专利名称：一种建立多年生黑麦草高效基因枪转化体系的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属植物生物技术领域或作物育种领域。具体说，涉及多年生黑麦草组织培养技术，基因枪转化技术和转化植株的分子检测技术，从而高效的获得多年生黑麦草转基因植株。
背景技术：
草坪业是我国发展很快的一门新兴产业，具有十分广阔的市场前景；但我国的草坪科研工作比起发达国家存在着一定的差距。多年生黑麦草分蘖多，产量高，质地柔软，绿期长，根系发达，适生性强，耐践踏；有一定的耐盐碱潜力，能增加土壤有机质，改善土壤结构，防止水土流失，不仅是良好的绿色饲料，而且是很好的草坪草。由于多年生黑麦草高度自交不育，用传统方法进行育种研究进展很慢。组织培养和遗传转化技术的发展为作物品种的改良开辟了更加广阔的天地，使不同物种的基因交流和基因的定向转移成为现实，也为多年生黑麦草新品种的培育提供了新的手段。
基因枪法是利用高速运动的金属微粒将附着于表面的核酸分子引入到受体细胞中的一种遗传物质导入技术。其原理是利用火药爆炸、高压放电或高压气体作为驱动力加速金属粒子，并使其进入带壁的细胞。在此过程中，携带有目的基因的质粒DNA首先粘附在微弹表面，结合有DNA分子的微弹经加速而获足够的动量，进而穿透植物细胞壁进入靶细胞。外源DNA分子也就随之导入细胞，并随机整合到寄主的基因组内。基因枪法的受体可以是各种外植体、愈伤组织及胚性细胞或细胞器，突破了基因转移的物种界限。实验操作简单易行，具有相当广泛的应用范围，已成为研究植物细胞转化和培育转基因植物的最有效的手段之一。基因枪转化法是目前质体基因工程中最常用和最有效的DNA导入技术，它避开了原生质体再生培养的困难，克服了当时所认为的农杆菌的宿主限制，受体材料来源广泛，且不受基因型限制。且具有高效表达、原核基因无需修饰改造、便于遗传操作、可实现定点整合和易保持纯系、后代不分离等优点。
多年生黑麦草的基因枪法转化方面，国内暂无以胚性愈伤组织为受体的成功报道，而国外也只有少数几个实验室获得了转基因植株，但转化频率较低，很多实验室转化后未得到转基因植株。因此，培养出适合遗传转化用途的胚性愈伤组织，优化基因枪转化法的各项影响条件，找出适宜的组培筛选再生条件，对于多年生黑麦草细胞工程和基因工程的研究均有重要意义。
发明内容
本发明以多年生黑麦草优良品种的胚性愈伤组织为受体材料，采用基因枪法将外源基因导入受体细胞，经选择获得转化细胞及植株。在此基础上，确立了抗生素的筛选压；基因枪法遗传转化体系中，金粉包裹物质、受体愈伤的直径大小、金粉直径、轰击的高度、次数对基因枪法转化的影响，从而建立起一个高效的多年生黑麦草转基因技术体系。
本发明的主要步骤包括以多年生黑麦草成熟种子或成熟胚为外植体诱导胚性愈伤组织，作为转基因操作的受体材料。经预培养后进行轰击和渗透培养，而后进行恢复培养和筛选培养，挑取存活愈伤进行续筛选以及再生培养，并对抗性植株进行鉴定和选择。
附图简要说明附
图1转入DREB1A的多年生黑麦草爱神特(Accent)转基因植株；附图2转入DREB1A的多年生黑麦草尤文图斯(Juventus)转基因植株根系；附图3转入BADH-CMO双基因的爱神特转基因植株；附图4转入BADH-CMO双基因的爱神特转基因植株根系；附图5gus基因在愈伤中的瞬时表达；附图6gus基因在再生芽中的稳定表达；附图7表达载体结构图；附图8转DREB基因的PCR扩增结果(1-19为转化植株，20为阴性对照，21为阳性对照，22为marker)；附图9转BADH基因的PCR扩增结果(1-10为转化植株，11为阳性对照，12为阴性对照，13为marker)；附
图10转CMO基因的PCR扩增结果(1-11为转化植株，12为阳性对照，13为BADH扩增产物，14为阴性对照，15为marker)；附
图11转DREB基因Southern杂交结果(1为阴性对照，2为阳性对照，3为marker，4-9为转化植株)。
具体实施例方式本发明一种建立多年生黑麦草高效基因枪转化体系的方法及其应用是基于成功建立多年生黑麦草高频再生体系的基础上，通过调控影响基因枪法转化的各因子而建立起来的转基因技术体系。
受体材料准备以多年生黑麦草成熟种子或成熟胚为外植体诱导愈伤组织，愈伤诱导和继代培养基均为MS+4-6mg/L 2，4-D+0.2-0.3mg/L 6-BA+0.1g/L水解酪蛋白，25℃暗培养。挑取年龄2-3个月的胚性愈伤组织预培养3d后，用镊子分成直径约0.5-1mm的小块，置于含有渗透剂的培养基中央，紧密排列出一个直径2cm的圆。
筛选剂浓度和筛选时间的确定将胚性愈伤组织分别接入含有不同潮霉素筛选剂浓度的诱导培养基中25℃暗培养，20d和30d时分别统计愈伤组织的存活率。另将胚性愈伤组织接入含有不同潮霉素筛选剂浓度的分化培养基中，25℃光照培养，20d和30d统计出芽率并观察愈伤状态。以愈伤组织接近全部死亡，分化影响适中的筛选剂浓度为转化细胞的选择浓度和筛选时间。
包裹DNA微弹(1)称取30mg直径1μm的金粉，置于1.5ml离心管中，加入1ml70％乙醇，涡旋3-5min，静置15min，瞬时离心1-5s，弃上清。(2)重复以下步骤三次加入1ml无菌水洗涤金粉，涡旋1min，静置1min，瞬时离心，弃上清。(3)加500μl 50％无菌甘油，金粉浓度约为60mg/ml，室温下可保持两周。(4)涡旋保存在甘油中的金粉5min。(5)吸取50μl(3mg)于1.5ml离心管中，吸取过程保持涡旋，冰上操作；(6)依次加入5μl携带有目的基因的质粒DNA(1μg/μl)，Ca(NO3)2和PEG4000(现配现用)，持续涡旋2-3min，静置1min，瞬时离心2s；(7)弃上清，加入140μl 70％乙醇；(8)弃上清，加入140μl无水乙醇；(9)弃上清，加入48μl无水乙醇，轻轻敲击离心管数次悬浮金粉，低速涡旋2-3s。置于冰上备用。
轰击处理所用基因枪为Biorad公司PDS1000/He型，将其放置于一个较大型的超净工作台上，以利于操作。工作台、真空室、微弹载体和阻挡网等均需用70％遗传消毒，然后吹干。将微弹载体装入载体架上，取6μl包被质粒DNA的金粉悬浮液，均匀涂抹于微弹咱体中心，干燥10min。将载有包被质粒DNA的金粉颗粒的微弹载体及阻挡网装入微弹发射装置中，将盛有欲转化愈伤组织的培养皿置于基因枪样品室内，可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，氦气压力为1100psi，真空度28inchHg，微弹飞行距离在6cm轰击2次。
过渡培养和筛选培养将轰击后的愈伤组织在含有渗透剂的愈伤诱导培养基中过夜，次日进行gus基因化学组织染色，按照Jefferson的方法进行。将愈伤组织转入愈伤诱导培养基中恢复培养10d，再转入加有50mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基中筛选培养30d，25℃暗培养，统计愈伤存活率。
植株再生培养挑取存活愈伤转入含有50mg/L潮霉素的分化培养基(分化培养基是指MS+0.1-0.2mg/L6-BA+0.4-0.6mg/L NAA+0.3-0.5mg/L ZT+6.4mg/L Cu2+)中续筛选30d，25℃光照16h培养。挑取部分愈伤组织进行gusA化学组织染色。将长出的小芽转入到不含筛选剂的分化培养基中待小苗长到3-4片叶时转入生根培养基(生根培养基是指MS+0.4mg/L NAA+0.1mg/L ZT)中，壮苗生根。
抗性植株的移栽将根叶完全的壮苗室温下炼苗3d后，清洗掉基部的培养基，直接栽入到花盆(基质为沙∶土∶草炭＝1∶1∶1)中，自然光下生长。
实施例实施例1基因枪法将DREB1A基因转入多年生黑麦草中获得抗旱、耐盐、耐低温的转基因植株植物基因的表达受干旱高盐及低温胁迫的诱导，根据基因产物的作用，主要有两大类，第一类包括直接保护细胞免受水分胁迫伤害的功能蛋白、渗透调节因子的合成酶、以及毒性降解酶；第二类包括传递信号和调控基因表达的转录因子、感应和转导胁迫信号的蛋白激酶以及在信号传导中起重要作用的蛋白酶。控制甜菜碱合成的胆碱单氧化物酶(CMO)和甜菜碱醛脱氢酶(BADH)都属于渗透调节因子的合成酶，CMO-BADH是二者整合到同一个表达载体中构建的双基因表达载体。转录因子DREB1A属于第二类，通常认为一个转录因子可以调控多个与同类性状有关的基因的表达，在提高作物对环境胁迫抗性的分子育种中，与导入或改良个别功能基因来提高某种抗性的传统方法相比，从改良或增强一个关键的转录因子的调控能力着手，是提高作物抗性的更为有效的方法和途径。
受体材料的获得植物材料为多年生黑麦草三个品种种子，爱神特(Accent)、特拉华(Delaware)和尤文图斯(Juventus)。将其种子经次氯酸钠搅拌消毒40min后，无菌水清洗6次，4℃浸泡10h，再次清洗后用尖头镊子剥取其胚接种到愈伤诱导培养基上暗培养，温度25℃。期间拔芽三次，25d后继代，2-3代后挑取胚性愈伤组织预培养3d。用镊子将胚性愈伤组织分成直径约小于0.5mm、0.5-1.0mm、大于1.0mm的愈伤组织块(表1)，置于含有渗透剂的培养基中央，紧密排列出一个直径2cm的圆。愈伤组织块过小轰击受损后难以恢复，多数褐化死亡；愈伤块过大使培养基表面不能够平整，单块愈伤的轰击点范围变小，且，因此0.5-1mm为最适宜的轰击愈伤直径。
表1愈伤组织块的大小对轰击后愈伤存活率的影响
筛选剂浓度和时间的确定将爱神特胚性愈伤组织分别接入含有不同潮霉素筛选剂浓度的诱导培养基中，25℃暗培养，20d和30d时分别统计愈伤组织的褐化率。另将胚性愈伤组织接入含有不同潮霉素筛选剂浓度的分化培养基中，25℃光照培养，20d和30d统计出芽率并观察愈伤状态。以愈伤组织大部分死亡，分化影响适中的筛选剂浓度为转化细胞的选择浓度和筛选时间。(表2&表3)确定潮霉素浓度为50mg/L，筛选时间为30d。
表2潮霉素浓度和筛选时间对愈伤褐化情况的影响
表3在抗生素中筛选30d后转入再生培养基中再生状况
包被DNA从含有DREB1A植物表达载体的大肠杆菌DH10B中提取质粒并纯化，稀释为1μg/μl，-20℃保存。称取30mg直径0.6或1μm的金粉，置于1.5ml离心管中，加入lml70％乙醇，涡旋3-5min；静置15min，瞬时离心1-5s，弃上清。重复一下步骤三次加入1ml无菌水，涡旋1min，静置1min，瞬时离心，弃上清。三次洗完后，加500μl 50％无菌甘油，金粉浓度约为60mg/ml，室温下可保持两周。包被DNA的步骤如下(1)涡旋保存在甘油中的金粉5min。(2)吸取50μl(3mg)于1.5ml离心管中，吸取过程保持涡旋；(3)依次加入5μl DNA CaCl2+sperm或Ca(NO3)2+PEG4000(表5)；(4)持续涡旋2-3min，静置1min，瞬时离心2s；(5)弃上清，加入140μl 70％乙醇；(6)弃上清，加入140μl无水乙醇；(7)弃上清，加入48μl无水乙醇，轻轻敲击离心管数次悬浮金粉，低速涡旋2-3s。置于冰上备用。1μm直径的金粉在瞬时表达时明显优于0.6μm直径的金粉(表4)。Ca(NO3)2+PEG4000的组合明显优于CaCl2+sperm(表5)，因此金粉的包裹物质选择Ca(NO3)2+PEG4000。
表4金粉直径对轰击后愈伤组织gus基因瞬时表达的影响
表5金粉的不同处理对轰击后愈伤组织存活率影响
基因枪轰击采用美国Biorad公司PDS-1000/He型基因枪，工作台、真空室、微弹载体和阻挡网等均需用70％遗传消毒，然后吹干。将微弹载体装入载体架上，取6μl包被质粒DNA的金粉悬浮液，均匀涂抹于微弹咱体中心，干燥10min。将载有包被质粒DNA的金粉颗粒的微弹载体及阻挡网装入微弹发射装置中，将盛有欲转化愈伤组织的培养皿置于基因枪样品室内，可裂圆片与载体的距离为2.5cm，载体与阻挡网的距离为0.8cm，氦气压力为1100psi，真空度28inchHg，微弹飞行距离在6或9cm轰击1-2次。愈伤组织的存活率轰击2次和轰击高度选择6cm较轰击1次轰击高度9cm均更高(表6、表7)。
表6轰击次数对愈伤组织存活率的影响
表7轰击高度对轰击后愈伤组织gus瞬时显色的影响
转化后愈伤的培养、植株再生和移栽轰击后在含有渗透剂(0.2M山梨醇和甘露醇)的培养基上过夜。次日通过gus组织化学染色观察基因的瞬时表达状况，并将愈伤组织转入诱导培养基中黑暗条件下恢复培养10d，使转入的基因能够充分的表达。而后将其转入含有筛选剂(潮霉素50mg/L)的诱导培养基中培养30d，选择存活材料转入含有筛选剂的再生培养基中，30d后将再生出小苗的愈伤转入不含筛选剂的再生培养基中，同时通过gus化学组织染色观察基因的稳定表达。将长到3-4片叶的小苗转入生根培养基中生根，根系发达后的植株去除封口膜，室温下炼苗3d后移入花盆中。
转化植株的分子检测提取抗性植株DNA进行PCR检测，DREB1A引物序列为引物F5’＞AAA GGA TCC TTA CCC GGG TTC TGA TCA ATG AAC TCA TTT TCT G＜3’，引物R5’＞AAA GGT ACC AAT CCC GGG GTT TTA ATA ACT CCA TAA CGA TAC G＜3’取PCR阳性植株的DNA进行Southern印迹杂交鉴定，以目的基因的PCR产物做探针。共检测爱神特抗性植株109株，其中阳性植株24株，转化效率22％；特拉华抗性植株3株，全部为阳性植株；尤文图斯抗性植株12株，其中阳性植株10株，转化效率83％。
实施例2基因枪法将CMO-BADH双基因转入多年生黑麦草中获得抗旱耐盐的转基因植株受体材料的获得、筛选剂浓度和时间的确定、DNA的包被以及基因枪的轰击同实施例1，转化受体为多年生黑麦草爱神特愈伤组织。PCR扩增时，CMO引物序列为引物FATG ATG GCA GCA AGC GCA AGC GCA AC引物RTTA CTT CAA AGT TTG TTG CAA CCA GCA GTG GBADH引物序列为引物Faac GGA TCC ATG GCG TTC CCA ATT CCT GC引物Racc GAG CTC TCA AGG AGA CTT GTA CCA TCC CC取PCR阳性植株的DNA进行Southern印迹杂交鉴定，以目的基因的PCR产物做探针。共检测抗性植株50株，其中阳性植株7株，转化效率13％。
权利要求
1.一种建立多年生黑麦草高效基因枪转化体系的方法及其应用，其技术体系包括(1)通过高频再生体系获得受体材料；(2)筛选剂筛选压和筛选时间的确定；(3)基因枪法导入外源DNA；(4)转化后愈伤的筛选与再生；(5)抗性植株的分子检测。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，它是一种应用于多年生黑麦草的高效基因枪转化技术。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，以胚性愈伤组织为受体，通过调节基因枪轰击过程中的各项影响因素，获得适合多年生黑麦草最佳转化体系。待轰击愈伤组织块直径在0.5-1mm，采用Ca(NO3)2+PEG4000包被质粒DNA，使用1μm金粉作为质粒DNA的载体，轰击的高度选择6cm，轰击次数为2次。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，轰击后愈伤组织在含有渗透剂(0.2M山梨醇和甘露醇)的愈伤诱导培养基上过夜，次日转入愈伤诱导培养基中恢复培养10d。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，经恢复培养的愈伤组织，在筛选压为50mg/L潮霉素的愈伤诱导培养基中筛选培养30d，而后转入相同筛选压的再生培养基中续筛选的同时再生植株。
6.一种多年生黑麦草高效基因枪转化体系在建立转基因抗旱、耐盐、耐低温多年生黑麦草中的用途。
7.转基因抗旱、耐盐、耐低温多年生黑麦草，其是通过应用权利要求1-6中任何一项的方法而得到的。
全文摘要
本发明一种建立多年生黑麦草高效基因枪转化体系的方法及其应用，通过调控基因枪轰击过程中的各影响因子，包括轰击愈伤组织块大小、金粉包被物、金粉直径、轰击高度、轰击次数等，以及筛选剂的筛选压和筛选时间，成功建立起多年生黑麦草的遗传转化体系。应用该转化体系在建立转基因多年生黑麦草中的用途和应用该转化体系得到的转基因抗旱、耐盐、耐低温多年生黑麦草植株。
文档编号A01H4/00GK1715417SQ20051008547
公开日2006年1月4日 申请日期2005年7月21日 优先权日2005年7月21日
发明者韩烈保, 李雪, 刘君, 曾会明, 信金娜 申请人:北京林业大学, 韩烈保, 李雪