专利名称：野田村病毒的感染预防方法和治疗方法
技术领域：
本发明涉及野田村病毒(nodavirus)的感染、特别是病毒性神经坏死症等的预防方法和治疗方法。更详细地说，本发明涉及使用非致病性的水生双RNA病毒(Aquabirnavirus)来预防和治疗特别是由野田村病毒的感染而引起的病毒性神经坏死症等的方法。
背景技术：
目前，为了保护和确保海产鱼资源，在日本国内养殖有大约40种海产鱼。另外，还生产数种鱼苗作为养殖的种苗。对这种鱼的种苗生产技术和养殖技术也正在开发中，但是却要时常面对对由感染、特别是由病毒感染引起的疾病的控制的困难。例如，报道有对魳鱼(yellowtail)等的由YAV(魳鱼腹水病毒，yellowtail ascites virus)导致的双RNA病毒(birnavirus)感染，对石斑鱼和比目鱼等的由野田村病毒感染导致的VNN(病毒性神经坏死症)等(例如参照非专利文献1、非专利文献2)。
其中，特别是由野田村病毒感染导致的病毒性神经坏死症在1990年以后在世界各地的海产鱼中发生，且致死性极高，因此对种苗生产业和养殖构成威胁。另外，其患病鱼种也已超过30种(例如参照非专利文献2)。
一直以来，对于病毒性神经坏死症，疫苗疗法是有效的(在试验方面)，但该疫苗疗法由于是注射接种，故不能适用于幼鱼和鱼苗。另外，对于公开的基因重组外覆蛋白质疫苗而言，到其疫苗显现效果还需要3周的较长时间(例如参照非专利文献3、非专利文献4)。
另外，鱼类野田村病毒中有3种不同的血清型，所以需要分别制作每个血清型的疫苗(例如参照非专利文献5)。
而且，用于防止来自于亲鱼的垂直感染的无病毒亲鱼的选择需要病毒基因的检测技术和为此所用的装置，还需要受精卵的消毒。另外，需要用于为了防止水平感染而进行饲养水的杀菌的臭氧或紫外线装置。这些防止对策都具有非常麻烦和花费大量费用的缺点(例如参照非专利文献6、非专利文献7)。
除此以外，对于病毒性神经坏死症，特别是对于幼鱼期以后的发病，其现状是有效的预防和治疗方法完全没有实用化。所以，对于幼鱼期以后的病毒性神经坏死症也强烈要求其有效的预防和治疗方法的开发。
另一方面，有报道说由非致死性水生双RNA病毒(ABV)一次感染后的比目鱼对由以肾脏等内脏各器官为目标的病毒出血性败血症病毒(VHSVviral haemorrhagic septicaemia virus)引起的二次感染的抵抗性增加(例如参照非专利文献8、非专利文献9)。但是，该VHSV是以肾脏等内脏各器官为目标的病毒，而ABV对以野田村病毒为病因的、作为中枢神经系统所患的疾病的病毒性神经坏死症也是有效的报道却完全没有。
非专利文献1Takano，R.，et al.，Fish Pathology，36(3)，153～169，2001.9非专利文献2Munday，B.L.，et al.，Journal of Fish Diseases，25，127～142，2002非专利文献3Tanaka，S.，et al.，Journal of Fish Diseases，24，15～22，2001非专利文献4Yuasa，K.，et al.，Journal of Fish Diseases，25，53～56，2002非专利文献5Mori，K.，et al.，Diseases of Aquatic Organisms，57，19～26，2003非专利文献6养殖，10，pp.21～22，2001非专利文献7Tsuchihashi，Y.，et al.，SUISANZOSHOKU 50(3)，355～361，2002
非专利文献8Pakingking，R.Jr.，et al.，Fish & Shellfish Immunology，印刷中(2004)非专利文献9Pakingking，R.Jr.，et al.，Fish Pathology，38，15～21，200
发明内容以上述的现有技术为背景，本发明人等对非致病性的隐性感染的水生双RNA病毒(ABV)进行了锐意研究，结果发现ABV对由野田村病毒感染引起的病毒性神经坏死症是有效的，从而完成了本发明。
因此，本发明目的在于提供一种使用非致病性的水生双RNA病毒来预防和治疗野田村病毒感染的方法。
为了达成上述目的，本发明提供一种使用为非致病性的隐性感染的水生双RNA病毒来预防由于野田村病毒感染而引起的疾病的预防方法。
本发明还提供一种使用为非致病性的隐性感染的水生双RNA病毒来治疗由野田村病毒感染而引起的疾病的治疗方法。
另外，本发明还提供通过将水生双RNA病毒口服给药来预防由野田村病毒感染引起的疾病的发病的预防方法和治疗上述疾病的治疗方法。
图1是表示比目鱼的肾脏和脑中的野田村病毒效价的变化的图。
图2是表示野田村病毒导致的石斑鱼的累积死亡率的图。
图3是表示石斑鱼的肾脏和脑中的野田村病毒效价的变化的图。
具体实施例方式
本发明的野田村病毒感染预防方法和由该感染引起的疾病的治疗方法的特征在于，对于适用对象鱼种，通过使用为非致病性的隐性感染的水生双RNA病毒(ABV)，从而预防野田村病毒感染和/或治疗由野田村病毒感染引起的疾病。
已知水生双RNA病毒(ABV)为非致病性或弱毒性，虽然对环境是无害的，但对大多数的天然鱼是隐性感染的。
因此，本发明中所用的ABV可以容易地从比目鱼等隐性感染的海产鱼等的自然界中分离。如此从自然界分离的无毒性或弱毒性的ABV不仅可以接种于其宿主鱼，而且可以接种于其它鱼类的细胞，并可以进行培养而容易地使其增殖。
为了将如上所述培养并增殖了的水生双RNA病毒(ABV)用于鱼类，不仅可以通过ABV溶液的注射来给药，也可以通过混合有ABV的饲料的喂食或通过浸渍在含有ABV的溶液中等来给药。这可以说，虽然感染ABV的天然鱼的感染途径较多，但由于是通过保有ABV的浮游生物的摄取而导致的经口感染，所以当然是能感染的方法。
本发明中，将水生双RNA病毒(ABV)混合在饲料中喂食时，例如相对于1g全饲料，通常可以按照约107～108TCID50的比例进行混合。浸渍在ABV溶液中时，相对于1ml溶液，通常可以按照约105～106TCID50的比例进行混合。使用ABV注射液时，相对于1ml注射液，通常可以按照约107～108TCID50的比例进行混合。
另外，作为本发明的预防方法和治疗方法可以适用的鱼种，没有特别限定，只要是感染了野田村病毒的鱼种或有可能感染的鱼种即可。而且，从种苗到包括鱼苗、亲鱼的成长鱼，无论鱼的大小(生长阶段)，都可以使用。
以下，通过实施例详细地对本发明进行说明，但本发明并不是通过下述实施例来限定，下述实施例只是为了更具体地说明本发明而举例说明。
实施例1(水生双RNA病毒(FBV株)的性状)本实施例中所使用的水生双RNA病毒(FBV株)属于双RNA病毒科水生双RNA病毒属，是不具有包膜(envelope)的直径约为60nm的球形病毒，并具有双链RNA作为核酸。该FBV株同样属于双RNA病毒科水生双RNA病毒属，由于其被用作为魳鱼的致病病毒而为人所知的YTAV(魳鱼腹水病毒，yellowtail ascites virus)制作的兔抗血清完全地中和，所以分类为与YTAV相同的血清型。另外，该FBV株与作为属于双RNA病毒科的鲑科鱼类的致病病毒而为人所知的IPNV(传染性胰腺坏死病毒，infectious pancreatic necrosis virus)在血清学方面是不同的。而且，该FBV株通过来源于鱼类的株化细胞的RTG-2细胞良好地增殖。
实施例2(水生双RNA病毒(FBV株)对比目鱼的安全性试验)水生双RNA病毒(FBV株)是将RTG-2细胞在培养基(Eagle’sMEM，牛胎儿血清)中培养而得到的。如此得到的FBV株在-80℃下保存。该冷冻保存株经过6个月以上也仍然是有效的。
将如此冷冻保存的FBV株接种于平均体重为18g的比目鱼(人工养殖)的肌肉内(接种量106.9TCID50/条，供试条数20)。在水温为20℃下观察3周，结果未发现死亡鱼和异常鱼。另外，也未发现该FBV株对比目鱼幼鱼(0.5g)的致病性。
实施例3(水生双RNA病毒(FBV株)对石斑鱼的安全性试验)水生双RNA病毒(FBV株)与实施例2相同，是将RTG-2细胞在培养基(Eagle’s MEM，牛胎儿血清)中培养而得到的。得到的FBV株在冷冻(-80℃)下保存。该冷冻保存株经过6个月以上也仍然是有效的。
将如此冷冻保存的FBV株接种于平均体重为12g的石斑鱼(人工养殖)的肌肉内(接种量107.1TCID50/条，供试条数20)。在水温为25℃下观察3周，结果未发现死亡鱼和异常鱼。
实施例4(水生双RNA病毒(FBV株)对比目鱼的野田村病毒感染的阻止效果)水生双RNA病毒(FBV株)与实施例2相同，是使用RTG-2细胞在培养基(Eagle’s MEM，牛胎儿血清)中培养而得到的。得到的FBV株在冷冻(-80℃)下保存。该冷冻保存株经过6个月以上也仍然是有效的。
将如此冷冻保存的FBV株接种于平均体重为12g的比目鱼(人工养殖)的肌肉内(接种量106.6TCID50/条)。在水温为20℃下饲养7天后，将用E-11细胞培养的鱼类野田村病毒RGNNV(SGWak97株)接种于肌肉内(接种量108.6TCID50/条)，并在3天、7天、14天后测定。肾脏和脑的RGNNV量。
另外，将不接种FBV株而单独感染RGNNV的鱼作为对照组。本实施例中，无论有无FBV株的接种，均未发现RGNNV引起的感染死亡。
如图1所示，在任一测定时，预先接种有ABV的鱼的肾脏和脑内的RGNNV量与对照组相比，均显著降低。
实施例5(水生双RNA病毒(FBV株)对石斑鱼的野田村病毒感染的阻止效果)水生双RNA病毒(FBV株)与实施例2相同，是将RTG-2细胞在培养基(Eagle’s MEM，牛胎儿血清)中培养而得到的。如此得到的FBV株同样地冷冻保存。将冷冻保存的FBV株接种于平均体重为12g的石斑鱼(人工养殖)的肌肉内(接种量107.1TCID50/条)。在水温为25℃下饲养7天后，将用E-11细胞培养的鱼类野田村病毒RGNNV(SGWak97株)接种于肌肉内(接种量105.1TCID50/条)。另外，将不接种FBV株而单独感染RGNNV的鱼作为对照组。
在本实施例中，FBV株接种后观察2周，求出死亡率，并在3天、7天、14天后测定肾脏和脑的RGNNV量。
其结果如图2所示，未接种FBV株的对照组的死亡率为80％，而预先接种有FBV株的鱼的死亡率为0％。
另外，如图3所示，在任一测定时，预先接种有ABV的鱼的肾脏和脑内的RGNNV量与对照组相比，均显著降低。此外，虽然数据中没有显示出来，但RGNNV在8周后从接种有FBV株的鱼的脑中消失。
综上所述，本发明的预防方法和治疗方法对广泛的鱼种来说，不仅对由野田村病毒感染引起的病毒性神经坏死症有效，而且对以野田村病毒感染为原因的其它感染症也有效。
另外，本发明的预防方法和治疗方法不仅可以口服给药，而且可以通过浸渍法给药，正因为如此，还具有对目前的疫苗治疗中无法做到的对鱼苗和幼鱼也能给药的效果。
另外，本发明的ABV的抗病毒作用因为是非特异性的，所以无论哪种血清型都可使用，因此，具有不需要像目前的疫苗治疗那样对鱼类野田村病毒的3个不同血清型制作每个血清型的疫苗的优点。
除此以外，通过本发明的水生双RNA病毒(ABV)的接种，还具有不仅对野田村病毒感染有预防效果，而且对野田村病毒隐性感染了的亲鱼等也可期待治疗效果的很大优点。
此外，在本发明的预防方法和治疗方法中，通过并用ABV和疫苗，不仅可以非特异性地防御，而且也可以诱导特异性防御。
除了上述优点以外，本发明不需要特别的装置等，所以本发明中使用的ABV的制备和给药所需要的经费也可以比现有的疫苗治疗大幅度地减少。
本发明的预防方法和治疗方法可以适用于广泛的鱼种的种苗生产和养殖。
权利要求
1.一种方法，其特征在于，通过将水生双RNA病毒对鱼给药，从而预防野田村病毒感染或由野田村病毒感染引起的疾病的发病或者治疗所述疾病。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述疾病为病毒性神经坏死症。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述水生双RNA病毒是通过注射或口服来给药的。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述口服给药是通过将鱼浸渍在含有所述水生双RNA病毒的溶液中或给鱼喂食混合有所述水生双RNA病毒的饲料来进行的。
5.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，在将所述水生双RNA病毒通过注射经皮给药时，所述水生双RNA病毒以相对于1ml注射液为约107～108TCID50的比例进行添加；在将所述水生双RNA病毒通过饲料喂食时，以相对于1g全饲料通常为约107～108TCID50的比例进行混合；或者，在将所述水生双RNA病毒通过浸渍给药时，以相对于1ml溶液通常为约105～106TCID50的比例进行混合。
全文摘要
本发明提供一种预防或治疗对鱼的由野田村病毒感染或由野田村病毒感染引起的病毒性神经坏死症等疾病的方法。通过给鱼注射等来经皮接种水生双RNA病毒，或者通过将鱼浸渍在含有水生双RNA病毒的溶液中或者通过喂食水生双RNA病毒混合饲料，从而防止鱼感染野田村病毒或预防由野田村病毒感染引起的病毒性神经坏死症等疾病的发病或者治疗所述疾病。
文档编号A23K1/18GK1960740SQ20058000922
公开日2007年5月9日 申请日期2005年3月23日 优先权日2004年3月24日
发明者中井敏博 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构