专利名称：建立草地早熟禾高频再生体系的方法
技术领域：
本发明为一种建立草地早熟禾高频再生体系的方法，属于细胞工程中的植物组织培养，建立了3个草地早熟禾品种的高频再生体系，可用于农杆菌和基因枪介导的遗传转化。
背景技术：
草地早熟禾(Poa pratensis L.)是禾本科早熟禾属的一种优质冷季型草坪草，采用基因工程对草地早熟禾进行品种改良、新品种选育已经成为当前草地早熟禾生物技术领域研究的重点。草地早熟禾基因转化的受体系统主要来源于组织培养途径，作为基因转化的受体系统，要求具有很强的再生能力、较高的遗传稳定性、稳定的外植体来源、对选择性抗生素敏感、对农杆菌侵染要有敏感性等。因此，建立高效的再生体系一直是草地早熟禾育种学家追寻的目标。草地早熟禾组织培养开始于80年代，之后，不同的草地早熟禾组培再生体系相继建立起来，但是还存在再生频率较低、维持愈伤胚性困难等不足。本专利从不同外植体来源、激素水平、基因型、继代时间等因素上研究了草地早熟禾再生体系，建立3个草地早熟禾品种的相对稳定的高频再生体系，为下一步遗传转化工作提供基础材料。而且，在这些再生体系的基础了，进行了遗传转化，获得了转3种外源基因的草地早熟禾转基因植株，证明了这3个再生体系的实用性。
发明内容
本发明建立了三个草地早熟禾品种的高频再生体系，能够应用于悬浮培养、农杆菌与基因枪转化等过程中。主要包括1)对比成熟种子与胚轴作为外植体进行愈伤组织诱导，两者获得的胚性愈伤结构均较好、且增殖较快，考虑到操作的简便性，采取成熟种子作为外植体。
2)对草地早熟禾进行消毒处理方式比较，证明采用磁力搅拌器搅拌消毒40-60分钟，蒸馏水洗净后直接接种效果最佳。
3)选择干燥、易碎、颗粒状的愈伤组织进行继代培养，能够保持愈伤的胚性，其再生频率不会下降。
4)采用正交设计与单因素方差分析对愈伤组织诱导与再生使用的培养基进行研究。得到合适于Baron品种的最适愈伤组织诱导培养基为MS+2，4-D(1mg/L)+6-BA(0.1mg/L)+CuSO4(3mg/L)+酸水解酪蛋白CH(1g/L)，胚性愈伤诱导率为23.75％，最适再生培养基为AK2MS+KT(0.2mg/L)+6-BA(1mg/L)，分化频率为53.33％；适合于Midnight品种最适愈伤组织诱导培养基为MS+2，4-D(2mg/L)+6-BA(0mg/L)+CuSO4(3mg/L)+CH(1g/L)，胚性愈伤诱导率为10％，最适分化培养基为AL2MS++6-BA(1mg/L)+LH(0.5g/L)，分化频率为56.67％；适合于Mardona品种的愈伤组织诱导培养基为2mg/L 2，4-D+0.2mg/L 6-BA+3mg/L CuSO4+1g/L CH为愈伤组织诱导的最适培养基，胚性愈伤诱导率为31.67％，最适分化培养基为KBNMS+KT(0.2mg/L)+6-BA(1mg/L)+NAA(0.5mg/L)，分化频率为40％以上。同时，建议把胚性愈伤诱导率作为愈伤组织诱导效率的评价指标。
5)获得的再生植株在有很强的分蘖能力，再生2个月是适合移栽的时期，移栽到花盆中的再生苗能够100％成活，在田间能够正常扩繁生长。
四
图1干燥、易碎的第一类愈伤组织(被称为胚性愈伤组织)；图2柔软、水质的第二类愈伤组织；图3草地早熟禾再生植株；图4草地早熟禾生根；图5移栽到花盆的再生苗；图6再生苗移栽以2个月移栽效果最好(左图为再生2个月，右图为再生一个月)；图7再生苗移栽到田间生长旺盛(均Mardona品种为例)
五具体实施例方式
1.材料与方法1.1试验材料草地早熟禾‘Mardona’品种，来自丹麦丹农种子公司，‘Midnight’品种，来自美国Turf-seed Inc公司，‘Baron’品种，来自荷兰百绿集团。
1.2外植体的获得采用成熟种子与胚轴作为外植体，胚轴来源于刚萌发的种子。成熟种子浸入70％酒精30秒，无菌水冲洗2-3次，25％次氯酸钠溶液消毒40分钟-1小时(依消毒状态而定)，无菌水清洗5-6次。
1.3培养基培养基为MS基本培养基，附加不同量的植物激素、30g/L蔗糖、8g/L琼脂，pH值5.8。愈伤组织诱导与继代使用相同的培养基。愈伤组织分化和生根使用相同的培养基。
1.4培养方法无菌种子接种入诱导愈伤培养基中，28℃无菌黑暗条件诱导愈伤，约9天对种子进行拔芽处理，促进愈伤组织形成，记录发芽率，20天后继代到新鲜的相同培养基中。继代2次后，统计出愈率和胚性愈伤诱导率，进行结果分析。愈伤组织分化与生根条件为16h光照，8h黑暗，光照度2000Lx，温度均为25±1℃。
2.结果与分析2.1不同外植体诱导愈伤的影响采用成熟种子与长1cm的胚轴愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤，结果见表1。
表1 胚轴诱导愈伤与种子诱导比较
由表1可见，成熟种子作为外植体诱导愈伤的出愈率与胚性愈伤诱导率均较胚轴高，两者获得的胚性愈伤结构均很好、且增殖较快，考虑到操作的简便性，采取成熟种子作为外植体。
2.2外植体消毒方式对诱导愈伤影响种子消毒后，采用两种不同的处理方式1直接接种；2灭菌蒸馏水中4摄氏度浸泡3天后接种，结果见表2。在种子消毒过程中采用磁力搅拌器搅拌消毒与手动消毒2种方式，结果见表3。
表2 不同接种方式对愈伤诱导影响
浸泡种子按种后，种子4天便可发芽，而直接接种，种子则5天才可发芽。虽然浸泡可以使种子提前发育，但是并没有使出愈率增加，反而使出愈率降低了4.7个百分点。所以采用直接接种的方法较好。
表3 种子消毒方式对愈伤诱导影响
由表3可以看出，采用磁力搅拌消毒么能大大提高愈伤组织出愈率，所以，采用磁力搅拌消毒处理种子。
2.3愈伤质量与年龄对植株再生影响由成熟种子诱导的愈伤组织在显微镜下观察可见典型的两种类型(附图1，2)，第一种类型中的愈伤生长迅速，呈颗粒状结构，形状有球形、心形，有些呈现体细胞胚发育的早期形态，而第二种愈伤组织为水状、生长缓慢，颜色暗淡，分化只能形成毛状根，不能形成植株。选择第一种愈伤组织进行继代培养，培养不同时间长短的愈伤组织进行分化再生实验，结果见表4。
表4 不同年龄愈伤分化情况比较
从总体(表4)上看，在8个月内，草地早熟禾愈伤没有因为继代次数增多而胚性下降，对于草地早熟禾而言，采用诱导出的胚性愈伤或者继代产生的胚性愈伤继代，能够保持胚性。
2.4三种草地早熟禾品种再生体系建立2.4.1愈伤组织诱导培养基确定愈伤组织诱导在MS基本培养基基础上，考虑4个因素，每个因素设4个水平，采用L16(45)正交表进行，具体因素与水平见表5，愈伤组织诱导结果见表6。
表5 正交试验表头设计
表6 愈伤诱导情况统计
对所得百分率的结果进行反正弦转换，并进行数据处理与分析，获得了三个品种的最适愈伤组织诱导培养基(表7)。只有胚性愈伤才能正常再生，对再生体系建立作用较大，所以，用胚性愈伤诱导率作为评价指标较为合理。最终以胚性愈伤诱导率确定为最适合的愈伤组织诱导培养基。
表7 三个品种草地早熟禾愈伤组织诱导正交设计结果
各因素影响程度为 各因素影响程度为A＞B＞D＝C，最适合的 A＞D＞C＞B，最适合的Midnight(Md)组合为A3B3C2D4组合为A3B1C2D4。
对Baron、Midnight品种进行正交设计结果的验证，验证用的培养基见表8，验证结果见表9。
表8 验证用的培养基成分
表9 不同培养基的诱导情况
注不同字母表示差异显著(P＜O.05)由表9可以看出，适合Baron品种的最适诱导培养基为P2，胚性愈伤诱导率为23.75％，适合Midnight品种的最适诱导培养基为P5，胚性愈伤诱导率为10％。
2.4.2最适愈伤组织分化培养基确定对于Mardona品种，愈伤组织分化培养基在MS基本培养基基础上，考虑4个因素、每个因素3个水平，采用L9(34)正交表进行，具体因素与水平见表10，结果见表11。对于Baron、Midnight品种，采用单因素实验设计，具体的方法与结果见表12。
表10 愈伤组织分化正交试验表头设计
表11 愈伤组织分化正交设计实施结果因素与水平处理均值
对所得百分率的结果进行反正弦转换，并进行数据处理与分析，得到最适合于Mardona品种分化培养基为MS+KT(0.2mg/L)+6-BA(1mg/L)+LH(0g/L)+NAA(0.5mg/L)。
表12 Baron、Midnight品种单因素再生实验结果
由表12可以看出，Baron品种的最适再生培养基为AK2MS+KT(0.2mg/L)+6-BA(1mg/L)，Midnight的最适分化培养基为AL2MS++6-BA(1mg/L)+LH(0.5g/L)。
2.5再生植株的移栽愈伤组织在再生培养基中分化1个月后(附图3)，转入相同的培养基生根和壮苗(附图4)，转入花盆中(附图5)，一般再生2个月后移栽效果最佳(附图6)。这些移栽苗，转入田间能保持旺盛生长(附图7)。
3.该再生体系应用实例采用基因枪转化法，轰击由此再生体系培养出的胚性愈伤组织，经过继代与分化培养，获得了Baron品种转DREB1A、BADH-CMO、CMO三种外源基因的转基因植株(表13)。其转化频率依次为3.59％、3.92％与1.94％。是一次成功的运用实例。
表13 Baron品种转基因数目
权利要求
1建立草地早熟禾高频再生体系的方法，其技术体系包括1)外植体的选择以及消毒；2)胚性愈伤诱导与鉴定方法；3)不同时间长短的愈伤再生能力比较；4)正交设计和单因素设计在再生体系中的应用；5)组培苗移栽合适时期的选择与田间移栽
2.按照权利要求1所述，建立草地早熟禾高频再生体系的方法，其特征在于，选择成熟种子作为外植体诱导愈伤组织，消毒时运用磁力搅拌消毒，蒸馏水洗净后直接接种为宜。
3.按照权利要求1所述，建立草地早熟禾高频再生体系的方法，其特征在于，选择易碎、干燥的胚性愈伤进行继代培养，在8个月内能够保持其再生能力。
4.按照权利要求1所述，建立草地早熟禾高频再生体系的方法，其特征在于，正交设计与单因素实验设计，是草地早熟禾组织培养过程中可靠的研究方法。运用这2种实验设计的方法，建立了三种草地早熟禾品种的高频再生体系。
5.按照权利要求1所述，建立草地早熟禾高频再生体系的方法，其特征在于，再生2个月的组培苗，移栽到花盆中能够100％成活，在田间生长健壮。
6.按照权利要求1所述，建立草地早熟禾高频再生体系的方法，其特征在于，运用Baron品种高频再生体系进行了基因枪介导法遗传转化，获得了转DREB1A、BADH-CMO、CMO基因的转化植株。其转化频率依次为3.59％、3.92％与1.94％。
全文摘要
本专利对草地早熟禾Baron、Mardona、Midnight品种进行了组织培养研究，表明选择成熟种子作为外植体诱导愈伤组织，消毒时运用磁力搅拌消毒，蒸馏水洗净后直接接种为宜；选择易碎、干燥的胚性愈伤进行继代培养，在8个月内能够保持其再生能力；再生2个月的组培苗，移栽到花盆中能够100％成活，在田间生长健壮；运用正交设计与单因素实验设计的方法，建立了三种草地早熟禾品种的高频再生体系，胚性愈伤诱导率高达31.67％，愈伤组织分化率高达56.67％。运用其中Baron品种的再生体系进行基因枪转化，获得了转DREB1A、BADH－CMO、CMO基因的转化植株。
文档编号A01H4/00GK1698423SQ20051008547
公开日2005年11月23日 申请日期2005年7月21日 优先权日2005年7月21日
发明者韩烈保, 信金娜, 曾会明, 刘君, 李雪 申请人:北京林业大学, 韩烈保, 信金娜