专利名称：用甘氨酸调节动物体重和体型的方法
本申请要求2004年11月2日申请的美国专利第60/624,228号的权益，该专利通过引用全部结合到本文中。
背景技术：
据估计，美国成年人中有60％符合认定为体重超重或临床肥胖的临床规定，导致每年300,000例的死亡。参见Eberhardt等，Urban andrural health chartbook.2001，Health，United States Hyattsville(MD)NCHS，第296页；General，The Surgeon General′s call to action toprevent and decrease overweight and obesity 2001，R.M.U.S.Department Health and Human Services，编辑，2001。2001年，美国卫生部长发出行动起来预防和减少超重或临床肥胖个体发生和流行的号召。The Surgeon General′s call to action to prevent and decreaseoverweight and obesity2001，R.M.U.S.Department Health and HumanServices，编辑，2001。有趣的是，在这份报告中并未提到应用或使用药物方法来解决这个问题。然而，企业和学术研究机构仍然对药物方法怀有极大的兴趣。药物方法之所以有吸引力，极有可能是因为易于应用和使用，顺应性较高。
世界各地的流行病学研究表明，死亡率与肥胖症的关联性不容置疑。最近50年，我们在有关预防和控制传染病、心脏病、糖尿病和某些癌症，以实现我们的健康目标方面所取得的进步，很大程度上被肥胖症的日渐流行所抵消掉。2001年，约25％的儿童和青少年体重超重，是仅仅20年前这一百分比的两倍以上。目前仅在美国，就发现超过60％的成人体重超重或肥胖，每年超过300,000例的死亡可能直接归咎于这些疾病。这些发现涉及所有种族、年龄、族群和性别，虽然某些族群，尤其是少数民族和社会经济状况较低的群体，明显比其他群体更易发生体重超重或肥胖。The Surgeon General′s callto action to prevent and decrease overweight and obesity2001，R.M.U.S.Department Health and Human Services，编辑，2001。
体重超重(由体重指数(body mass index)(BMI范围介于25-29.9kg/m2)确定)和肥胖症(BMI＞30kg/m2)，与过早死亡、II型糖尿病、心脏病、中风、高血压、胆囊病、骨关节炎、睡眠性呼吸暂停、哮喘、各种呼吸问题、某些癌症、高胆固醇血症(high blood cholesterol)、妊娠并发症、手术危险性增大、心理障碍(psychological disorder)和不胜枚举的其它病理症状相关。The Surgeon General′s call to action toprevent and decrease overweight and obesity2001，R.M.U.S.Department Health and Human Services，2001；NHLBI，Clinical guidelines on the identification，evaluation，and treatment ofoverweight and obesity in adults，N.NIH，1998，HHS，PHS，第29-41页。与BMI在正常范围(20-25kg/m2)的人相比，肥胖个体因所有这些病因引起过早死亡的风险增加50-100％。就眼前来说，即使体重适度减轻(总体重超出5-15％)也会减少至少某些这类疾病，特别是心脏病的风险因子。NHLBI，Clinical guidelines on the identification，evaluation，and treatment of overweight and obesity in adults，N.NIH，1998，HHS，PHS，第29-41页。现已有证据表明该作用还可能使人长期受益。参见NIDDK，Study of health outcomes of weight-loss(SHOW)trial，NIDDK，2001，National Institutes of Health，U.S.A.，出处同上。
美国卫生部长在2001发起行动起来预防和减少体重超重和肥胖症的号召中强调，过去几十年里美国人的生活方式发生了明显改变，越来越依赖营养差的食物源和日益久坐不动的生活方式。行动号召的主要内容是促进学校和社区教育，倡导健康饮食和经常性的适当运动。就此而言，目前的进展很可能是让绝大多数的美国人对这一重要信息有至少粗略的认识。然而，目前肥胖症的趋势并未显示出有减慢的迹象，事实上，随时间推移，预计情况还将恶化。显然，要克服的主要障碍是需要全民顺应根据指导方针中有关饮食和运动的要求，前景并不明朗。
美国卫生部长在2001年报告的一个有趣的特点是基本上没有提及预防和治疗体重超重和肥胖症的药物方法。显然，这是学术机构和企业都十分关注的领域，因为这种方法可能降低对患者顺应性的要求。近年来，从调节能量贮存和作为分泌细胞的观点出发，在了解脂肪组织的作用和功能方面都取得了重大进步(有关综述参见Frayn等，Integrative physiology of human adipose tissue；Int J Obes RelatMetab Disord，2003，27(8)，第875-88页)。所出现的情况十分复杂，因为它涉及自主神经系统的活性，底物与激素复杂混合物的递送，由脂肪细胞分泌的自分泌效应器和旁分泌效应器的反馈，还有与脂肪组织的血管分布等。同样，脂肪细胞所分泌的瘦蛋白和脂连蛋白等因子，对总代谢也有普遍的作用。参见Guerre-Millo，Adipose tissuehormones.J Endocrinol Invest，2002，25(10)855-61；Kishida，Disturbedsecretion of mutant adiponectin associated with the metabolic syndrome.Biochem Biophys Res Commun，2003，306(1)286-92；Miner，Theadipocyte as an endocrine cell.J Anim Sci，2004，82(3)935-41；Rabin等，Adiponectinlinking the metabolic syndrome to its cardiovascularconsequences.Expert Rev Cardiovasc Ther，2005，3(3)465-71；Houseknecht等，The biology of leptina review.J Anim Sci，1998，76(5)1405-20；Mantzoros，The role of leptin in human obesity and diseaseareview of current evidence.Ann Intern Med，1999，130(8)671-80。
据此，显而易见的是需要一个十分完整和综合性的方法，全面了解上述超重和肥胖现存问题形成基础的正常及病理状态。
许多类型的动物用于研究、农业和陪伴。某些情况下，饲养这些动物的成本很高。饲养体型较小的动物比饲养正常体型的动物可能花费要少一些。因此，用于产生体型减小的动物和/或体重减轻的动物的组合物和方法可具有优势。同样，陪伴动物的肥胖症也是一个问题。肥胖症可使动物寿命缩短，并引起许多与人类相同的上述疾病和症状。
发明概述本发明一个实施方案提供诱导动物脂肪组织细胞凋亡的方法，该方法包括给予动物含约10％至约30％甘氨酸的高甘氨酸饮食。高甘氨酸饮食可包含甘氨酸、甘氨酸类似物或甘氨酸与甘氨酸类似物的组合。
本发明另一个实施方案提供减少动物脂肪组织的方法，该方法包括给予动物含约10％至约30％甘氨酸的高甘氨酸饮食。
本发明又一个实施方案提供减少动物脂肪组织中BAD 136位氨基酸磷酸化的方法，该方法包括给予动物含约10％至约30％甘氨酸的高甘氨酸饮食。
本发明再一个实施方案提供使动物脂肪细胞缩小的方法，该方法包括给予动物含约10％至约30％甘氨酸的高甘氨酸饮食。
本发明还有一个实施方案提供减少动物腹部脂肪含量的方法，该方法包括给予动物含约10％至约30％甘氨酸的高甘氨酸饮食。
本发明另一个实施方案提供使动物体重减轻的方法，该方法包括给予动物含约10％至约30％甘氨酸的高甘氨酸饮食。该方法还可包括体重减轻辅助疗法，例如运动方案、低脂饮食、低热量饮食、低糖饮食、手术干预、行为疗法、药物疗法或它们的组合。
本发明又一个实施方案提供使动物体型减小或体重减轻，然后使之回复到正常体型的方法。该方法包括给予未成年动物高甘氨酸饮食，以产生体型减小或体重减轻的动物，然后给予动物正常饮食，以产生正常体型或正常体重的动物。
本发明再一个实施方案提供产生体型减小或体重减轻的动物的方法，该方法包括给予未成年动物高甘氨酸饮食，以产生体型减小或体重减轻的动物。
本发明还有一个实施方案提供用于使动物体重减轻的饮食组合物，该组合物包含约10％至约30％甘氨酸、甘氨酸类似物或其组合，以及约70％至约90％的低热量饮食。
本发明另一个实施方案提供用于使动物体重减轻的饮食组合物，该组合物包含约10％至约30％甘氨酸、甘氨酸类似物或其组合，以及约70％至约90％的低脂饮食。低脂饮食可以是低饱和脂肪饮食。
本发明又一个实施方案提供用于使动物体重减轻的饮食组合物，该组合物包含约10％至约30％甘氨酸、甘氨酸类似物或其组合，以及约70％至约90％的低糖饮食。
本发明另一个实施方案提供产生体型减小或体重减轻或者既体型减小又体重减轻的动物的方法，该方法包括给予未成年动物含约10％至约30％甘氨酸的高甘氨酸饮食。
本发明再一个实施方案提供体内或体外诱导白色脂肪细胞凋亡的方法，该方法包括给予所述脂肪细胞一种或多种甘氨酸类似物或甘氨酸与甘氨酸类似物的组合。
本发明还有一个实施方案提供体内或体外减少白色脂肪细胞BAD 136位氨基酸磷酸化的方法，该方法包括给予所述脂肪细胞一种或多种甘氨酸类似物或甘氨酸与甘氨酸类似物的组合。
附图简述
图1表示5％甘氨酸饮食、20％甘氨酸饮食和未补加饮食对成年雄性Fisher大鼠体重的影响。
图2表示5％甘氨酸饮食、20％甘氨酸饮食和未补加饮食对成年雄性Fisher大鼠腹部脂肪含量的影响。
图3表示5％甘氨酸饮食、20％甘氨酸饮食和未补加饮食对成年雌性Fisher大鼠体重的影响。
图4表示5％甘氨酸饮食、20％甘氨酸饮食和未补加饮食对成年雌性Fisher大鼠腹部脂肪含量的影响。
图5表示5％甘氨酸饮食、20％甘氨酸饮食和未补加饮食对成年雄性Fisher大鼠食物消耗的影响。
图6表示20％甘氨酸饮食和未补加饮食对雄性ZDF大鼠体重的影响。
图7表示20％甘氨酸饮食和未补加饮食对ZDF大鼠腹部脂肪含量的影响。
图8表示5％、10％、15％和20％甘氨酸饮食和未补加饮食对雌性Sprague-Dawley大鼠体重的影响。
图9表示5％、10％、15％和20％甘氨酸饮食及未补加饮食对Sprague-Dawley大鼠食物消耗的影响。
图10表示5％、10％、15％和20％甘氨酸饮食及未补加饮食对雌性Sprague-Dawley大鼠腹部脂肪含量的影响。
图11A-B表示白色脂肪组织和褐色脂肪组织BAD 136位酪氨酸的磷酸化。
图11A第1泳道分子量标准参照物；第2泳道Akt-磷酸化BAD，作为阳性对照；第3泳道对照大鼠磷酸化BAD；第4泳道5％甘氨酸饮食喂食大鼠的磷酸化BAD；第5泳道20％甘氨酸饮食喂食大鼠的磷酸化BAD。
图11B第1泳道Akt-磷酸化BAD，作为阳性对照；第2泳道对照大鼠的磷酸化BAD；第3泳道5％甘氨酸饮食喂食大鼠的磷酸化BAD；第4泳道20％甘氨酸饮食喂食大鼠的磷酸化BAD。
图12表示高甘氨酸饮食处理的Sprague-Dawley大鼠中肝组织BAD的磷酸化。第1泳道Akt-磷酸化BAD，作为阳性对照；第2泳道对照大鼠的磷酸化BAD；第3泳道5％甘氨酸饮食喂食大鼠的磷酸化BAD；第4泳道15％甘氨酸饮食喂食大鼠的磷酸化BAD。
图13表示高甘氨酸饮食处理的Sprague-Dawley大鼠中肌肉组织BAD的磷酸化。第1泳道分子量标准参照物；第2泳道Akt-磷酸化BAD，作为阳性对照；第3泳道对照大鼠的磷酸化BAD；第4泳道5％甘氨酸饮食喂食大鼠的磷酸化BAD；第5泳道5％甘氨酸饮食喂食大鼠的磷酸化BAD；第6泳道15％甘氨酸饮食喂食大鼠的磷酸化BAD。
图14表示从对照动物脂肪组织获得并用Cy3荧光团标记蛋白质的双标记实验结果。
图15表示用Cy3荧光团标记蛋白质的双标记实验结果，蛋白质得自20％甘氨酸饮食处理动物的脂肪组织。黄色圈表示相对于对照的减量调节，而红色圈表示增量调节，通过肉眼观察可分辨。
图16A-B表示甘氨酸定量LC/MS法的代表性结果。
图16A上方描迹图为分别在78.125 pM柱中获得的甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和亮氨酸复合TIC(总离子电流)。中间描迹图为提取甘氨酸的TIC色谱图。下方描迹图为用复合波长在PDA(光二极管阵列)监测下所获得的描迹图。
图16B表示当用提取甘氨酸的TIC峰下面积来绘制校准曲线时，所绘制的甘氨酸标准曲线。在各校准水平下，重复注入三次，以绘制校准曲线。
图17表示(同位素亲和标签)步骤。
图18表示未成年雌性大鼠体重对甘氨酸的剂量反应。
图19表示未成年雌性大鼠体长对甘氨酸的剂量反应。
图20表示未成年雄性大鼠体重对甘氨酸的剂量反应。
图21表示未成年雄性大鼠体长对甘氨酸的剂量反应。
发明详述现已发现当甘氨酸这一普通氨基酸加入实验动物的饮食中时，具有引起剂量依赖性体重减轻的作用。已经在多个啮齿动物品系和狗中观察到这种作用。延长给药期间，在最理想的剂量、甚至超出最理想剂量时，都没有观察到毒副作用。甘氨酸是非必需氨基酸，大多数哺乳动物从糖酵解途径产生的，作为正常中间代谢成分的丝氨酸合成。它是一种其天然或衍生形式都受到广泛深入研究的化合物，这与它在一些精神障碍、尤其是精神分裂症的起源和潜在治疗中的功能有关(参见例如Waziri和Baruah，A hyperglycinergic rat modelfor the pathogenesis of schizophreniapreliminary findings.SchizophrRes，1999，37(3)205-15；Waziri，Glycine therapy of schizophrenia.BiolPsychiatry，1988，23(2)210-1；Waziri，Glycine therapy of schizophreniasome caveats.Biol Psychiatry，1996，39(3)155-6；Javitt，Glycine therapyof schizophrenia.Biol Psychiatry，1996，40(7)684-6；Javitt，Glycine modulators in schizophrenia.Curr Opin Investig Drugs，2002，3(7)1067-72；Shoham等，Chronic high-dose glycine nutritioneffects onrat brain cell morphology.Biol Psychiatry，2001，49(10)876-85；Javitt，Management of negative symptoms of schizophrenia.Curr PsychiatryRep，2001，3(5)413-7；Shoham等，High dose glycine nutritionaffects glial cell morphology in rat hippocampus and cerebellum.Int JNeuropsychopharmcol，1999，2(1)35-40；Shoham等，Glycine and D-cycloserine attenuate vacuous chewing movements in a rat model oftardive dyskinesia.Brain Res，2004，1004(1-2)142-7；Tuominen等，Glutamatergic drugs for schizophreniaa systematic review and meta-analysis.Schizophr Res，2005，72(2-3)225-34)。在某些报告中，发现给予甘氨酸的作用小，但却对试验动物或受试者的体重有明显影响，不过这一观察结果从未成为研究课题或做进一步分析。这可能是因为所观测到的作用相对较小，无疑这是由于在这些研究中，浓度和暴露在甘氨酸中所用的时间，一般都低于我们发现的用于显著或明显减轻体重的浓度和时间。Petzke等(1987)曾报告，与其它氨基酸、糖和脂肪相比，甘氨酸具有相对高的产热作用，这与耗氧量增加有关。Petzke和Albrecht，[The effect of nutrition on the metabolismof glycine].Nahrung，1987，31(2)157-72；Petzke等，Utilization of[1-14C]carbon of glycine of high glycine diet fed young and old rats，Zfa，1987，42(6)第323-8页；Petzke等，[The effect of oral administrationof glycine on metabolism].Nahrung，1987，31(3)第207-15页。Petzke研究小组观察到实验大鼠的生长呈剂量依赖性减慢，但却无法提供可能机制的生化基础。除了重现这一发现(如下所述)外，我们还证实在动物饮食中补充甘氨酸时，成年动物表现出剂量依赖性的体重减轻。甘氨酸或甘氨酸类似物可用于对抗肥胖症且无可观察得到的毒副作用。此外，甘氨酸可能以迄今尚未被认识的途径，发挥诱导细胞凋亡(尤其是脂肪细胞凋亡)的作用。
甘氨酸和甘氨酸类似物甘氨酸是无毒氨基酸，易得到。甘氨酸、甘氨酸类似物或其组合可用于本发明的方法中。可以使用在脂肪细胞(例如白色脂肪细胞)直接或间接诱导细胞凋亡的任何甘氨酸类似物。在本发明的一个实施方案中，甘氨酸类似物可包括下式I的化合物 式I例如，式I中R1和/或R2可以为H；R1和/或R2可以为Me、Et或Pr；R1和/或R2可以为Bn；R1和/或R2可以为(CH2)2-5；式I化合物可通过例如以下流程合成 其它甘氨酸类似物可包括下式II的化合物 式II例如，式II中R1和/或R2可以为H；R1和/或R2可以为Me、Et或Pr；
R1和/或R2可以为Bn；R1和/或R2可以为(CH2)2-5；式II化合物可通过例如以下流程合成 本发明另一个实施方案中，甘氨酸类似物可包括下式III的化合物 式III式III中R1和/或R2可以为H，R3可以为H、Me、Et、Pr或Bn；R1和/或R2可以为Me、Et或Pr，R3可以为Me、Et、Pr或Bn；R1可以为H；R2可以为Bn或Me，R3可以为Me、Et、Pr或Bn；R1和/或R2可以为(CH2)2-5或Me，R3可以为Me、Et、Pr或Bn。
式III化合物可通过例如以下流程合成 高甘氨酸饮食“高甘氨酸饮食”是甘氨酸或甘氨酸类似物或其组合含量高，或者高剂量的甘氨酸补充剂、甘氨酸类似物补充剂或其组合的饮食。在本发明的一个实施方案中，甘氨酸类似物或与甘氨酸组合的甘氨酸类似物产生的生理作用与仅给予含甘氨酸饮食所产生的生理作用几乎相同。也就是说，甘氨酸类似物或甘氨酸与甘氨酸类似物的组合在动物体内产生甘氨酸的生理浓度，与当甘氨酸以高甘氨酸饮食给予动物时动物体内甘氨酸的生理浓度几乎相同。在某些情况下，可以按比仅有甘氨酸低的百分比，给予甘氨酸类似物或与甘氨酸组合的甘氨酸类似物，以达到与单独使用甘氨酸时的相似作用。例如，可以按占饮食重量的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％以上给予甘氨酸类似物或与甘氨酸组合的甘氨酸类似物。
甘氨酸和甘氨酸类似物可以混合于饮食中或通过其它途径给予。补充剂可以为液体、半固体、固体或任何其它的形式。高甘氨酸饮食含约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％(重量)以上的甘氨酸、甘氨酸类似物或其组合。在本发明的一个实施方案中，高甘氨酸饮食可含约5％至约40％以上，约10％至约40％；约10％至约30％；约15％至约25％；或者约20％至约25％的甘氨酸或甘氨酸类似物或其组合。
本发明还提供用于使动物体重减轻的饮食组合物，该组合物包含约5％至约40％以上，约5％至约40％；约10％至约30％；约15％至约25％；或者约20％至25％的甘氨酸、甘氨酸类似物或其组合(即约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％(重量)以上的甘氨酸、甘氨酸类似物或其组合)，以及约60％至约95％(即约95％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、75％、70％、65％或60％)的低热量饮食。
本发明还提供用于使动物体重减轻的饮食组合物，该组合物包含约5％至约40％以上；约10％至约40％以上；约10％至约30％；约15％至约25％或者约20％-25％的甘氨酸、甘氨酸类似物或其组合(即约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％(重量)以上的甘氨酸、甘氨酸类似物或其组合)，以及约60％至约95％(即约95％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、75％、70％、65％或60％)的低脂饮食。低脂饮食可以是低饱和脂肪饮食。
本发明还提供用于使动物体重减轻的饮食组合物，该组合物包含约5％至约40％以上；10％至约40％以上；约10％至约30％；约15％至约25％或者约20％-25％的甘氨酸、甘氨酸类似物或其组合(即约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％(重量)以上的甘氨酸、甘氨酸类似物或其组合)，以及约60％至约95％(即约95％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、75％、70％、65％或60％)的低糖饮食。
本发明的方法给予雄性或雌性动物(例如人)高甘氨酸饮食，可以诱导动物脂肪组织，特别是白色脂肪组织细胞凋亡。因此，高甘氨酸饮食可以减少动物的脂肪组织或使脂肪细胞缩小或者既减少脂肪组织又使脂肪细胞缩小。本发明的方法包括给予动物高甘氨酸饮食，以诱导动物脂肪组织细胞凋亡，减少脂肪组织，使脂肪细胞缩小，或者既减少脂肪组织又使脂肪细胞缩小。
虽然不希望受具体理论的束缚，但是相信脂肪组织中细胞凋亡的诱导是由甘氨酸的直接或间接作用所引起的。所观察到的这种饮食对BAD(Bcl-2家族的一个促细胞凋亡成员)的影响，支持这一作用机制。BAD促进细胞死亡的能力受到136位磷酸化的抑制。给予高甘氨酸饮食能降低或消除脂肪组织中BAD 136位的磷酸化，表明当给予高甘氨酸饮食或其等同物时，所观察到的脂肪组织减少是通过诱导细胞凋亡而产生的。
在饮食中(即口服)或通过其它给予方式给予高浓度的甘氨酸，可减少动物腹部的脂肪含量。此外，可在饮食中或可通过其它给予方式给予动物甘氨酸使动物体重减轻。然而，刚开始给予补充了甘氨酸的饮食时，会发现体重增加。虽然不希望受任何具体理论的束缚，但是相信这一发现可能是脂肪组织减少和肌肉组织增加的结果。
本发明的方法和组合物可用于产生体型减小和/或体重减轻的动物。例如，该动物比正常体型的动物小约3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或75％，或者比正常体重的动物轻约3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或75％。正常体型或正常体重的动物是考虑年龄或一般健康状况的情况下，体重或体型在该动物种类平均或典型的体重或体型范围内的动物。
本发明提供用于产生体型减小，或体重减轻，或者既体型减小又体重减轻的动物的方法，该方法包括给予动物高甘氨酸饮食。对于体型减小的动物，用高甘氨酸饮食饲喂未成年动物。可以在每日基础上，给予高甘氨酸饮食。动物可以为例如人、非人类灵长类、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、马、鸟或鱼。
本发明还提供用于产生上述体型减小的动物，然后又使动物回复到正常体型的方法。该方法包括给予未成年动物高甘氨酸饮食，以产生体型减小的动物，然后给予动物正常饮食，以产生正常体型的动物。正常饮食是未补充甘氨酸，但甘氨酸含量正常的饮食。
本发明还提供用于产生体重减轻的动物，然后使动物回复到正常体重的方法，该方法包括给予成年或未成年动物高甘氨酸饮食，以产生体重减轻的动物，然后给予动物正常饮食，以产生正常体重的动物。
本发明再有一个实施方案提供通过给予未成年动物产生永久性体型减小或永久性体重减轻的动物高甘氨酸饮食，以产生永久性体型减小和/或永久性体重减轻的动物的方法。给予高甘氨酸饮食可贯穿动物整个生存期，或直到进一步生长被正常情况下与生长停止有关的生理过程阻止。
本发明的方法和组合物还可用于使动物例如未成年或成年动物体重减轻。体重减轻可达约3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或75％。
本发明的一个实施方案提供用于使动物体重减轻的方法，该方法包括给予动物上述高甘氨酸饮食。动物可以为例如人、非人类灵长类、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、马、鸟、鱼或无脊椎动物。在本发明的一个实施方案中，动物身体健康，没有潜在健康问题。在本发明的另一个实施方案中，动物只有超重或肥胖的健康问题，并无其它健康问题。
可给予高甘氨酸饮食并辅以体重减轻疗法，例如运动方案、低脂饮食、低热量饮食、低糖饮食、手术干预例如胃成形术、分胃术以及胃旁路术、行为疗法、药物疗法(例如使用西布曲明、MERIDIA(盐酸西布曲明一水合物)、XENICAL(奥利司他)及其组合)、天然饮食辅佐或非处方(OTC)减肥产品及其组合。
低脂饮食是在特定年龄、体重和一般健康状况下，饮食中的脂肪含量比特定动物种类饮食中正常推荐的脂肪含量低约3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的饮食。例如，人用低脂饮食可包含由约0％、3％、5％、7％、10％、13％、15％、20％或25％脂肪所组成的饮食。
低热量饮食是在特定年龄、体重和一般健康状况下，饮食中包含的热量比某种动物种类正常推荐的热量低约3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的饮食。
低糖饮食是在特定年龄、体重和一般健康状况下，饮食中的糖含量比某种动物种类正常推荐的糖含量低约3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的饮食。
行为疗法包括有助于克服饮食疗法和/或运动疗法顺应性障碍的策略。这些策略包括例如饮食习惯和运动自我监控、应激处理(stress management)、刺激控制(stimulus control)、问题解决(例如自我修正与饮食和运动有关的问题))、突发事件处理(contingency management)(例如运用特定的恰当行动奖赏)、认知重建(例如修正不切实际的目标和错误信仰)和社会支持。
甘氨酸和甘氨酸类似物可用含有常规无毒的药学上可接受的载体、辅剂和/或溶媒的制剂，通过例如口服、局部、肠胃外给予，通过吸入或喷雾给予，或者经直肠给予。本文所用术语肠胃外包括经皮、皮下、血管内(例如静脉内)、肌内或鞘内注射或输注技术等。此外，甘氨酸和甘氨酸类似物可与药学上可接受的载体联用。甘氨酸和甘氨酸类似物可与一种或多种无毒的药学上可接受的载体、赋形剂、着色剂、防腐剂、矫味剂、稀释剂、辅剂或它们的组合，以及其它活性成分(如果需要)联合使用。甘氨酸和甘氨酸类似物可以是适于口服用的任何形式，例如片剂、含片剂、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散散剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊剂或软胶囊剂，或者糖浆剂或酏剂。
本发明另一个实施方案提供体内或体外诱导白色脂肪细胞凋亡的方法，该方法包括给予所述脂肪细胞一种或多种甘氨酸类似物或甘氨酸与甘氨酸类似物的组合。
本发明又一个实施方案提供体内或体外减少白色脂肪细胞中BAD 136位氨基酸磷酸化的方法，该方法包括给予所述脂肪细胞一种或多种甘氨酸类似物或甘氨酸与甘氨酸类似物的组合。
甘氨酸可按约5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、750μg/ml、1000μg/ml以上的浓度加入到脂肪细胞中。
本文中不论何处所提及的所有专利、专利申请和其它科技文献都通过引用全部结合到本文中。本文对本发明作示例性描述，可在不存在本文任何未具体公开的要素或限制时，适当地实施本发明。因此，例如，在本文任何情况下，任一术语“包含(含)”、“基本上由......组成”和“由......组成”可被其它两个术语中的任一个替换，而又保持它们的通用含义。所使用的术语和表达方式作为描述性的而非限制性的，而且在使用这些术语和表达方式时，并不排除所写明和记载的特征或特征部分的任何等同特征或特征部分，但是要了解，各种修改都可能落入本发明要求保护的范围内。因此，应当知道，虽然通过实施方案、任选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员若借助本文所公开的构思作出修改和变化，这些修改和变化也被认为落入本发明说明书和所附权利要求书限定的范围内。
另外，当按照马库什要素或其它可选择要素描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员能理解，马库什要素或其它要素中的各成员或各成员组同样为本发明的组成部分。
实施例实施例1大鼠随机分组，单独关入笼内，自由饮水，按规定进食TD 80406饮食(Harlan Teklad，Madison，Wisconsin)。饮食组合物见表1。TD 80406饮食含有约1-2％的甘氨酸(存在于乳清蛋白组分中)并被视为未补加饮食。
表1.
将成年(180日龄)雄性Fisher大鼠随机分成每组10只大鼠的处理组，喂食含5％甘氨酸或20％甘氨酸的饲料或者未补加饮食。见
图1。在所示研究日测出动物和食物重量。进行测重量的分析人员并不了解有关他们所观察记录的动物的饮食情况。竖线条表示在所示观察日各组大鼠体重的±1标准误差。经统计，在14-30天的处理期内，喂食20％甘氨酸饮食的大鼠比喂食5％甘氨酸饮食或未补加甘氨酸饮食的大鼠轻。第30天起，当喂食20％甘氨酸饮食的大鼠转用未补加饮食喂食时，它们的体重快速增加，而且它们的体重变得与喂食未补加饮食大鼠体重相似。自研究的第32天后，对照组动物的体重与20％甘氨酸组动物的体重无统计学上的差异。
从各处理组随机选取五只大鼠，在研究的第30天使之安乐死。尸体剖检后，测出各大鼠的腹部脂肪含量(图2)。进行测量的分析人员不了解有关他们所观察记录的动物的处理组别情况。数据用单向方差分析法(One-Way Analysis of Variance)进行分析，用Dunnett多重比较检验(Dunnett’s Multiple Comparison Test)进行事后分析(post-hocanalysis)。喂食20％甘氨酸饮食大鼠的腹部脂肪，统计学上显著少于喂食5％甘氨酸饮食或未补加饮食大鼠的腹部脂肪。
对雌性成年(180日龄)Fisher大鼠进行了同样实验。除对于体重减轻和腹部脂肪含量两方面，甘氨酸的作用实际上在雌性中比在雄性中更加明显以外，所得结果基本相似(图3和图4)。值得注意的是，在恢复期结束时，处理雌性大鼠体重没有反弹至对照动物的水平，所观测到的腹部脂肪减少大于所观测到的雄性腹部脂肪减少。整个实验过程中，未发现组间食物或水的消耗量有显著性差异。
在所示研究日测出食物消耗。见图5。这些数据表明所观测到的体重减轻并不是因为食物摄取减少而引起热量受限的结果。此外，观测到的体重减轻也不是食物热量含量减少的结果，因为饮食是通过弹式量热法进行分析的(见表2)，所得结果在热量含量上无显著性差异。
表2补充了规定甘氨酸含量的TD 80406饮食(Harlan Teklad，Madison，Wisconsin)的热量含量
从接受研究的大鼠尾静脉中抽取血样，送到Charles River实验室进行多项分析物特征测试(Mutli-Analyte Profile testing)。这些测试结果表明，喂食高甘氨酸饮食的大鼠显示其血清甘油三酯、HDL和胆固醇水平，统计学上都有显著性(p≤0.05)降低。这些结果与文献中其他研究人员进行的甘氨酸研究结果一致。参见Hafidi等，Glycineintake dedecreases plasma free fatty acids，adipose cell size，and bloodpressure in sucrose-fed rats.Am J Physiol Regul Integr CompPhysiol，2004，287(6)R1387-93；Aust等，The hypolipaemic action ofa glycine rich diet in rats.Nahrung，1980，24(7)663-71；Sugiyama等，Dietary sulfur-containing amino acids and glycine as determinant factorsin plasma cholesterol regulation in growing rats.J Nutr Sci Vitaminol(Tokyo)，1985，31(1)121-5；Senthilkumar等，Glycine modulates hepaticlipid accumulation in alcohol-induced liver injury.Pol J Pharmacol，2003，55(4)603-11；Park等，Dietary taurine or glycine supplementation reducesplasma and liver cholesterol and triglyceride concentrations in rats fed acholesterol-free diet.Nutrition Research，1999，19(12)1777-1789；Yoshida等，Effects of addition of arginine，cystine，and glycine to thebovine milk-simulated amino acid mixture on the level of plasma and livercholesterol in rats.J Nutr Sci Vitaminol(Tokyo)，1988，34(6)567-76；Olson等，Effect of amino acid diets upon serum lipids in man.Am J ClinNutr，1970，23(12)1614-25；Ryzhenkov等，[Hypolipidemic activityof glycine and its derivatives].Vopr Med Khim，1984，30(2)78-80；Yagasaki等，Effects of dietary methionine，cystine，and glycine onendogenous hypercholesterolemia in hepatoma-bearing rats.J Nutr SciVitaminol(Tokyo)，1986，32(6)643-51；Emi等，Missense mutation(Gly----Glu188)of human lipoprotein lipase imparting functionaldeficiency.J Biol Chem，1990，265(10)5910-6。研究发现瘦蛋白水平降低趋于明显，这是当白色脂肪组织(WAT)减少时可预料到的。研究发现脂连蛋白水平以趋于明显的方式增加，这是当WAT减少时可预料到的。数据证实，高甘氨酸饮食对肥胖症致病性的这些生物标志有着积极的作用。
实施例2将成年雄性Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠随机分成每组3只大鼠的处理组，喂食含20％甘氨酸的饲料或未补加饮食。ZDF大鼠患有肥胖症、高脂血症、胰岛素抵抗。在所示研究日测出重量。见图6。进行测体重的分析人员并不了解有关他们所观察记录的动物的饮食情况。竖线条表示所示观测日各组大鼠体重的±1标准误差。数据用单向方差分析法进行分析，用Dunnett多重比较检验进行事后分析。从研究的第15天至研究的第36天，喂食20％甘氨酸饮食的大鼠相对于喂食未补加饮食的大鼠，体重在统计学上有显著减轻。同样，未观测到组间食物消耗有差异。尸体剖检后，测出各大鼠的腹部脂肪含量(图7)。喂食20％甘氨酸饮食的大鼠腹部脂肪，在统计学上显著(p≤0.05)少于喂食5％甘氨酸饮食或未补加饮食的大鼠腹部脂肪。
实施例3将成年雌性Sprague-Dawley大鼠随机分成每组3只大鼠的处理组，喂食含5％、10％、15％或20％甘氨酸的饲料或未补加饮食。见图8。在所示研究日测出体重。进行测体重的分析人员并不了解有关他们所观察记录的动物的饮食情况。竖线条表示所示观测日各组大鼠体重的±1标准误差。喂食20％甘氨酸饮食大鼠体重小于喂食未补加饮食大鼠体重。数据用单向方差分析法进行分析，用Dunnett多重比较检验进行事后分析。从研究的第15天至第36天，喂食20％甘氨酸饮食大鼠体重，相对于喂食未补加饮食的大鼠，统计学上有显著的减轻。
实施例4将成年雌性Sprague-Dawley大鼠随机分成每组3只大鼠的处理组，喂食含5％、10％、15％或20％甘氨酸的饲料或未补加饮食。见图9。在所示研究日测出食物消耗量。进行测量的分析人员不了解有关他们所观察记录的动物的饮食情况。这些数据表明，观测到的体重减轻不是由于食物摄取减少而引起热量受限的结果。此外，观测到的体重减轻不是食物热量含量减少的结果，因为饮食是使用弹式量热法进行分析的(见表2)，所示结果在热量含量上没有显著性差异。
实施例5将成年雌性Sprague-Dawley大鼠随机分成每组3只大鼠的处理组，喂食含5％、10％、15％或20％甘氨酸的饲料或未补加饮食。在研究的第30天，给各处理组大鼠施行安乐死。尸体剖检后，测出各大鼠的腹部脂肪含量。见
图10。进行测量的分析人员不了解有关他们观察记录的动物的处理组情况。数据用单向方差分析法进行分析，用Dunnett多重比较检验进行事后分析。喂食含有所示5％-20％甘氨酸饮食大鼠的腹部脂肪，在统计学上显著少于喂食未补加饮食大鼠的腹部脂肪。
实施例6Sprague-Dawley大鼠，24日龄，喂食15％甘氨酸和85％TD80406的饮食。喂食含15％甘氨酸和85％TD80406饮食6周的动物在尸体剖检时，除体重外，未见肉眼损害或处理相关异常的报告。在喂食100％TD80406的对照动物与喂食含15％甘氨酸和85％TD80406饮食6周的动物之间，未观测到血液化学和全血细胞计数有差异。对喂食补充了高甘氨酸饮食所获得的动物组织进行了组织病理学检查。对于脑、肺、肝、肾上腺、肾、膀胱、心脏、胃、大肠或小肠，经剪碎、加工处理、包埋、切片及苏木精和伊红染色的组织镜检未显示有重大发现。简而言之，常规组织学的显微镜检无变化。
实施例7将成年雄性Prague-Dawley大鼠随机分成每组3只大鼠的处理组，喂食含5％或20％甘氨酸的饲料或未补加饮食。在研究的第20天，使动物安乐死，尸体剖检后，获取脂肪组织。从脂肪组织中提取总蛋白。为了证实从喂食高甘氨酸饮食大鼠中获得的脂肪组织经历细胞凋亡，对喂食对照或含甘氨酸饮食的动物提取物进行了BAD136位磷酸化能力的分析。见
图11A和
图11B，数据清楚表明白色脂肪组织(WAT)中，BAD 136位酪氨酸的磷酸化呈剂量依赖性降低，而褐色脂肪组织(BAT)中未观察到这种降低，这表明了高甘氨酸饮食导致白色脂肪组织的细胞凋亡。
图12和
图13清楚表明，分析从同一动物获得的肝组织(
图12)或肌肉(
图13)提取物时，未观察到BAD136位酪氨酸的磷酸化状态有这种降低。
数据清楚表明，BAD 136位酪氨酸的磷酸化呈剂量依赖性降低，这表示高甘氨酸饮食导致脂肪组织细胞凋亡。
按下述方法，对组织提取物中BAD 136位丝氨酸磷酸化的能力进行分析将1mg组织提取物加至BAD琼脂糖(Upstate，Waltham，MA)中。用RIPA缓冲液(含有抗磷酸酶和抗蛋白酶)(Tris-HCl[pH7.4]50mM；NP-401％；脱氧胆酸钠0.25％；NaCl 150mM；EDTA 1mM；PMSF 1mM；蛋白酶抑制剂(Protease Arrest)100ul；原钒酸钠1mM；氟化钠1mM)，调节反应体积至1ml，于30℃下孵育0.5小时。通过离心(12,000×g，5秒)收集琼脂糖珠。除去上清液，琼脂糖珠用冰冷的TBS洗涤3次。将BAD-琼脂糖重悬于40μl的样品缓冲液中，煮沸5分钟，离心(12,000×g，5分钟)。7微升样品进行15％凝胶(Tris-甘氨酸)电泳。通过蛋白质印迹法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，用5％NFM的TTBS溶液于4℃下振荡使之封闭。膜用2％NFM的TTBS溶液洗涤。室温下，各泳道与兔抗磷酸-BAD 136抗体在(1∶1000的2％NFM/TTBS)中转印2小时。印迹用TTBS洗涤3次5分钟。印迹与山羊抗兔-HRP(1∶5000的2％NFM/TTBS)一起孵育。印迹用TTBS洗涤3次5分钟，用TBS洗涤2次5分钟。用化学发光底物(PierceSuper-Signal SubstrateTM)使磷酸化BAD显现。
为了进一步阐明通过甘氨酸引发所观测到的生物学作用的作用机制，我们采用双向差示凝胶电泳(2D-DIGE)。2D-DIGE是一种有效的方法，使我们能快速评价不同生物学状态的组织中蛋白质组表达的差异。参见Patton，Detection technologies in proteome analysis.JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2002，771(1-2)3-31；Unlu等，Difference gel electrophoresisa single gel method for detectingchanges in protein extracts.Electrophoresis，1997，18(11)2071-7；VonEggeling等，Fluorescent dual colour 2D-protein gel electrophoresis forrapid detection of differences in protein pattern with standard imageanalysis software.Int J Mol Med，2001，8(4)373-7。
在准备即将进行2D-DIGE实验时，我们得到从对照(
图14)和20％甘氨酸处理(
图15)组织中提取蛋白质的双标记实验的初步结果。
图14表示用Cy3荧光团标记的、从对照动物脂肪组织获得的蛋白质。
图15表示用Cy5荧光团标记的、从20％甘氨酸饮食处理的动物脂肪组织中获得的蛋白质。黄色圈表示相对于对照的减量调节，而红色圈则表示增量调节，通过肉眼观测可分辨。
从喂食对照饮食或者补充20％甘氨酸(重量)饮食的雌性Sprague-Dawley大鼠中获取脂肪组织，对之进行2D-DIGE分析。组织样本在冰浴中用装有配备7X110 mini-Tip Reusable Generator Probes的PowerGen 125型FTH115匀浆器匀浆，根据试剂盒中提供的方案，用总蛋白提取(Total Protein Extraction(TPE))试剂盒(Genotech，92-Weldon Parkway，St.Louis，MO 63043-9989 U.S.A.)提取蛋白质。为了在提取过程中和用前存贮时使蛋白质降解最小化，所有缓冲液都含有蛋白酶抑制混合物(Protease Arrest Cocktail(Genotech，92-WeldonParkway，St.Louis，MO 63043-9989 U.S.A.))。用Bio Rad 2D纯化(cleanup)试剂盒(Cat.#163-2130)使提取的蛋白质沉淀，并重悬于Cy标记缓冲液(30mM Tris-HCl(pH8.5)、4％CHAPS、8M尿素)中。按照生产商的说明书，将从对照动物和处理动物获得的等量蛋白质(50ug)，分别用400pmol在DMF中稀释的Cy3或Cy5荧光团标记。标记反应在冰上避光进行30分钟，加入1mM赖氨酸而猝灭。使两种标记蛋白质与Biolyte两性电解质(Bio Rad cat.#163-1112)及再水化缓冲液(Bio Rad cat.#163-2083)相混合。然后，将混合物装入再水化的IPG胶条(Bio Rad Cat.#163-2099)中，室温下过夜。按照生产商的说明书，在Biorad Protean IEF凝胶装置中，使再水化IPG胶条中的蛋白质聚焦，在Bio Rad Protean Slab凝胶装置上，进行第二向电泳。分别采用535nm和620nm的激发滤光片和600nm和670nm的发射滤光片，凝胶中的Cy3和Cy5标记蛋白质用KODAK ImageStation 2000MM进行显现。
实施例8血液和组织(脂肪组织)中甘氨酸浓度精确含量的敏感性试验为了建立有关甘氨酸减少脂肪组织质量的药代动力学和药效动力学模型，需要精确地测量所给甘氨酸浓度的方法。理想的方法是能够跟踪除内源性甘氨酸外，所给予甘氨酸的吸收、分布、代谢和排泄(ADME)。此外，开发出来的方法应当能够易于改进以用于未来的甘氨酸类似物的研究。LC/MS法可用于此目的。该方法容许在研究中利用C13-甘氨酸，因此能够同时确定所给剂量的C13-甘氨酸及内源性甘氨酸的ADME。
简而言之，该方法包括样品纯化步骤，其中在LC/MS分析前，通过酸沉淀除去蛋白质和核酸污染物。在含有已知含量的甘氨酸/C13-甘氨酸的样品基质(即从未处理动物获得的血浆或经透析的组织提取物)的各项研究开始前，制备QC样品。将100μl血浆样品加入1.5ml棕色微量离心管中，再加入100μl冰冷的、含有1％偏磷酸的10％(体积/体积)高氯酸，离心管在冰浴中孵育10分钟后，4℃下，以12,000×g离心5分钟，完成对样品的酸沉淀。然后，使所得上清液通过0.2μm滤器过滤，在Savant SC110 Speedvac(或同等仪器)中真空干燥。进行分析之前，研究样品和QC样品贮存于-80℃下。分析前，使样品升温至室温，并在50μl去离子LC/MS级水(LC/MS-ddH2O)中重建，移至玻璃自动进样小瓶中，然后将小瓶装入Micro AS(Thermo Electron)自动进样器。通过ESI(电喷雾电离(Electro Spray Ionization))源，将各样品20μl注入与LCQ DECA XP离子阱质谱仪((Ion Trap MassSpectrometer)Thermo Electron Corp.))连接的检测仪串联HPLC系统(Surveyor Plus HPLC System(Thermo Electron Corp.))的50×2.1mmHypercarbTM柱(Thermo Electron Corporation)中。在20mM全氟戊酸的LC/MS-ddH2O溶液至15％乙腈的LC/MS-ddH2O溶液中梯度洗脱10分钟，然后再在26％乙腈的LC/MS-ddH2O溶液中洗脱10分钟，然后最终在50％乙腈的LC/MS-ddH2O溶液中洗脱10分钟，进行色谱分离。在下一次进样前，柱条件在最终的50％乙腈和20mM全氟戊酸的LC/MS-ddH2O溶液中保持10分钟，之后转至100％20mM全氟戊酸的LC/MS-ddH2O溶液中5分钟。
图16表示有代表性的色谱图和用于定量测定甘氨酸的标准曲线。用已知的含有24种普通氨基酸的标准样装入柱中，并用选择性离子监测法(Selective Ion Monitoring(SIM))，获得有关甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和亮氨酸的数据。结果清楚表明，在所述研究中对于预期的目的，试验具备了必要的灵敏度。用C13-甘氨酸的试验可更加精确有效。
实施例9高剂量甘氨酸的单剂量药代动力学特征和口服生物利用度下面的实验设计可用于测定甘氨酸的药代动力学特征和口服生物利用度。可使用有外科手术植入的颈静脉导管，重量在200-225g之间的成年(180日龄)Sprague-Dawley大鼠(来自Charles River实验室)。将18只大鼠随机分成3组，每组6只大鼠(3只雄性，3只雌性)，并分别随机分配到三个剂量组高(5mg/kg)、中(2.5mg/kg)和低(0.25mg/kg)。喂食含20％甘氨酸(重量)饮食的雄性ZDF大鼠，在禁食24小时后，尸体剖检后，获得血浆样品，初步分析显示甘氨酸水平为16.9μg/mL。动物禁食之前，实际稳定状态的甘氨酸水平可能略高。我们选择的剂量会导致血浆甘氨酸水平的峰值～150μg/ml(高剂量组)、75μg/ml(中等剂量组)及7.5μg/ml(低剂量组)。将甘氨酸溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，pH 7.2，先通过IV推注给予。在下述时间点，抽取血浆样品(0.1ml)注入装有柠檬酸盐(BD#363080)的浅蓝色top vacutainer管中T＝0分钟、T＝0.5分钟、T＝1分钟、T＝5分钟、T＝15分钟、T＝30分钟、T＝1小时、T＝2小时、T＝4小时、T＝8小时、T＝16小时、T＝24小时和T＝48小时。将各时间点收集的各血浆在液氮中速冻，分析前贮存于-80℃下。使动物恢复7天时间，再次称重，然后用经口管饲法给予高、中和低剂量的甘氨酸。在以下时间点，按前述用于IV推注给药的方法，抽取血浆样品0.1ml至浅蓝色有盖的vacutainer管中T＝0分钟、T＝30分钟、T＝1小时、T＝2小时、T＝4小时、T＝6小时、T＝8小时、T＝16小时、T＝24小时、T＝48小时、T＝72小时和T＝96小时。将各时间点收集的各个血浆在液氮中速冻，分析前贮存于-80℃下。数据用WinNonlin4.1版软件进行分析，该软件用于药代动力学分析。从这些实验中得到的药代动力学模型将用于设计多剂量方案，供随后的实验使用。此外，这个模型可作为基础模型，用于筛选类似物，以进行进一步的开发。
实施例10甘氨酸的多剂量药代动力学在我们的初步研究中，口服给予甘氨酸作为试验动物正常饮食的一部分。这种给药方法无法提供所给剂量的精确性和重现性，这对于建立有关甘氨酸诱导脂肪组织细胞凋亡的作用的药效动力学模型是必需的。为了进行这项工作，我们必须开发一种剂量方案，以使我们能够精确地反映所观测到的药理作用(即诱导脂肪组织细胞凋亡)。我们在阐释高剂量甘氨酸的单剂量药代动力学特征和口服生物利用度的研究中所获得的药代动力学参数，将用于设计高剂量甘氨酸的多剂量方案。我们开发的方案将用于在试验动物血液中，使甘氨酸的水平维持在相当于喂食在其饮食中含有20％、10％和5％(重量)甘氨酸饮食的动物中所观测水平的±10％。将根据前述单剂量研究确定的药代动力学参数和参数变量，确定各剂量组动物数量和采样时间的详述方案。然而，为了验证方案，我们预计该研究设计需要每剂量组不超过10只动物(5只雄性，5只雌性)。我们将在剂量方案设计中利用WinNonlin的仿真功能，找出采样的时间点，以得到用于验证方案的数据。
WinNonlin软件提供一套很好的工具，在多剂量时间表和取样方案设计中应用仿真来验证剂量时间表。适用于Windows的GraphPadStatMate 2.00版，将用来证实各剂量组动物的数量是达到合适基数(proper power)以证明统计学上有效性所需的数量。统计分析将使用适于Windows的GraphPad InStat 3.06版32比特(bit)。如果PK参数和甘氨酸在血液中的循环水平在统计学上并不以显著方式区别于实验所获得的PK参数和循环水平，则认为剂量方案是有效的。
使研究动物安乐死，研究结束时进行尸体剖检。通过用抗BADser-136抗体的免疫沉淀法和蛋白质印迹分析或者通过亲和捕获LC/MS分析，确定脂肪组织中BAD ser-136位上的磷酸化状态。参见Papac和Shahrokh，Mass spectrometry innovations in drug discoveryand development.Pharm Res，2001，18(2)131-45；Creaser等，Immunoaffinity chromatography combined on-line with high-performanceliquid chromatography-mass spectrometry for the determination ofcorticosteroids.J Chromatogr A，1998，794(1-2)37-43；Gallo等，Development of a liquid chromatography/electrospray tandem massspectrometry method for confirmation of chloramphenicol residues in milkafter alfa-1-acid glycoprotein affinity chromatography.Rapid CommunMass Spectrom，2005，19(4)574-9。还可对脂肪组织进行TUNEL蛋白的免疫组织化学染色，作为活性细胞凋亡的标记。参见Pavlovsky和Vagunda，[Apoptosis--selected methods of detection of apoptosis andassociated regulatory factors on tissue sections of tumors].CeskPatol，2003，39(1)第6-10页；Heatwole，V.M.，TUNEL assay forapoptotic cells.Methods Mol Biol，1999，115141-8；Stadelmann和Lassmann，Detection of apoptosis in tissue sections.Cell Tissue Res，2000，301(1)19-31。
还可收获主要器官，观察任何明显的毒性迹象，如果发现任何明显的毒性迹象，则保存待进一步分析。
实施例11甘氨酸有关通过诱导脂肪组织细胞凋亡诱发体重减轻能力的PK/PD联合试验(药代动力学/药效动力学模型)药效动力学是指作用部位的药物浓度与药理学反应之间的关系，包括影响药物浓度与药理学相互作用的生理生化作用。参见Shargel和Yu，Applied Biopharmaceutics and Pharmacokinetics，第四版，1999，New YorkMcGraw-Hill，573-605。
药效动力学模型的形式依赖于药物借以维持其药理作用的机制。因此，这个模型中所获得的资料，将提供有关甘氨酸如何在脂肪组织中诱发其生物作用的有用资料。我们在本申请所提议研究的初步研究结果中，证实了高甘氨酸饮食导致BAD ser-136位处于去磷酸化状态。我们提出用BAD ser-136的磷酸化状态作为细胞凋亡的标志，来建立我们的药效动力学模型。有关甘氨酸对BAD磷酸化状态的作用，我们将建立甘氨酸作用的PK/PD联合试验模型(PK/PDLink model)。PK/PD联合试验模型假定，为了建立作用部位药物局部浓度的模型，PD模型将采用固定药代动力学参数。Jusko，Corticosteroid pharmacodynamicsmodels for a broad array of receptor-mediated Pharmacologic effects.J Clin Pharmacol，1990，30(4)303-10；Dayneka等，Comparison of four basic models of indirectpharmacodynamic responses.J Pharmacokinet Biopharm，1993，21(4)457-78。我们将采用从单剂量和多剂量研究中所获得的药代动力学模型，为PK/PD联合试验模型提供固定PK参数。将采用白色脂肪组织(WAT)的离体(ex-vivo)器官培养物，建立PK/PD联合试验模型的PD模型部分。建立离体WAT培养的方法和步骤已有详细记载。参见Moustaid-Moussa和Fried，Culture of Adipose Tissue andIsolated Adipocytes，Adipose Tissue Protocols，G.Ailhaud，Editor.2001，Humana Press，Inc.Totowa，NJ，第197-213页；Livingston等，Insulin-dependent regulation of the insulin-sensitivity of adipocytes.Nature，1978，273(5661)394-61；Bernstein，Improved insulin responsiveness inrat adipose tissue pieces cultured with charcoal-treated albumin andoxygen.J Lipid Res，19 82，23(2)3 60-3；Bernstein，Insulin insensitivityand altered glucose utilization in cultured rat adipose tissue.J Lipid Res，1979，20(7)848-56；Maloff等，Direct effects of growth hormone oninsulin action in rat adipose tissue maintained in vitro.Endocrinology，1980，107(2)538-44。相对于分离的脂肪细胞，这些实验中将采用WAT器官培养物，因为器官培养物更能充分反映导致PD模型中浓度与效应关系的WAT的生物复杂性，该模型更能反映出体内状态。Papac和Shahrokh，Mass spectrometry innovations in drug discovery anddevelopment.Pharm Res，2001，18(2)131-45。
简而言之，使大鼠安乐死后10分钟内，通过手术分别切取体重为200-225g的3只雄性和3只雌性Sprague-Dawley大鼠的腹膜后、腹股沟和性腺脂垫，获得WAT。将从各个动物中获得约12-15g的WAT。将性别相同的动物WAT混合，室温下，在装有无菌M199(Gibco-BRL；补充了谷氨酰胺和25mM HEPES的碳酸氢盐缓冲液体)和50μg/mL庆大霉素的锥形塑料离心管(3g/管)中，大致切碎。按Fried和Moustaid-Moussa所述(Culture of Adipose Tissue and IsolatedAdipocytes，Adipose Tissue Protocols，G.Ailhaud主编，2001，HumanaPress，Inc.Totowa，NJ，第197-213页)，所有材料的进一步加工以无菌方式在层流罩超静台上进行。用锋利的剪刀将脂肪组织进一步剪成5-10mg的碎块。一旦将组织剪碎，即可在室温下保持长达1小时(这时剪碎其它试管中的组织)。组织不得置于37℃下，以避免在这个时候增加组织的代谢率。将各管的内容物倒入放置在～500mL瓶口上的尼龙网(附在漏斗上)，洗去WAT器官培养物的脂滴和血液。在这之后，于37℃下，用至少300mL无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗漏斗上的组织。然后，将洗涤后的组织放入无菌的配衡培养皿中，用镊子除去任何大的血凝块。盖上装有WAT器官培养物的配衡培养皿以保持无菌，然后称重。用镊子或多孔匙，将WAT等量(～0.5g湿重/孔)加入到6孔组织培养板中。然后，迅速加入新配制的M199(Gibco-BRL；补充了谷氨酰胺和25mM HEPES的碳酸氢盐缓冲液体)和50μg/mL庆大霉素，在5％CO2-95％空气的气氛下，培养物保持在潮湿、37℃的培养箱中48小时，确保没有污染并保持无菌状态。
按上述方法，制备含有从雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠中获得的WAT器官培养物的孔一式三份，各孔用新配制的M199(Gibco-BRL；补充了谷氨酰胺和25mM HEPES的碳酸氢盐缓冲液体)和50μg/mL庆大霉素洗涤3次。加入新配制的补充了下述浓度甘氨酸的M199培养基，开始进行实验。对照孔加入不含额外添加甘氨酸的新鲜培养基，实验孔加入补充甘氨酸的M199培养基，甘氨酸浓度为5个间隔相等的浓度，最高浓度等于多剂量PK研究中最高剂量组血液中甘氨酸循环水平的两倍。在3天时间内以每日为基础补充培养基。然后收获培养物，用冰冷的PBS洗涤5次。通过前述LC/MS法，制备用于甘氨酸定量测定的样品。
实施例12用于筛选甘氨酸生物活性类似物的快速生化试验高水平(20％(重量))的甘氨酸饮食导致显著的体重减轻。这种体重减轻可能是甘氨酸诱导WAT细胞凋亡能力的结果。这是根据初步数据得出的结果，初步数据证实从处理动物WAT中获得的蛋白质提取物不具备使BAD 136位丝氨酸磷酸化的能力(
图11、
图12和
图13)。参见Masters等，14-3-3 inhibits Bad-induced cell death throughinteraction with serine-166.Mol Pharmacol，2001，60(6)1325-31；Thompson 和 Thompson，Putting the rap on akt.J ClinOncol，2004，22(20)4217-26。
如上所述，其他研究者曾偶然观察到甘氨酸能够诱导体重减轻。然而尚不清楚通过何种机制产生这种现象。我们认为，甘氨酸通过调节导致诱导细胞凋亡的BAD的磷酸化状态，对WAT产生直接的生化作用。这是基于我们的初步实验观察，在初步实验中，BAT中未观察到这种BAD ser-136的去磷酸化作用，或者不产生BAT组织的显著减少。此外，我们还观察到在高浓度甘氨酸的3T3-L1细胞分化为脂肪细胞的培养基中，与未处理细胞相比，显示出TUNEL染色增加。参见Heatwole，TUNEL assay for apoptotic cells.Methods Mol Biol，1999，115141-8。这个实例的目的是研发一种可用于筛选甘氨酸生物活性类似物的快速生物测定法。
我们曾经发现雌性Sprague-Dawley大鼠对饮食中高含量甘氨酸的作用特别敏感，会经历快速、显著的体重减轻。因此，利用雌性Sprague-Dawley大鼠显著的体重减轻筛选甘氨酸类似物的活性是可行的。然而，这个试验耗时久，可能需要大规模合成类似物，对于筛选众多的化合物不够有效。我们提出用分化的3T3-L1细胞系和测定BAD ser-136的磷酸化状态，开发一种快速的生物学体外试验法。Gaillard等，Growth of preadipocyte cell lines and cell strains fromrodents in serum-free hormone-supplemented medium. In Vitro，1984，20(2)79-88。
为了对使用该测定法更有信心，我们必须证实从分化的3T3-L1细胞获得的脂肪细胞，以类似于脂肪细胞的方式在体外对高甘氨酸水平作出反应。以下实验的目的在于证实，在用于这一目的的分化3T3-L1细胞中利用BAD Ser-136去磷酸化的实用性和有效性。
通过改进上述用于WAT器官培养物的纯化步骤，获得来自WAT的脂肪细胞。简而言之，按照前述方法分离WAT，并进行下面的附加步骤得到分离的脂肪细胞和基质血管组分。在M199培养基中，用浓度为1mg/ml的I型胶原酶，于37℃使WAT糜消化60分钟，得到分离的脂肪细胞和基质组分。然后，使胶原酶处理的组织通过无菌尼龙滤器(网孔350μm)，过滤到无菌离心管中。将该悬液以500×g离心1分钟，从含有脂肪细胞的组分中分离出基质-血管组分(沉淀)。相应的细胞组分再在Hank平衡盐溶液中洗涤3次。然后，对各个脂肪细胞和基质血管组分计数，用新配制的M199培养基稀释，加入6孔培养板各孔中。在5％CO2-95％空气的气氛下，使细胞在37℃培养箱中孵育过夜。观察细胞，确保存活力，并避免污染，加入新配制的M199培养基，在培养基中补充下述浓度递增的甘氨酸，开始进行实验。对照孔中加入新配制的不添加额外甘氨酸的培养基，实验孔加入补充甘氨酸的M199培养基，甘氨酸的浓度与PD实验所用浓度一致。在3天时间内，以每日为基础补充培养基。然后，收获培养物，用冰冷的PBS洗涤5次。通过加入低渗缓冲液使细胞裂解，离心澄清，将等分的裂解产物在液氮中速冻，用前贮存于-80℃下。样品的胞内甘氨酸含量可用LC/MS法确定。BAD Ser-136的磷酸化状态或用BAD-Ser 136的ELISA确定或通过亲和捕获LC/MS分析确定。将各样品加入孔中一式三份，进行TUNEL免疫组织化学染色，证实活性细胞凋亡。我们认为，下面的实验将会为甘氨酸对得自WAT的脂肪细胞发挥直接作用提供决定性的证据。
实施例13甘氨酸对得自分化3T3-L1细胞的脂肪细胞诱导BAD去磷酸化和细胞凋亡的作用通过标准方法，使3T3-L1细胞在培养物中生长，并分化为脂肪细胞。参见Négrel和Dani，Cultures of Adipose Precursor Cells and Cellsof Clonal Lines from Animal White Adipose Tissue，Adipose TissueProtocols，G.Ailhaud主编，2001，Humana Press，Inc.Totowa，NJ，第225-227页。在开始实验之前，3T3-L1脂肪细胞用胰蛋白酶消化，用dDMEM[含有1g/L葡萄糖和110mg/L丙酮酸钠，补充了3.7g/L碳酸氢钠、33μM生物素、17μM泛酸盐、抗生素(62mg/L青霉素和50mg/L链霉素或10mg/L四环素)、17nM胰岛素和2nM T3和10％FBS]洗涤5次。将细胞加入6孔培养板各孔中，密度为8.5×103细胞/cm2。观察细胞以确保存活力并避免污染，加入新配制的补充了以下浓度递增的甘氨酸的dDMEM培养基开始实验。对照孔加入新配制的未添加额外甘氨酸的培养基，实验孔中加入补充了甘氨酸的dDMEM培养基，甘氨酸浓度与PD实验所用浓度一致。在3天时间内，以每日为基础补充培养基。然后，收获培养物，用冰冷的PBS洗涤5次。通过加入低渗缓冲液使细胞裂解，离心澄清，将等分的裂解产物在液氮中速冻，用前贮存于-80℃下。通过LC/MS法确定样品的胞内甘氨酸含量。BAD Ser-136的磷酸化状态或用BAD-Ser 136的ELISA确定或通过亲和捕获LC/MS分析确定。初步实验表明，培养基中甘氨酸的浓度等于血液中正常循环水平的两倍，会使3T3-L1脂肪细胞经历细胞凋亡，通过阳性TUNEL染色加以证实。将各样品加入孔中一式三份，进行TUNEL免疫组织化学染色以证实活性细胞凋亡。
实施例14双向凝胶和ICAT(同位素亲和标签)分析证实，在得自WAT和分化3T3-L1细胞的脂肪细胞中，甘氨酸处理引起同等的生物反应通过证明用甘氨酸处理所引起的蛋白质差异表达模式类似于使用双向凝胶和ICAT分析所观察到的甘氨酸处理的WAT蛋白质提取物的模式，进一步证实得自3T3-L1细胞分化的脂肪细胞的效用。参见Patton等，Two-dimensional，gel electrophoresis；better than a poke inthe ICAT？Curr Opin Biotechnol，2002，13(4)，第321-8页。
简而言之，按照前述方法，获得WAT和3T3-L1来源的脂肪细胞。对照和实验孔的甘氨酸浓度按上述方法处理。按照前述方法制备分析样品，对等量样品进行双向凝胶分析和ICAT分析，以证实3T3-L1脂肪细胞和WAT来源的脂肪细胞对于甘氨酸处理，将以生物学上等同的方式作出反应。ICAT分析可以为阐述甘氨酸诱导WAT的脂肪细胞凋亡的作用机制提供起点。ICAT是一种有效的方法，能够以定量的方式，鉴别各甘氨酸处理细胞间蛋白质的不同。ICAT法见
图17。
实施例15
甘氨酸结构类似物文库的合成和具有诱导3T3-脂肪细胞凋亡能力的化合物的预筛选甘氨酸是无毒氨基酸，易于获得。甘氨酸、甘氨酸类似物或其组合应当通过诱导WAT细胞凋亡而诱发体重减轻。可以合成以下的甘氨酸类似物系列式I 式II式III R1＝R2＝H； R1＝R2＝H R1＝R2＝H，和 R3＝H，Me，Et，Pr，BnR1＝R2＝Me，Et，PrR1＝R2＝Me，Et，PrR1＝R2＝Me，Et，Pr，andR3＝Me，Et，Pr，BnR1＝H，R2＝Bn；R1 R1＝H，R2＝Bn R1＝H，R2＝Bn或Me，R3＝Me，Et，Pr，BnR2＝(CH2)5R1，R2＝(CH2)5R1，R2＝(CH2)5或Me，R3＝Me，Et，Pr，或Bn.
式I系列可以通过例如下述流程合成 上述流程所提到的氨基磺酸类似物可通过用氯代甲磺酸处理各种二烷基胺例如二甲基胺合成。式II系列可以通过例如以下流程合成 在用氰基硼氢化钠作为还原剂的还原条件下，用氧代乙酸甲酯处理二烷基胺或伯胺，合成以上所示类似物。产物用色谱法纯化。式III可以通过例如以下流程合成
在二环己基碳二亚胺(DCC)和二甲基氨基吡啶(DMAP)存在下，可用胺使N(烷基)甘氨酸或N，N-二烷基甘氨酸的游离羧基端酰胺化。在所有情况下，产物都通过色谱法纯化。可通过质谱法、NMR、分析液相色谱法和根据需要的任何其它分析法确定结构、纯度和数量。
对合成类似物促进BAD Ser-136去磷酸化的能力进行初步筛选。在与未补加甘氨酸对照的相同浓度下和在与培养基中甘氨酸阳性对照相同的浓度下，以及在已知的有效浓度下，筛选类似物。所有试验都将重复三次。对所有潜在的阳性类似物进行重复筛选。在体外试验中对鉴定出的阳性化合物进行复选，以确定使类似物成为优良的体内测定备选药物的化学特性。
实施例16未成年动物
图18和
图19表示未成年雌性Sprague-Dawley大鼠饮食中添加甘氨酸，分别导致体重增加和生长呈剂量依赖性降低。动物用补充了甘氨酸的饮食处理4周，转用不含甘氨酸补充剂的饮食(
图18和
图19，10％-0％)。这导致快速生长和体重增加，在一个月内，它们的大小和体重与第1组对照动物的相同。图20和图21分别表示未成年雄性Sprague-Dawley大鼠饮食中添加甘氨酸导致体重增加和生长呈剂量依赖性降低。动物用补充甘氨酸的饮食处理4周，转用不含甘氨酸补充剂的饮食(图20和图21，10％-0％)。这导致快速生长和体重增加，在一个月内，它们的大小和重量与第1组对照动物的相同。
权利要求
1.一种减少动物白色脂肪组织的方法，该方法包括给予动物含约10％至约30％甘氨酸的高甘氨酸饮食。
2.权利要求1的方法，其中所述高甘氨酸饮食包含甘氨酸类似物或甘氨酸与甘氨酸类似物的组合。
3.一种诱导动物白色脂肪组织细胞凋亡的方法，该方法包括给予动物含约10％至约30％甘氨酸的高甘氨酸饮食。
4.权利要求3的方法，其中所述高甘氨酸饮食包含甘氨酸类似物或甘氨酸与甘氨酸类似物的组合。
5.一种减少动物白色脂肪组织中BAD 136位氨基酸磷酸化的方法，该方法包括给予动物含约10％至约30％甘氨酸的高甘氨酸饮食。
6.权利要求5的方法，其中所述高甘氨酸饮食包含甘氨酸类似物或甘氨酸与甘氨酸类似物的组合。
7.权利要求1的方法，其中所述减少白色脂肪组织的方法包括使白色脂肪细胞缩小。
8.一种使动物体重减轻的方法，该方法包括给予动物含约10％至约30％甘氨酸的高甘氨酸饮食。
9.权利要求8的方法，其中所述使体重减轻的方法包括减少动物的腹部脂肪含量。
10.权利要求8的方法，其中所述高甘氨酸饮食包含甘氨酸类似物或甘氨酸与甘氨酸类似物的组合。
11.权利要求8的方法，其中该方法还包括体重减轻辅助疗法例如运动方案、低脂饮食、低热量饮食、低糖饮食、手术干预、行为疗法、药物疗法或它们的组合。
12.一种产生体型减小或体重减轻的动物，然后使动物回复到正常体型或正常体重的方法，该方法包括给予未成年动物高甘氨酸饮食，以产生体型减小或体重减轻的动物，然后给予动物正常饮食，以产生正常体型或正常体重的动物。
13.一种用于使动物体重减轻的饮食组合物，所述组合物包含约10％至约30％的甘氨酸、甘氨酸类似物或其组合以及约70％至约90％的低热量饮食、低脂饮食、低糖饮食或其组合。
14.权利要求13的饮食组合物，其中所述低脂饮食为低饱和脂肪饮食。
15.一种用于产生体型减小或体重减轻或者既体型减小又体重减轻的动物的方法，该方法包括给予未成年动物含约10％至约30％甘氨酸的高甘氨酸饮食。
16.权利要求15的方法，其中所述高甘氨酸饮食包含甘氨酸类似物或甘氨酸与甘氨酸类似物的组合。
17.一种诱导白色脂肪细胞凋亡的方法，该方法包括给予所述脂肪细胞一种或多种甘氨酸类似物或甘氨酸与甘氨酸类似物的组合。
18.一种减少白色脂肪细胞中BAD 136位氨基酸磷酸化的方法，该方法包括给予所述脂肪细胞一种或多种甘氨酸类似物或甘氨酸与甘氨酸类似物的组合。
全文摘要
本发明提供调节动物体重和体型的方法和组合物。在一个实施方案中，权利要求涉及使动物体重减轻的饮食组合物，所述组合物包含约10％至约30％的甘氨酸、甘氨酸类似物或其组合以及约70％至约90％的低热量饮食、低脂饮食、低糖饮食或其组合。甘氨酸类似物为N－烷基化甘氨酸或甘氨酰胺或下式(I)的氨基－甲基－磺酸化合物，其中R
文档编号A23K1/16GK101090717SQ200580045110
公开日2007年12月19日 申请日期2005年11月2日 优先权日2004年11月2日
发明者J·D·希尔曼, E·W·T·乔尼基, R·S·奥鲁甘蒂 申请人:奥洁克公司