粉碎，得到苦瓜的干物质；或(2)将苦瓜去籽后打碎匀浆，得到苦瓜的浆状物。
所得到的苦瓜干物质和浆状物均可直接由于发酵工艺，当以浆状物的形式使用时，其使用量按相应的干物质重量计算。
本发明的另一目的是提供了一种由本发明的鸡腿蘑深层发酵工艺制备的鸡腿蘑深层发酵液，以及由该发酵液制备的固体产品和其它形式的产品，例如发酵液的上清液，或上清液的浓缩物等。该产品的特征是在所述产品的发酵工艺中添加了中药苦瓜。所述的苦瓜以本发明特定的苦瓜物质的形式加入，所述苦瓜物质是由前文所述方法制备的。
本发明的鸡腿蘑发酵液为淡黄色到棕色的，有一定粘度的液体，其中的菌丝体为淡黄色，菌丝体的干重可达7～10克每升，该发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率高达93％以上，例如可以达到93％～98％。本发明的鸡腿蘑固体发酵产品是从淡黄色到棕褐色的固体。所述的固体发酵产品是由发酵液经过下述方法获得将发酵液离心分离，在固形物(主要为菌丝)中加水，高压破碎，均质，然后冷冻干燥获得发酵液的固体产物。
本发明鸡腿蘑发酵液的上清液可以通过将发酵液离心分离获得。上清液的浓缩物可以通过将上清液浓缩至一定的体积后获得。
本发明的各种鸡腿蘑深层发酵产品均可用于制备预防和/或治疗糖尿病、癌症等疾病的药物和/或保健品，特别适用于制备预防和/或治疗糖尿病的药物和/或保健品。
本发明的发酵工艺解决了鸡腿蘑大规模液体培养的难题，同时由于在发酵培养基中加入中药苦瓜，在发酵过程中鸡腿蘑与苦瓜之间发生生物转化，大大提高了发酵液的活性，使鸡腿蘑发酵产品更具有实际应用价值。通常，单纯鸡腿蘑发酵液其体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率仅为65～70％，而本发明添加了苦瓜的鸡腿磨发酵液的体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率可达到93％以上。因此，本发明的产品和方法对于鸡腿蘑的产业开发具有重要的意义，同时也为中药的开发提供了一种新的途径。
本发明的另一目的是提供了本发明添加苦瓜的鸡腿磨深层发酵液的应用，根据鸡腿蘑已经公开的性能，可以将所述的发酵液制成具有相应功能的药物和/或保健品。例如，可将该发酵液应用于预防和/或治疗糖尿病的药物和/或保健品的制备，或将其应用于预防和/或治疗癌症的药物和/或保健品的制备。以上所述的药物和/或保健品可以以液体和/或固体的形式存在，可以制备成口服液，口服胶囊、口服片剂、肌肉注射和/或固体静脉注射的针剂。
在将本发明的发酵液由于制备任一药物和/或保健品时，其制备方法和/或制备中所用的辅料可采用药物和/或保健品制备领域中常规的的方法和材料，制成常规的药物和/或保健品形式。
具体实施例方式
为了进一步阐述本技术所涉材料及施工工艺，给出了下述实施例。但是，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。
制备实施例1苦瓜固体干粉的制备将新鲜苦瓜切片去籽，在60℃左右烘干后粉碎，过40目筛，得到苦瓜干粉。使用时直接以干粉的形式添加。
制备实施例2苦瓜浆状物的制备将新鲜苦瓜去籽后用组织捣碎机打碎匀浆，使用前测定其干物质含量，添加时按与其相当的干物质重量计算。
实施例1鸡腿蘑发酵液的制备在新鲜的斜面培养基中接入鸡腿蘑菌丝体，鸡腿蘑菌种是CGMCCNo.5.252(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，培养温度25.5℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共5瓶)，于25.5℃、150转/分钟摇床培养130小时。其中所述摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖25，玉米粉15，麸皮7.5，酵母膏3，玉米浆3，KH2PO4 3，MgSO4 4，起始pH值为6.3。
将上述摇瓶菌种接入装有150mL扩大培养基的500mL三角瓶中(共24瓶)，接种量为每500mL三角瓶接入11mL摇瓶种子，于25.5℃、150转/分钟摇床培养93小时。其中所述扩大培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖20，玉米粉15，麸皮8，KH2PO4 3，MgSO4 4.5，起始pH值为6.3。
将上述扩大培养的菌种3600mL接入装有44.9L一级种子培养基的75L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为48.5L；维持罐温25.5℃，罐压0.05MPa，搅拌速率120转每分钟，通风量1∶0.6 v/v/m，发酵时间85小时。其中种子罐中的一级种子培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖20，玉米粉20，麸皮8，KH2PO4 3，MgSO4 2，起始pH值为6.3。
然后将48.5L一级种子菌种接入装有600L发酵培养基的1000L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为648.5L。维持罐温25.5℃，罐压0.05MPa，搅拌速率100转每分钟，通风量1∶0.5 v/v/m，发酵时间96小时。其中发酵罐中的发酵培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖15，玉米粉15，麸皮7.5，苦瓜固体干粉12.5，KH2PO4 3，MgSO4 2，起始pH值为6.4。
最终获得的发酵液菌丝体的干重为9克/升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达96.7％。
发酵液菌丝体干重和发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的测试方法如下发酵液菌丝体干重的测定方法取100ml发酵液，离心(3000r/min)20分钟，沉淀物用水洗涤3次，收集菌丝体，于60℃烘干至恒重，称重后得菌丝体干重。
发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的测定方法1]体外非酶糖基化系统将BSA(牛血清白蛋白)(10mg/mL)、己二醛(12mg/mL)和NaN3(叠氮化钠)(2mg/mL)溶于pH7.4、0.2mol/L的PBS(磷酸缓冲液)中。
2]体外非酶糖基化发酵液干预实验取1ml上述PBS溶液，干预组加入1ml发酵液、以加1ml蒸馏水的未干预组为空白，震荡混匀，37℃避光孵育15天，而后定容至10ml待测。
3]AGEs的测定及抑制率的计算采用Hitachi Fluorescence Spectrophotometer 650-60型荧光分光光度计，激发波长370nm，狭长5nm，发射波长440nm，狭长6nm。
发酵液对非酶糖基化反应的抑制作用以抑制率表示，计算公式如下 实施例2鸡腿蘑发酵液的制备此实施例所用的菌种与实施例1相同。
在新鲜的斜面培养基中接入鸡腿蘑菌丝体，培养温度22℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共3瓶)，22℃、120转每分钟摇床培养140小时。然后将此摇瓶菌种接入装有150mL扩大培养基的500mL三角瓶中(共10瓶)，接种量为每500mL三角瓶接入15mL摇瓶种子，22℃、120转每分钟摇床培养96小时。然后将此扩大培养的菌种1500mL接入装有28.5L一级种子培养基的50L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为30L；维持罐温22℃，罐压0.05MPa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶1 v/v/m，发酵时间90小时。最后将30L一级种子菌种接入装有320L发酵培养基的500L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为350L；维持罐温22℃，罐压0.05MPa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶0.8 v/v/m，发酵时间120小时。
由上述方法获得的发酵液菌丝体的干重为7.5克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达93.0％。
本实施例使用的各种培养基的配方如下摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖15，玉米粉10，麸皮5，酵母膏1，玉米浆2，KH2PO4 2，MgSO4 3，起始pH值为5.8。
扩大培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖15，玉米粉10，麸皮5，KH2PO4 2，MgSO4 3，起始pH值为5.8。
一级种子培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖15，玉米粉15，麸皮5，KH2PO4 2，MgSO4 1，起始pH值为5.8。
发酵培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖10，玉米粉10，麸皮5，苦瓜固体干粉5，KH2PO4 2，MgSO4 1，起始pH值为6.0。
发酵液菌丝体干重和发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的测试方法同实施例1。
实施例3鸡腿蘑发酵液的制备此实施例所用的菌种与实施例1相同。
在新鲜的斜面培养基中接入鸡腿蘑菌丝体，培养温度30℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共3瓶)，30℃、160转每分钟摇床培养120小时。然后将此摇瓶菌种接入装有300mL扩大培养基的1000mL三角瓶中(共12瓶)，接种量为每1000mL三角瓶接入15mL摇瓶种子，30℃、160转每分钟摇床培养90小时。然后将此扩大培养的菌种3600mL接入装有66.4L一级种子培养基的100L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为70L；维持罐温30℃，罐压0.05MPa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶0.3v/v/m，发酵时间80小时。最后将70L一级种子菌种接入装有1330L发酵培养基的2000L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为1400L；维持罐温30℃，罐压0.05MPa，搅拌速率125转每分钟，通风量1∶0.3v/v/m，发酵时间90小时。
由上述方法获得的发酵液菌丝体的干重为7.0克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达94.0％。
本实施例中所使用的各种培养基的配方如下摇瓶培养基的配方为(单位为克每升)葡萄糖35，玉米粉20，麸皮10，酵母膏4，玉米浆5，KH2PO4 4，MgSO4 6，起始pH值为7.0。
扩大培养基的配方为(单位为克每升)葡萄糖35，玉米粉10，麸皮10，KH2PO4 4，MgSO4 6，起始pH值为7.0。
一级种子培养基的配方为(单位为克每升)葡萄糖30，玉米粉25，麸皮10，苦瓜固体干粉7.5，KH2PO4 4，MgSO4 3，起始pH值为7.0。
发酵培养基的配方为(单位为克每升)葡萄糖20，玉米粉20，麸皮10，苦瓜固体干粉20，KH2PO4 4，MgSO4 3，起始pH值为6.7。
发酵液菌丝体干重和发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的测试方法同实施例1。
实施例4鸡腿蘑发酵液的制备此实施例所用的菌种与实施例1相同。
在新鲜的斜面培养基中接入鸡腿蘑菌丝体，培养温度26℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共4瓶)，26℃、150转每分钟摇床培养136小时。然后将此摇瓶菌种接入装有300mL扩大培养基的1000mL三角瓶中(共18瓶)，接种量为每1000mL三角瓶接入24mL摇瓶种子，26℃、150转每分钟摇床培养94小时。然后将此扩大培养的菌种5.25L接入装有47.25L一级种子培养基的75L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为52.5L；维持罐温26℃，罐压0.05MPa，搅拌速率125转每分钟，通风量1∶0.5 v/v/m，发酵时间80小时。最后将52.5L一级种子菌种接入装有547.5L发酵培养基的1000L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为600L；维持罐温26℃，罐压0.05MPa，搅拌速率100转每分钟，通风量1∶0.5 v/v/m，发酵时间108小时。
由上述方法获得的发酵液菌丝体的干重为10.0克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达98.0％。
本实施例中所使用的各种培养基的配方如下摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖25，玉米粉20，麸皮10，酵母膏2，玉米浆4，KH2PO4 3，MgSO4 3，起始pH值为6.0。
扩大培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖20，玉米粉20，麸皮5，KH2PO4 3，MgSO4 4，起始pH值为6.0。
一级种子培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖20，玉米粉20，麸皮5，苦瓜固体干粉3，KH2PO4 2，MgSO4 3，起始pH值为6.5。
发酵培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖20，玉米粉20，麸皮5，苦瓜浆状物10，KH2PO4 2，MgSO4 2，起始pH值为6.5。
发酵液菌丝体干重和发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的测试方法同实施例1。
实施例5鸡腿蘑发酵液的制备此实施例所用的菌种与实施例1相同。
在新鲜的斜面培养基中接入鸡腿蘑菌丝体，培养温度28℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共3瓶)，28℃、135转每分钟摇床培养128小时。然后将此摇瓶菌种接入装有150mL扩大培养基的500mL三角瓶中(共10瓶)，接种量为每500mL三角瓶接入15mL摇瓶种子，28℃、140转每分钟摇床培养92小时。然后将此扩大培养的菌种1500mL接入装有28.5L一级种子培养基的50L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为30L；维持罐温28℃，罐压0.05MPa，搅拌速率130转每分钟，通风量1∶0.4v/v/m，发酵时间84小时。最后将30L一级种子菌种接入装有270L发酵培养基的500L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为300L；维持罐温28℃，罐压0.05MPa，搅拌速率120转每分钟，通风量1∶0.35 v/v/m，发酵时间96小时。
由上述方法获得的发酵液菌丝体的干重为9.1克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达96.8％。
本实施例中所使用的各种培养基的配方如下摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖15，玉米粉18，麸皮10，酵母膏4，玉米浆3，KH2PO4 3，MgSO4 5，起始pH值为6.8。
扩大培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖30，玉米粉12，麸皮7，KH2PO4 3.5，MgSO4 5，起始pH值为6.2。
一级种子培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖28，玉米粉22，麸皮9，，KH2PO4 3.5，MgSO4 1.5，起始pH值为6.4。
发酵培养基的配方为(单位为克/升)葡萄糖18，玉米粉18，麸皮5，苦瓜浆状物12.5，KH2PO4 2.5，MgSO4 1.5，起始pH值为6.8。
发酵液菌丝体干重和发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的测试方法同实施例1。
实施例6鸡腿蘑发酵液的制备此实施例所用的菌种与实施例1相同。
在新鲜的斜面培养基中接入鸡腿蘑菌丝体，培养温度28℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共5瓶)，26℃、130转每分钟摇床培养132小时。然后将此摇瓶菌种接入装有300mL扩大培养基的1000mL三角瓶中(共14瓶)，接种量为每1000mL三角瓶接入25mL摇瓶种子，26℃、150转每分钟摇床培养92小时。然后将此扩大培养的菌种4200mL接入装有55.8L一级种子培养基的100L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为60L；维持罐温24℃，罐压0.05MPa，搅拌速率110转每分钟，通风量1∶0.8v/v/m，发酵时间80小时。最后将60L一级种子菌种接入装有1140L发酵培养基的2000L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为1200L；维持罐温24℃，罐压0.05MPa，搅拌速率100转每分钟，通风量1∶0.6v/v/m，发酵时间110小时。
由上述方法获得的发酵液菌丝体的干重为9.5克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达97.3％。
本实施例中所使用的各种培养基的配方如下摇瓶培养基与实施例2相应培养基配方相同，但起始pH值为7.0。
扩大培养基与实施例3相应培养基配方相同，但起始pH值为6.8。
一级种子培养基的起始pH值为6.5，其配方为在实施例5相应培养基配方的基础上添加苦瓜浆状物5克/升。
发酵培养基的起始pH值为6.2，其配方为在实施例5相应培养基配方的基础上添加苦瓜浆状物15克/升。
发酵液菌丝体干重和发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的测试方法同实施例1。
实施例7鸡腿蘑发酵液的制备此实施例所用的菌种与实施例1相同。
在新鲜的斜面培养基中接入鸡腿蘑菌丝体，培养温度22℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共5瓶)，26℃、130转每分钟摇床培养132小时。然后将此摇瓶菌种接入装有300mL扩大培养基的1000mL三角瓶中(共14瓶)，接种量为每1000mL三角瓶接入25mL摇瓶种子，26℃、150转每分钟摇床培养92小时。然后将此扩大培养的菌种4200mL接入装有55.8L一级种子培养基的100L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为60L；维持罐温24℃，罐压0.05MPa，搅拌速率11 0转每分钟，通风量1∶0.8v/v/m，发酵时间80小时。最后将60L一级种子菌种接入装有1140L发酵培养基的2000L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为1200L；维持罐温24℃，罐压0.05MPa，搅拌速率100转每分钟，通风量1∶0.6v/v/m，发酵时间110小时。
由上述方法获得的发酵液菌丝体的干重为8.2克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达94.9％。
本实施例中所使用的各种培养基的配方如下摇瓶培养基的起始pH值为5.8，其余同实施例3中相应的培养基配方。
扩大培养基的起始pH值为6.2，其余同实施例2中相应的培养基配方。
一级种子培养基的起始pH值为6.5，其配方为在实施例4相应培养基配方的基础上，不添加苦瓜固体3克/升，而是相应的添加苦瓜浆状物2克/升。
发酵培养基的起始pH值为6.7，其配方为在实施例4相应培养基配方的基础上添加苦瓜浆状物9克/升。
发酵液菌丝体干重和发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的测试方法同实施例1。
实施例8～14鸡腿蘑发酵液的制备实施例8-14所用的鸡腿蘑菌种为CGMCC No.5.156，具体实施条件分别与实施例1～7中的实施条件相同，发酵液菌丝体干重和发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的测试方法同实施例1。所得结果为实施例8获得的发酵液菌丝体的干重为9.2克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达97.0％。
实施例9获得的发酵液菌丝体的于重为7.3克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达93.2％。
实施例10获得的发酵液菌丝体的干重为7.2克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达95.3％。
实施例11获得的发酵液菌丝体的干重为9.5克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达97.0％。
实施例12获得的发酵液菌丝体的干重为9.5克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达96.6％。
实施例13获得的发酵液菌丝体的干重为10克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达97.6％。
实施例14获得的发酵液菌丝体的干重为7.8克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达94.4％。
实施例15～21鸡腿蘑发酵液的制备实施例15～21所用的鸡腿蘑菌种CGMCC No.5.258，其实施条件分别与实施例1～7中的实施条件相同，发酵液菌丝体干重和发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的测试方法同实施例1。所得结果为实施例15获得的发酵液菌丝体的干重为8.7克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达96.6％。
实施例16获得的发酵液菌丝体的干重为7.4克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达93.0％。
实施例17获得的发酵液菌丝体的干重为7.2克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达95.8％。
实施例18获得的发酵液菌丝体的干重为10克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达97.8％。
实施例19获得的发酵液菌丝体的干重为9.8克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达98.0％。
实施例20获得的发酵液菌丝体的干重为9.2克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达96.9％。
实施例21获得的发酵液菌丝体的干重为8.8克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率达95.6％。
实施例22固体发酵产物的制备将实施例1所得到的发酵液于3000转/分钟离心，在得到的固形物中加水，高压破碎，均质，然后冷冻干燥获得固体的发酵产物，产物为棕褐色粉末。
实施例23发酵液上清液的制备将实施例1所得到的发酵液于3000转/分钟离心，获得的上清液。所得到的浓缩产物为黄色的，有一定粘度但粘度不大的液体。
实施例24发酵液浓缩物的制备将实施例1所得到的发酵液于3000转/分钟离心，获得的上清液，将所得到的上清液浓缩5倍后得到浓缩物。所得到的浓缩错误为棕色的，有一定粘稠度的液体。
实施例25固体发酵产物的制备将实施例1所得到的发酵液于3000转/分钟离心，获得的上清液，将所得到的上清液浓缩5倍后冷冻干燥，获得固体的发酵产物，为棕黄色粉末。
以上已详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很显然可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种添加苦瓜的鸡腿磨深层发酵工艺，其特征在于以鸡腿蘑为出发菌株，进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和添加苦瓜物质的发酵培养。
2.根据权利要求1所述的添加苦瓜的鸡腿磨深层发酵工艺，其中所述摇瓶培养的培养基组成为(单位为克/升)葡萄糖15～35，玉米粉10～20，麸皮5～10，酵母膏1～4，玉米浆2～5，KH2PO42～4，MgSO43～6，加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0；摇瓶培养的培养条件是培养温度22～30℃，转速120～160转/分钟，培养时间120～140小时。
3.根据权利要求1所述的添加苦瓜的鸡腿磨深层发酵工艺，其中所述扩大培养的培养基组成为(单位为克/升)葡萄糖15～35，玉米粉10～20，麸皮5～10，KH2PO42～4，MgSO43～6，加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0；扩大培养的培养条件是接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，转速120～160转/分钟，培养时间90～96小时。
4.根据权利要求1所述的添加苦瓜的鸡腿磨深层发酵工艺，其中所述一级种子培养的培养基组成为(单位为克/升)葡萄糖15～30，玉米粉15～25，麸皮5～10，苦瓜物质0～7.5，KH2PO42～4，MgSO41～3，加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0；一级种子培养的培养条件是接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间80～90小时。
5.根据权利要求1所述的添加苦瓜的鸡腿磨深层发酵工艺，其中所述发酵培养的培养基组成为(单位为克/升)葡萄糖10～20，玉米粉10～20，麸皮5～10，苦瓜物质5～20，KH2PO42～4，MgSO41～3，加水至适当体积，pH值为6.0～7.0；发酵培养的培养条件是接种量5～10％(体积百分比)，培养温度22～30℃，搅拌速率90～125转/分钟，通风量1∶0.3～0.8v/v/m，培养时间90～120小时。
6.根据权利要求4或5所述的添加苦瓜的鸡腿磨深层发酵工艺，其中所述的苦瓜物质为苦瓜经过预处理后获得的物质，所述的预处理方法是将苦瓜切片去籽，在60℃左右烘干后粉碎，使用时作为干物质直接加入；或者将苦瓜去籽后打碎匀浆，以浆液的形式使用，其量按干物质计算。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的添加苦瓜的鸡腿磨深层发酵工艺，其中所得到的发酵液的菌丝体干重达7～10克/升，对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率为93～98％。
8.添加苦瓜的鸡腿磨深层发酵液，其特征在于所述发酵液是由权利要求1-7任意一项的发酵工艺获得的。
9.添加苦瓜的鸡腿磨固体发酵产物，其特征在于该固体发酵产物是由权利要求8的发酵液经离心、加水、高压破碎、均质，然后冷冻干燥后获得的。
10.权利要求8的鸡腿蘑发酵液或权利要求9的鸡腿蘑固体发酵产物在制备预防和/或治疗糖尿病和癌症的药物和/或保健品中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物发酵领域，具体的说本发明涉及一种添加苦瓜的鸡腿磨深层发酵工艺，以及由该工艺获得的发酵产品。该工艺的特征在于以鸡腿蘑为出发菌株，进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和添加苦瓜的发酵培养。本发明的工艺解决了鸡腿蘑大规模液体培养的难题，同时由于在发酵培养基中加入了中药苦瓜，在发酵过程中与鸡腿蘑发生生物转化，大大提高了发酵液的活性，对鸡腿蘑的产业开发具有重要的意义。本发明的发酵液为淡黄色至棕色液体，菌丝体呈淡黄色。发酵液菌丝体的干重为7～10克每升，发酵液对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率高达93～98％。
文档编号A01G1/04GK1669391SQ20051006828
公开日2005年9月21日 申请日期2005年5月8日 优先权日2005年5月8日
发明者章克昌, 丁重阳, 王 锋, 徐柔 申请人:章克昌