具有增强的农艺性状的转基因植物的制作方法

专利名称：：具有增强的农艺性状的转基因植物的制作方法
技术领域：
：言，本发明提供了具有用于在转基因植物中提^增强的性状的重组DNA的植物细胞，包括此类细胞的植物，来源于此类植物的种子和花粉，制备及使用此类细胞、植物、种子和花粉的方法。
背景技术：
：具有改良的农艺性状例如产量、环境应激耐受性、害虫抗性、除草剂耐受性、改良的种子组成等的转基因植物是农民和消费者都需要的。尽管植物育种中的大量努力已提供了所需性状的显著收益，但将特定DNA导入植物基因组的能力为产生具有改良和/或独特性状的植物提供了进一步的机会。只将重组DNA导入植物基因组不总是产生具有增强的农艺性状的转基因植物。需要从群体中选择个别转基因事件的方法以鉴别其特征为增强的农艺特性的那些转基因事件。发明概述本发明采用重组DNA用于表达对赋予转基因植物增强的农艺特性有用的蛋白质。本发明中的重组DNA在包括启动子的构建体中提供，所述启动子在植物细胞中起作用并且与DNA可操作地连接，所述DNA编码在序列中具有至少一个氨基酸结构域的蛋白质，所述氨基酸结构域对于与如表28鉴别的Pfam名称组中由Pfam名称鉴别的蛋白质结构域家族的氨基酸序列比对超过Pfam聚集截止值。在本发明更具体的实施方案中，在植物细胞中表达的蛋白质具有的氨基酸序列与共有氨基酸序列群中的共有氨基酸序列具有至少90%的同一性，所述共有氨基酸序列群由关于SEQIDNO:84构建的共有氨基酸序列和表2中列举的其同源物，以及关于SEQIDNO:166构建的共有氨基酸序列和表2中列举的其同源物组成。在本发明再更具体的实施方案中，植物细胞中表达的蛋白质是选自表1中鉴别的蛋白质群的蛋白质。本发明的其他方面具体涉及包括本发明的重组DNA的转基因植物细胞、包括多个此类植物细胞的转基因植物、来自此类植物的后代转基因种子和转基因花粉。通过在群体中篩选转基因植物与不具有所述重组DNA的对照植物相比增强的性状，从转基因植物群体中选择此类植物细胞，所述转基因植物群体从用重组DNA转化的植物细胞再生并表达蛋白，其中所述增强的性状选自增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。在本发明的再一方面，植物细胞、植物、种子和花粉进一步包括表达蛋白质的DNA，所述蛋白质提供来自暴露于除草剂的耐受性，所述除草剂以对野生型所述植物细胞致死的水平应用。此类耐受性不仅在此类植物中作为有利性状特别有用，还在本发明方法的选择步骤中有用。在本发明的方面中此类除草剂的试剂是草甘膦、麦草畏或草铵膦化合物。本发明的再其他方面提供对于重组DNA纯合的转基因植物，和来自玉米、大豆、棉花、低芥酸菜子、苜蓿、小麦或稻植物的本发明的转基因种子。在阿根廷用于实践本发明的各种方面的其他重要实施方案中，重组DNA在来源于玉米系的植物细胞中提供，所述玉米系是并维持对MaldeRioCuarto病毒或高粱柄锈菌(尸wcc/w"sorg//)真菌或两者的4氏抗力。本发明还提供了用于制备非天然的、转基因种子的方法，所述转基因种子可以用于生产一批具有增强的性状的转基因植物，所述增强的性状由稳定整合的重组DNA表达产生，所述重组DNA表达在序列中具有至少一个氨基酸结构域的蛋白质，所述氨基酸结构域对于与表28鉴别的Pfam名称组中由Pfam名称鉴别的蛋白质结构域家族的氨基酸比对超过Pfam聚集截止值。更具体而言，该方法包括(a)在植物群体中筛选增强的性状和重组DNA,其中在群体中的个体植物可以显示的性状水平低于、基本上等于或高于所述性状在不表达所述重组DNA的对照植物中显示的水平，(b)从群体中选出一种或多种植物，它们显示的性状水平大于所述性状在对照植物中显示的水平，(c)证实重组DNA稳定整合在所述选择的植物中，(d)分析所选植物的组织以确定生产的蛋白质具有由SEQIDNO:1-83之一的序列中核苷酸编码的蛋白质的功能；和(e)收集来自所选植物的种子。在本发明的一个方面，群体中的植物进一步包括表达蛋白质的DNA，所述蛋白质提供针对暴露于除草剂的耐受性，所述除草剂以对野生型植物细胞致死的水平应用，并且选择通过用除草剂例如草甘膦、麦草畏或草铵膦化合物处理群体来实现。在本发明的另一方面，通过鉴别具有增强的性状的植物来选择植物。该方法对于制备玉米、大豆、棉花、苜蓿、小麦或稻种子特别有用。本发明的另一方面提供了生产杂交玉米种子的方法，其包括从除草剂耐受性玉米植物中获得杂交玉米种子，所述玉米植物还具有稳定整合的重组DNA，所述重组DNA包括(a)在植物细胞中起作用并且(b)与DNA可^t乘作地连接的启动子，所述DNA编码在序列中具有至少一个氨基酸结构域的蛋白质，所述氨基酸结构域对于与表28鉴别的Pfam名称组中由Pfam名称鉴别的蛋白质结构域家族的氨基酸比对超过P化m聚集截止值。该方法进一步包括由所述杂交玉米种子生产玉米植物，其中由所述杂交玉米种子产生的植物的一部分对于所述重组DNA是纯合的，由所述杂交玉米种子产生的植物的一部分对于所述重组DNA是半合子的，并且由所述杂交玉米种子产生的所述植物的一部分没有一种所述重组DNA;通过用除草剂处理选择对于所述重组DNA是纯合和半合子的玉米植物；收集来自除草剂处理存活的玉米植物的种子并种植所述种子以产生进一步的后代玉米植物；将选择和收集步骤重复至少一次以产生近交玉米系；并使近交玉米系与第二种玉米系杂交以生产杂交种子。本发明的另一方面提供了选择包括本发明植物细胞的植物的方法，其通过使用免疫反应性抗体检测重组DNA表达的蛋白质在种子或植物组织中的存在来实现。本发明的再一方面提供防伪的研磨种子，其具有作为来源指示的本发明的植物细胞。本发明的再其他方面涉及具有增强的水利用效率或增强的氮利用效率的转基因植物。例如，本发明提供无需灌溉水培育玉米、棉花或大豆农作物的方法，其包括种植具有本发明的植物细胞的种子，所述种子根据增强的水利用效率进行选择。可替代的方法包括在玉米农作物生产过程中应用减少的灌溉水，例如提供最高达300毫米的地下水。本发明还提供了无需添加氮肥料培育玉米、棉花或大豆农作物的方法，其包括种植具有本发明的植物细胞的种子，所述种子根据增强的氮利用效率进行选择。发明详述如本文所使用的，"植物细胞"指用稳定整合、非天然的重组DNA转化的植物细胞，例如通过土壤杆菌属(^gra^c化n'wm)介导的转化或通过使用重组DNA包被的微粒轰击或其他方法。本发明的植物细胞:或来源于后代转i因植物口的种子或花粉，所述:代植物细胞再生为分化的组织，例如再生为具有稳定整合、非天然重组DNA的转基因植物。如本文所使用的，"转基因植物"指其基因组已通过重组DNA的稳定整合而改变的植物。转基因植物包括由最初转化的植物细胞再生的植物，和来自转化植物的较后世代或杂交的后代转基因植物。如本文所使用的，"重组DNA"指已基因工程改造并在细胞外构建的DNA，包括包含天然存在的DNA或cDNA的DNA或合成DNA。如本文所使用的，"共有序列"指在同源蛋白质氨基酸序列比对的保守区域中的人工氨基酸序列，例如，如由同源蛋白质的氨基酸序列的CLUSTALW比对确定的。如本文所使用的，"同源物"指执行相同生物学功能的蛋白质群中的蛋白质，例如属于相同Pfam蛋白质家族并在本发明的转基因植物中提供共同的增强的性状的蛋白质。同源物由同源基因表达。同源基因包括天然存在的等位基因和人工生成的变体。遗传密码的简并提供下列可能性不导致基因产生的多肽氨基酸序列的改变而用不同碱基置换该基因的蛋白质编码序列的至少一个碱基。因此，在本发明中有用的多核普酸可以具有从SEQIDNO:1到SEQIDNO:83已根据遗传密码简并置换进行改变的任何碱基序列。同源物是在最佳比对时在全长蛋白质上具有至少60%同一性的蛋白质，更优选约70%或更高，更优选至少80%并且甚至更优选至少90%的同一性，所述全长蛋白质被鉴定为与在植物细胞中表达时赋予增强的性状相关联。同源物包括氨基酸序列与本文公开的蛋白质和同源物的共有氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白质。通过氨基酸序列比较鉴别同源物，例如人工或通过使用基于计算机的工具，所述工具使用基于同源性的已知搜索算法，例如通常已知并称为BLAST、FASTA和Smith-Waterman的那些。局部序列比对程序例如BLAST,可以用于搜索序列数据库以找到相似序列，并且汇总的期望值(E值)用于测量序列碱基相似性。因为具有特定生物的最佳E值的蛋白质命中不必是直向同源物或唯一的直向同源物，所以在本发明中使用交互查询以过滤对于直向同源物鉴别具有显著E值的命中序列。交互查询需要搜索针对来自基础生物的氨基酸序列数据库的显著命中，它类似于查询蛋白质的序列。当交互查询的最佳命中是查询蛋白质自身或由物种形成后的重复基因编码的蛋白质时，命中的可能是直向同源物。本发明的进一步的方面包括功能性同源物蛋白质，作为保守氨基酸置换的结果它们在一个或多个氨基酸方面不同于公开的蛋白质的那些，例如在下列氨基酸中的置换酸性(带负电荷的)氨基酸例如天冬氨酸和谷氨酸；碱性(带正电荷的)氨基酸例如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；中性极性氨基酸例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；中性非极性(疏水)氨基酸例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和曱硫氨酸；具有脂族侧链的氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的氨基酸例如丝氨酸和苏氨酸；具有包含酰胺的侧链的氨基酸例如天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸例如半胱氨酸和曱硫氨酸；天然保守的氨基酸例如缬氨酸-亮氨酸、缬氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。在本发明转基因植物中有用的DNA编码的同源物的进一步方面是作为在天然序列中一个或多个氨基酸缺失或插入的结果与公开的蛋白质不同的那些蛋白质。如本文所使用的，"百分比同一性"指2个最佳比对的DNA或蛋白质区段在组分例如核苷酸序列或氨基酸序列比对窗口自始自终不变的程度。关于测试序列和参考序列的比对区段的"同一性分数"是通过比对窗口由2个比对区段序列共有的相同组分的数目除以参考区段中序列组分的总数目，所述总数目是完整的测试序列或完整的参考序列中的较小者。"百分比同一性"("同一性％")是同一性分数乘100。如本文所使用的，"Pfam"指覆盖许多共同蛋白质家族的多重序列比对和隐马尔可夫模型的大集合，例如Pfam版本18.0(2005年8月)包含用于7973个蛋白质家族的比对和才莫型并且基于Swissprot47.0和SP-TrEMBL30.0蛋白质序列数据库。参见S.R.Eddy，"ProfileHiddenMarkovModels",Bioinfo歸tics14:755-763，1998。Pfam目前由PfamConsortium维持和更新。比对代表对蛋白质功能有牵连的某些进化保守结构。由Pfam比对建立的分布型(Profile)隐马尔可夫模型(分布型HMMs)对于自动识别属于现有蛋白质家族的新蛋白质有用，即使通过比对的同源性看起来低。一旦一种DNA鉴别为编码在转基因植物中表达时赋予增强的性状的蛋白质，就通过针对隐马尔可夫模型查询候选DNA编码的蛋白质氨基酸序列鉴别在相同蛋白质家族中的其他DNA编码蛋白质，所述才莫型使用HMMER软件表征Pfam结构域，其通用版本在附加的计算机列表中提供。满足特定Pfam比对的聚集截止值的候选蛋白质在蛋白质家族中，并且具有在构建用于本发明的植物细胞的重组DNA中有用的同源DNA。附加的计算机列表中还包括了伴随HMMER软件使用的隐马尔可夫模型数据库，用于鉴别在关于本发明的植物细胞中的重组DNA的共同Pfam中表达蛋白质的DNA。HMMER软件和Pfam数据库是版本18.0并用于鉴别对应于SEQIDNO:84-SEQIDNO:166氨基酸序列的蛋白质中的已知结构域。编码通过本文公开的Pfam分析得分高于表27中公开的聚集截止值的蛋白质的所有DNA都可以在本发明植物细胞的重组DNA中使用，例如用于选择具有增强的农艺性状的转基因植物。如下文更具体地公开的，在本发明中使用的相关Pfams是AAA、AP2、Aldoketred、a淀粉酶、Aminotran12、Ank、ArfGap、Asn合酶、BROl、CBFDNFYBHMF、过氧化氢酶、CorA、Cpn60TCP1、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、DNA光解酶、DSPc、DUF1685、DUF296、Dil9、E2FTDP、FAD结合7、FA去饱和酶、FBPase、GAF、GATA、GATase2、Glycohydrol、乙二醛酶、Gotl、HATPasec、HSFDNA画结合、HSP20、HisKA、同源异型框、Hpt、异淀粉酶N、K-框、内酰胺酶B、Metallophos、MtN3slv、NAF、NAM、NIF、OxidoredFMN、PAS、PDZ、PRA1、肽酶C15、肽酶SIO、肽酶S41、光敏色素、Peinase、PkinaseTyr、吡。多醛deC、RIOl、RRM1、RTC、RTC插入片4殳、Ras、应答reg、SPC25、SPX、SRF-TF、小突触小泡蛋白、UPF0057、zf-C2H2、和zf-C3HC4，其数据库包括在附加的计算机列表中。如本文所使用的"启动子"指用于起始转录的调节DNA。"植物启动子"是无论其起源是否是植物细胞都能够在植物细胞中起始转录的启动子，例如众所周知的是土壤杆菌属启动子在植物细胞中起作用。因此，植物启动子包括从植物、植物病毒和细菌例如土壤杆菌属和慢生#^瘤菌属(Sra^T/n'zo6/"m)纟田菌荻得的启动子DNA。在发育控制下的启动子的实例包括优先起始在特定组织例如叶、根或种子中的转录的启动子。此类启动子称为"组织优选的"。只起始在特定组织中的转录的启动子称为"组织特异性的"。"细胞类型"特异性启动子主要驱动在一种或多种器官的特定细胞类型，例如根或叶中的血管细胞中的表达。"诱导型，，或"阻抑型，，启动子是在环境控制下的启动子。可以影响通过诱导型启动子的转录的环境条件的实例包括缺氧条件、或特定化学药品、或光的存在。组织特异性的、组织优选的、细胞类型特异性、和诱导型启动子构成"非组成型"启动子类别。"组成型"启动子是在大多数条件下有活性的启动子。如本文所使用的，"可操作地连接"指在DNA构建体中结合2个或更多个DNA片段，从而使得一种例如编码蛋白质的DNA的功能受另一种例如启动子的控制。如本文所使用的，"表达"指产生，例如当其同源DNA转录为mRNA，mRNA翻译成蛋白质时，蛋白质在植物细胞中表达。如本文所使用的，"对照植物"指不包含重组DNA的植物，所述重组DNA表达赋予增强的性状的蛋白质。对照植物用于鉴别并选择具有增强的性状的转基因植物。适当的对照植物可以是用于产生转基因植物的亲本系的非转基因植物，即缺乏重组DNA。适当的对照植物在某些情况下是半合子转基因植物系的后代，它不包含重组DNA,称为阴性分离子。如本文所使用的，"增强的性状"指转基因植物的特征，它包括但不限于，特征为增强的植物形态学、生理学、生长和发育、产量、营养增强、疾病或害虫抗性、或环境或化学药品耐受性的增强的农艺性状。在本发明的更具体的方面，增强的性状选自增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。在本发明的重要方面，增强的性状是增强的产量，包括在非应激条件下增加的产量和在环境应激条件下增加的产量。应激条件可以包括例如干旱、阴凉、真菌病、病毒病、细菌病、昆虫侵扰、线虫侵扰、冷温度暴露、热暴露、渗透性应激、减少的氮营养物利用率、减少的磷营养物利用率和高植物密度。"产量，，可以受许多性质影响，包括但不限于，植物高度、荚果数目、在植物上的结荚位置、节间数目、裂果(podshatter)发生率、粒度、结瘤和固氮作用的效率、营养物同化作用的效率、针对生物和非生物应激的抗性、碳同化作用、植物结构、抗倒伏性、种子发芽百分数、幼苗活力、和幼年性状。产量还可受发芽效率(包括在应激条件下的发芽)、生长速率(包括在应激条件下的生长速率)、谷穗数目、每个谷穗的种子数目、种子大小、种子组成(淀粉、油、蛋白质)和种子充填的特征的影响。13本发明转基因植物增加的产量可以以多种方法测量，包括测试重量、每抹植物的种子数目、种子重量、每单位面积的种子数目(即，每英亩的种子、或种子重量)、每英亩的蒲式耳、每英亩的公吨、每英亩的吨、每公项的公斤。例如，玉蜀黍产量可以根据每单位生产面积生产的玉米粒测量，例如每英亩的蒲式耳或每公项的公吨，通常在调整湿度的基础上报告，例如在15.5百分数湿度上。增加的产量还可由关键生物化学化合物的改善利用产生，所述化合物例如氮、亚磷和碳水化合物，或者由环境应激的改善应答产生，所述环境应激例如冷、热、干旱、盐、和害虫或病原体攻击。在本发明中使用的重组DNA还可用于提供具有改善的生长和发育以及最终增加的产量的植物，作为植物生长调节剂的修饰的表达、或细胞周期或光合作用途径的修饰的结果。有意义的还有产生转基因植物，它就种子组分而言证实了增强的产量，所述种子组分可以对应或可以不对应总体植物产量的增加。此类性质包括种子油、种子分子例如生育酚、蛋白质和淀粉、或油特别是油组分的增强，如可以通过种子组分比率的改变证明的。本发明的核分子的子集包括公开的重组DNA的片段，其由至少15个、优选至少16或17、更优选至少18或19、并甚至更优选至少20个或更多个邻接核苷酸的寡核苷酸组成。此类寡核苷酸是具有选自SEQIDNO:l-SEQIDNO:83的序列的较大分子的片段，并且可用作例如用于检测本发明多核苷酸的探针和引物。在本发明的某些实施方案中，产生天然基因的显性失活突变体以达到所需作用。如本文所使用的，"显性失活突变体"指其基因产物不利地影响相同细胞中正常、野生型基因产物的突变基因，通常通过与其二聚化(组合)。在聚合分子例如胶原的情况下，显性失活突变体通常比导致不产生基因产物的突变(无效突变或无效等位基因)更有害。SEQIDNO:6和SEQIDNO:7被构建为分别编码缺失了K-框的aglll蛋白质和缺失了MAD框的MADs3蛋白质。类似于AGL11的MADS框蛋白质可以视为具有3个功能结构域。存在N末端DNA结合结构域(MADS框)、更远端的二聚化结构域(K-框)和C末端结构域，它通常涉及与其他蛋白质的相互作用。在植物中，MADS框和K-框之间的区域已显示在某些蛋白质中对于DNA结合是重要的并且通常称为I-框(Fan等人，1997)。考虑了几种不同类别的显性失活构建体。DNA结合结构域的缺失或灭活可以产生蛋白质，它能够与其天然全长配对物以及其他天然二聚化配对物二聚化。同样地，c末端结构域的去除可以允许与天然蛋白质及其天然二聚化配对物二聚化。在2种情况下，这些类型的构建体使得靶蛋白以及能够与K-框相互作用的任何其他蛋白质失去能力。在本发明的其他实施方案中，构建组成型活性突变以达到所需作用。SEQIDNO:3只编码来自依钙蛋白激酶(CDPK)的激酶结构域。CDPK1具有的结构域结构类似于其他依钙蛋白激酶，其中蛋白激酶结构域通过42个氨基酸的"间隔区"区域与4个EF手型结构域分开。认为依钙蛋白激酶由钙诱导的构象变化激活，所述构象变化导致自身抑制性结构域从蛋白激酶活性位点移开(Yokokura等人，1995)。因此组成型活性蛋白质可以通过只超表达蛋白质激酶结构域来制备。DNA构建体使用本领域普通技术人员众所周知的方法进行装配，并且一般包括与DNA可操作地连接的启动子，其表达提供增强的农艺性状。其他构建体组分可以包括另外的调节元件，例如用于增强转录的5'前导序列(leasder)和内含子、3'非翻译区(例如多腺苷酸化信号和位点)、用于转运的DNA或信号肽。根癌土壤杆菌(爿gro^c&n'wm^me/ac/em)肿瘤诱导性质粒上携带的胭脂碱合酶(NOS)启动子和章鱼碱合酶(OCS)启动子、花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒。例如，参见美国专利号5,858,742和5,322,938，它公开了来源于花椰菜花叶病毒的组成型启动子的版本(CaMV35S),美国专利5,641,876,它公开了稻肌动蛋白启动子，美国专利申请公开2002/0192813Al，它公开了在有效的才直物表达载体设计中有用的5，、3'和内含子元件，美国专利申请序列号09/757,089，它公开了玉蜀黍叶绿体醛缩酶启动子，美国专利申请序列号08/706,946，它公开了稻谷蛋白启动子；美国专利申请序列号09/757,089，它公开了玉蜀黍醛缩酶(FDA)启动子，以及美国专利申请序列号60/310,370，它公开了玉蜀黍nicotianamine合酶启动子，所述专利全部引入本文作为参考。在植物细胞中起作用的这些以及众多其他启动子是本领域技术人员已知的并且可在本发明的重组多核苷酸中用于提供在转基因植物细胞中表达所需基因。在本发明的某些方面，在植物种子组织中的充分表达是完成种子组成中的改良所需的。用于种子组成修饰的示例性启动子包括来自种子基因例如油菜籽蛋白(美国专利5，420，034)、玉米醇溶蛋白Z27和谷蛋白1(Russell等人(1997)Tra似gem'cT^s.6(2):157-166)，和过氧化物氧还蛋白抗氧化剂(Perl)(Stacy等人(1996)P/朋/7kfo/肠/.31(6):1205-1216)、玉蜀黍L3油质蛋白(U.S.6,433,252)、球蛋白1(Belanger等人(1991)Genetics129:863-872)的启动子。在本发明的其他方面，在植物绿色组织中的优先表达是所需的。用于此类用途的目的启动子包括来自基因的那些，例如鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)小亚基(Fischhoff等人(1992)PlantMolBiol.20:81-93)、醛缩酶和丙酮酸正石粦酉臾二^效酵(PPDK)(Taniguchi等人(2000)P/c打fCe〃P/^Wo/.41(1):42-48)。此外，启动子可以被改变以包含多重"增强子序列"以帮助提高基因表达。此类增强子是本领域已知的。通过在此类构建体中包含增强子序列，可以增强所选蛋白质的表达。这些增强子通常在真核细胞中起作用的启动子的转录起始的5，发现，但通常可以插入编码序列的上游(5，)或下游(3，)。在某些情况下，这些5'增强元件是内含子。作为增强子特别有用的是稻肌动蛋白1(参见美国专利5,641,876)和稻肌动蛋白2基因的5，内含子、玉蜀黍乙醇脱氢酶基因内含子、玉蜀黍热休克蛋白70基因内含子(美国专利5,593,874)和玉蜀黍shrunken1基因。在本发明的其他方面，需要在植物种子组织中的充分表达以完成种子组成的改良。用于种子组成修饰的示例性启动子包括来自种子基因的启动子，例如油菜籽蛋白(U.S.5,420,034)、玉蜀黍L3油质蛋白(U.S.6,433,252)、玉米醇溶蛋白Z27(Russell等人(1997)7>,gem'c6(2):157-166)、球蛋白1(Belanger等人(1991)Genetics129:863-872)、谷蛋白1(Russell(1997)同上)、和过氧化物氧还蛋白抗氧化剂(Perl)(Stacy等人(1996)尸/"WMo/S/o/.31(6):1205-1216)。根据本发明制备的重组DNA构建体通常还将包括3'元件，它一般包含多腺苷酸化信号和位点。众所周知的3，元件包括来自根癌土壤杆菌基因的那些，例如引入本文作为参考的U.S.6,090,627中公开的w^3'、fm/3'、fwr3'、_T、o"3'、^73';来自才4物基因例啧口小麦(普通小麦(7W"cwm热^f木克蛋白17(/^//73')、小麦遍在蛋白基因、小麦果糖-l,6-二磷酸酶基因、稻谷蛋白基因稻乳酸脱氩酶基因和稻p微管蛋白基因的3，元件，所有这些都在引入本文作为参考的美国公开专利申请2002/0192813Al中公开；和豌豆(尸&wwm"vww)核酮糖二磷酸羧化酶基因(r^3'),和来自宿主植物中的基因的3'元件。构建体和载体还可包括用于将基因靶靶向植物细胞器，特别是叶绿体、白色体或其他质体细胞器的转运肽。关于叶绿体转运肽使用的描述参见引入本文作为参考的美国专利5,188,642和美国专利号5,728,925。关于在本发明中有用的鼠耳芥EPSPS基因的转运肽区域的描述，参见Klee,H丄等人(MGG(1987)210:437-442)。包括或来源于用重组DNA转化的本发明植物细胞的转基因植物可以进一步用堆积'性状增强，例如农作物植物具有的由本文公开的DNA表达产生的增强的性状，与除草剂和/或害虫抗性性状组合。例如，本发明的基因可以与其他农艺目的性状堆积，例如提供除草剂抗性或昆虫抗性的性状，例如使用来自苏云金芽孢杆菌(S"c/〃w^mn'"gera^)的基因以^是供针对鳞翅昆虫、鞘翅昆虫(coliopteran)、同翅昆虫、半翅昆虫(hemiopteran)和其他昆虫的抗性。其转基因植物耐受性已证实以及可以应用本发明方法的除草剂包括，但不限于，草甘膦、麦草畏、草铵膦、磺酰脲类、溴苯腈和达草灭除草剂。编码涉及除草剂耐受性的蛋白质的多核苷酸分子是本领域众所周知的，并且包括，但不限于，美国专利5,094,945;5,627,061;5,633,435和6，040,497中公开的、赋予草甘膦耐受性的编码5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的多核香酸分子；美国专利5,463,175中公开的编码草甘膦氧化还原酶(GOX)的多核苷酸分子，和美国专利申请公开2003/0083480Al中公开的、同样赋予草甘膦耐受性的草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT);美国专利申请公开2003/0135879Al中公开的、赋予麦草畏耐受性的麦草畏单加氧酶；美国专利4,810,648中公开的、赋予溴苯腈耐受性的编码溴苯腈腈水解酶(Sx/7)的多核苷酸分200580048534.0)尸/朋f丄4:833-840和Misawa等人，(1994)尸/a^汄6:481-489中描述的、关于达草灭耐受性的编码八氢番茄红素去饱和酶(cW/)的多核香酸分子；Sathasiivan等人(1990)7Vmc/.力c/A18:2188-2193中描述的、赋予对磺酰脲类除草剂耐受性的编码乙酰羟酸合酶(AHAS,ALS)的多核普酸分子；DeBlock，等人(1987)EMS(9丄6:2513-2519中公开的、赋予草铵膦和双丙氨酰膦耐受性的称为6w基因的多核苷酸分子；美国专利申请公开2003/010609Al中公开的、赋予N氨基曱基膦酸耐受性的多核苷酸分子；美国专利6,107,549中公开的、赋予吡啶除草剂抗性的多核苷酸分子；赋予多重除草剂例如草甘膦、莠去津、ALS抑制剂、isoxoflutole和草铵膦除草剂耐受性的分子和方法公开于美国专利6,376,754和美国专利申请公开2002/0112260中，所有所述美国专利和专利申请公开都引入本文作为参考。赋予昆虫/线虫/病毒抗性的分子和方法公开于美国专利5，250，515;5,880,275;6,506,599;5，986，175和美国专利申请7>开2003/0150017Al中，所有所述专利引入本文作为参考。在具体实施方案中，本发明人预期了与本文公开的蛋白质结合的单克隆或多克隆抗体的用途。制备和表征抗体的方法是本领域众所周知的(参见，例如Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1988;引入本文作为参考)。产生单克隆抗体(mAbs)的方法一般根据与制备多克隆抗体的那些相同的路线开始。简言之，多克隆抗体通过用依照本发明的免疫原性组合物免疫动物并收集来自免疫动物的抗血清来制备。广泛范围的动物物种可以用于生产抗血清。一般地，用于生产抗血清的动物是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。因为兔的血量相对较大，所以兔是生产多克隆抗体的优选选择。如本领域众所周知的，给定组合物在其免疫原性方面可以不同。因此通常必须加强宿主的免疫系统，如可以通过将肽或多肽免疫原与载体偶联来完成。示例性和优选的载体是匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清清蛋白(BSA)。其他清蛋白例如卵清蛋白、小鼠血清清蛋白或兔血清清蛋白也可用作载体。使多肽与载体蛋白缀合的方法是本领域众所周知的并且包括使用戊二醛、间-马来酰亚胺苯曱酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、石炭二亚胺和bis-biazotized耳关苯胺。18如本领域众所周知的，特定免疫原组合物的免疫原性可以通过使用称为佐剂的非特异性免疫应答刺激物增强。示例性和优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(包含杀死的结核分枝杆菌(A^yco^cfeWww/^ercw/a^)的非特异性免疫应答刺激物)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。用于生产多克隆抗体的免疫原组合物的量依免疫原的性质以及用于免疫接种的动物而变。多种途径可以用于施用免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。多克隆抗体的生产可以通过免疫动物在免疫接种后各个点上的抽样血液来监控。还可以给予第二次加强注射。重复加强和滴定过程直至达到合适滴度。当获得所需免疫原性水平时，可以对免疫的动物抽血并分离且贮存血清，和/或动物可以用于生产mAbs。通过使用众所周知的技术可以容易地制备mAbs，例如引入本文作为参考的美国专利号4,196,265中例示的那些。一般地，这项技术涉及用所选免疫原组合物，例如纯化或部分纯化的抗真菌蛋白、多肽或肽免疫合适的动物。免疫组合物以有效刺激抗体生产性细胞的方式施用。啮齿类动物例如小鼠和大鼠是优选的动物，然而，兔、羊或青蛙细胞的使用也是可能的。大鼠的使用可以提供一定的优点(Goding,1986，第60-61页)，但小鼠是优选的，BALB/c小鼠是最优选的，因为这是最常规使用的并且一般给出更高百分比的稳定融合物。免疫接种后，选择具有生产抗体潜力的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)在mAb生产方案中使用。这些细胞从活组织检查的脾、扁桃体或淋巴结，或从外周血样品中获得。优选脾细胞和外周血细胞，前者是因为它们是成浆细胞分裂阶段中的抗体生产性细胞的丰富来源，并且后者是因为外周血易于获得。通常，一组动物将是已免疫的并且将取出具有最高抗体滴度的动物脾，并通过用注射器使脾匀浆来获得脾淋巴细胞。一般地，来自免疫的小鼠的脾包含大约5xl07-2xl08的淋巴细胞。来自免疫的动物的抗体生产性B淋巴细胞随后与无限增殖骨髓瘤细胞的细胞融合，所述无限增殖骨髓瘤细胞一般是与被免疫的动物相同物种的。适合用于杂交瘤生产性融合操作的骨髓瘤细胞系优选是非抗体生产性的，具有高融合效率，并且具有致使它们不能在特定选择性培养基上生长的酶缺陷，所述选择性培养基只支持所需融合细胞(杂交瘤)生长。众多骨髓瘤细胞中的任何一种都可使用，如本领域技术人员已知的(Goding,1986，第65-66页；Campbell,1984,第75-83页)。例如，当免疫的动物是小鼠时，人们可以使用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NSl/l.Ag41、Sp210匿Ag14、FO、NSO/U、MPC-ll、MPCll-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul;对于大鼠，人们可以使用R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和4B210;并且U-266、GM1500画GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6均在人细胞融合方面有用。一种优选的鼠类骨髓瘤细胞是NS-1骨髓瘤细胞系(也称为P3-NS-1-Ag4-1),它通过要求细胞系保藏号GM3573从NIGMSHumanGeneticMutantCellRepository容易获得。可以使用的另一种小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮鸟嘌呤抗性小鼠鼠类骨髓瘤SP2/0非生产者细胞系。用于产生抗体生产性脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂交体的方法通常包括使体细胞与骨髓瘤细胞以2:1的比率混合，尽管在促进细胞膜融合的一种或多种试剂(化学或电)的存在下，比率可以分别为约20:1到约1:1。使用Spend病毒的融合方法(Kohler和Milstein，1975;1976)，以及使用聚乙二醇(PEG)，例如37%(v/v)PEG的那些(Gefter等人，1977)已得到描述。使用电诱导的融合方法也是适当的(Goding，1986,第71-74页)。融合方法通常以低频率产生能存活的杂交体，约lxlO-6-lxl(T8。然而，这不造成问题，因为通过在选择性培养基中培养可以将能存活的、融合的杂交体与亲本、未融合的细胞(特别是未融合的骨髓瘤细胞，它将通常继续无限地分裂)区分开。选择性培养基一般是包含阻断组织培养基中核苷酸从头合成的试剂。示例'性和优选试剂是氨基蝶呤、氨甲蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和氨曱蝶呤阻断嘌呤和嘧啶的从头合成，而重氮丝氨酸只阻断噪呤合成。当使用氨基蝶呤或氨甲蝶呤时，培养基补加了次黄。票呤和胸普作为核苷酸来源(HAT培养基)。当使用重氮丝氨酸时，培养基补加了次黄嘌呤。优选的选择性培养基是HAT。只有能够操作核苷酸补救途径的细胞能够在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞在补救途径的关键酶例如次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(HPRT)上有缺陷，并且它们不能存活。B20细胞可以操作这个途径，但它们在培养中具有有限的寿命并且一般在约2周内死亡。因此可以在选择性培养基中存活的唯一细胞是由骨髓瘤和B细胞形成的那些杂交体。这种培养提供杂交瘤群体，从中可以选择特定的杂交瘤。一般地，杂交瘤的选择如下进行通过在微量滴定板中单个克隆稀释培养细胞，随后测试个别克隆上清液(约2-3周后)的所需反应性。测定应该是灵敏、简单且快速的，例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬菌斑测定、免疫酶斑测定等。选择的杂交瘤随后可以系列稀释并克隆到个别的抗体生产性细胞系中，其克隆可以随后无限地繁殖以提供mAbs。可以采用细胞系以2种基本方式生产mAb。杂交瘤的样品可以注射(通常注射到腹膜腔内)到组织相容性动物类型中，所述动物用于提供最初融合的体细胞和骨髓瘤细胞。注射的动物发展出分泌特定单克隆抗体的肿瘤，所述抗体由融合的细胞杂交体产生。随后可以抽耳又动物的体液，例如血清或腹水，以提供高浓度的mAbs。个别细胞系还可在体外培养，其中mAbs天然分泌到培养基中，从中它们可以容易地以高浓度获得。如果需要，通过任一方法产生的mAbs可以使用过滤、离心和各种色镨法例如HPLC或亲和色谱进一步纯化。才直物细力包转化方法用重组DNA转化植物细胞的众多方法是本领域已知的并且可以在本发明中使用。用于植物转化的2种常用方法是土壤杆菌属介导的转化和微粒轰击。微粒轰击方法在美国专利5,015,580(大豆)；5,550,318(玉米)；5,538,880(玉米)；5,914,451(大豆)；6,160,208(玉米)；6,399,861(玉米)和6,153,812(小麦)中说明，并且土壤杆菌属介导的转化在美国专利5,159,135(棉花);5,824,877(大豆);5,591,616(玉米)；和6,384,301(大豆)中描述，所有专利都引入本文作为参考。对于基于根癌土壤杆菌的植物转化系统，在转化构建体上存在的另外元件将包括T-DNA左和右边界序列以促进重组多核苷酸整合到植物基因组中。一般而言，在耙植物系的基因组中随机即在非特异性位置导入重组DNA是有用的。在特殊情况下，靶向重组DNA插入片段可以是有用的，以实现位点特异性整合，例如代替基因组中的现有基因，使用植物基因组中现有的启动子，或在已知对于基因表达有活性的预定位点插入重组多核苷酸。现有的已知对植入物起作用的几种位点特异性重组系统包括如美国专利4,959,317中公开的cre-lox,以及如美国专利5,527,695中^>开的FLP-FRT,两个所述专利都引入本文作为参考。本发明的转化方法优选在培养基上和控制环境中的组织培养中实践。"培养基，，指众多营养物混合物，它们用于体外培养细胞，即在完整活生物之外。受体细胞靶包括，但不限于，分生组织细胞，愈伤组织，未成熟胚和配子细胞例如小孢子、花粉、精子和卵细胞。预期的是由其可以再生能育植物的任何细胞用作受体细胞。愈伤组织可以从组织来源开始，包括，但不限于，未成熟胚、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够作为愈伤组织增殖的细胞也是用于遗传转化的受体细胞。用于制备本发明转基因植物的实际转化方法和材料，例如各种培养基和受体靶细胞，未成熟胚细胞的转化和后续能育的转基因植物的再生公开于美国专利6,194,636和6,232,526中，它们引入本文作为参#。口、、、、、、'、、培育本发明的转化植物的后代，包括用于选择具有增强的性状的植物的杂交植物系。除了用重组DNA直接转化植物外，通过使具有重组DNA的第一种植物与缺乏DNA的第二种植物杂交可以制备转基因植物。例如，重组DNA可以导入顺应转化以生产转基因^t物的第一种植物系中，所述第一种植物系可以与第二种植物系杂交以使重组DNA基因渐渗到第二种植物系中。具有提供增强的性状例如增强的产量的重组DNA的转基因植物可以与具有赋予另一种性状例如除草剂抗性或害虫抗性的其他重组DNA的转基因植物系杂交，以生产具有赋予2种性状的重组DNA的后代植物。一般地，在关于组合性状的此类育种中，供给另外性状的转基因植物是雄性系，并且携带基础性状的转基因植物是雌性系。将分离这种杂交的后代，从而使得某些植物将携带关于2种亲本性状的DNA，并且某些将携带关于一种亲本性状的DNA;此类才直物可以通过与亲本重组DNA结合的标记鉴别，例如通过分析重组DNA的标记鉴别，或在其中选择标记连接至重组体的情况下，通过应用选择试剂，例如与除草剂耐受性标记一起使用的除草剂，或通过选择增强的性状。携带2种亲本性状的DNA的后代植物可以与雌性亲本系多次回交，例如通常为6-8代，以产生具有与一种最初转基因亲本系基本上相同的基因型但具有另一种转基因亲本系的重组DNA的后代^i物。在转化实践中，在任何一个转化实验中DNA—般只导入小百分比的靶植物细胞。标记基因用于提供鉴别那些细胞的有效系统，所述细胞通过在其基因组中接受和整合转基因DNA构建体稳定转化。优选的标记基因提供选择标记，所述选择标记赋予针对选择试剂，例如抗生素或除草剂的抗性。本发明植物对其可以是抗性的任何除草剂是选择标记的有用试剂。潜在转化的细胞暴露于选择剂。在存活细胞群体中的将是其中抗性赋予基因一般以足够水平整合并表达以允许细胞存活的那些细胞。可以测试细胞以进一步证实外源DNA的稳定整生素例如卡那霉素和巴龙霉素("/f//)、潮霉素B("p/z/F)和庆大霉素(aad和aacCA)，或针对除草剂例如草铵膦(或/W)和草甘膦(或EPSPS)的抗性。此类选择的实例在美国专利5,550,318;5,633,435;5,780,708和6,118,047中说明,所有专利引入本文作为参考。提供视觉鉴别转化体的能力的选择标记也可以采用，例如表达有色或荧光蛋白质例如萤光素酶或绿色焚光蛋白(GFP)的基因，或表达|3葡糖醛酸糖香酶的基因或其各种显色底物是已知的m/必基因(gus)。暴露于选择剂存活的植物细胞或在筛选测定法中已评分为阳性的植物细胞，可以在再生培养基中培养并允许成熟为植物。由转化的植物细胞再生的发展中的小植物可以转移至植物生长混合物，并在转移至用于成熟的温室或生长室之前使其受冷而变得耐寒，例如在约85%相对湿度、600ppmC02和25-250微爱因斯坦(microeinsteins)n^s"光的环境控制的室中。取决于最初组织，在鉴别出转化体后约6周-10个月再生出植物。可以使用本领域技术人员已知的常规植物育种方法给植物授粉并且产生种子，例如自花传粉通常对转基因玉米使用。可以测试再生的转化植物或其后代种子或植物的重组DNA表达并选择增强的农艺性状的存在。转基因植物和种子将来源于本发明植物细胞的转基因植物培育至产生与对照植物相比具有增强的性状的转基因植物，并产生本发明的转基因种子和单倍体花粉。通过在转化的植物或后代种子中选择增强的性状来鉴别具有增强的性状的此类植物。关于效率，设计选择方法以评估包括重组DNA的多重转基因植物(事件)，例如来自2-20个或更多转基因事件的多重植物。从本文提供的转基因种子培育的转基因植物证实有助于增加产量的改良的农艺性状，或提供增加的植物价值，包括例如改良的种子质量的其他性状。特别感兴趣的是具有增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油的植物。表1提供了编码蛋白质的DNA("基因")列表，它用作生产具有增强的农艺性状的转基因植物的重组DNA，表1的元件通过参考下列来描述"PEPSEQ"鉴别SEQIDNO:84-166的氨基酸序列。"NUCSEQ"鉴别SEQIDNO:l—83的DNA序列。"基础载体"鉴别用于转化重组DNA的基础质粒。"蛋白质名称"是由重组DNA编码的蛋白质的俗名。"增强的性状"鉴别由蛋白质在转基因农作物植物中表达赋予的增强的性状。"质粒ID"鉴别关于植物转化质粒的任意名称，包括用于在植物细胞中表达重组DNA的重组DNA。表1PEPNU基础栽体蛋白质名称增强的性状质粒IDSECQSEQIDIDNONO84)pMON65I54乳酰谷胱苦肽裂合酶增强的种子蛋白质pMON69462852pMON72472rab7c增强的耐寒性pMON69456863pMON65154CDPK激酶结构域增强的水利用效率pMON6775424<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>具有增强的农艺性状的转基因植物的选择方法在用重组DNA转化的植物细胞再生的转基因植物群体中，比产生种子和后代植物的能育的转基因植物活得长的许多植物将不显示增强的农艺特性。从群体选择必需鉴别一种或多种转基因植物细胞，它们可以提供具有增强的性状的植物。具有增强的性状的转基因植物选自再生或来源于如本文所述转化的植物细胞的植物群体，这通过在多种测定中评估植物以检测增强的性状，例如增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。这些测定还可以采取多种形式，包括，但不限于，在温室或田间试验中直接筛选性状或通过篩选替代性状。此类分析可以涉及检测植物化学组成、生物量、生理性质、形态学中的改变。化学组成中例如谷粒的营养组成的改变可以通过分析种子组成和蛋白质含量、游离氨基酸、油、游离脂肪酸、淀粉或生育酚来检测。生物量特征中的改变可以对温室或田间生长植物进行，并且可以包括植物高度、茎直径、根和枝条干重；和，对于玉米植物，谷穗长度和直径。生理性质中的改变可以通过评估针对应激条件的应答来鉴定，例如使用施加的应激条件例如水分亏缺、缺氮、寒冷生长条件、病原体或昆虫攻击或光缺乏、或增加的植物密度的测定。形态学中的改变可以通过目视观察具有增强的农艺性状的转化植物看起来也是正常植物，与朝向丛状分枝、更高、更厚、更狭窄的叶、有条紋的叶、具节的性状、缺绿症、白化、花色素苷产生、或改变的雄花穗、谷穗或根的改变比较的趋势。其他选择性质包括花粉释放的天数、抽丝的天数、叶伸展速率、叶绿素含量、叶温度、直立、幼苗活力、节间长度、植物高度、叶数目、叶面积、分蘖、支柱根、保持绿色(staygreen)、茎倒伏、根倒伏、植物健康状况、不育/多育、绿色植物突然折断(greensnap)和害虫抗性。另外，可以评估收获的谷粒的表型特征，包括谷穗上每行的谷粒数目、谷穗上谷粒的行数、谷粒败育、谷粒重量、谷粒大小、谷粒密度和物理谷粒质量。尽管本发明的植物细胞和方法可以应用于任何植物细胞、植物、种子或花粉，例如任何果实、蔬菜、草、树或观赏植物，但本发明的各个方面优选应用于玉米、大豆、棉花、低芥酸菜子、苜蓿、小麦和稻植物。在许多情况下，本发明应用于对来自MaldeRioCuarto病毒或高粱柄锈菌真菌或两者的疾病有固有抗性的玉米植物。包括下列实施例以证实本发明的方面，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可在公开的具体方面进行许多改变并且仍获得相同或相似结果。实施例1.植物表达构建体A.用于玉米转化的植物表达构建体这个实施例说明了用于将重组DNA转化到植物细胞中的质粒的构建，所述植物细胞能够再生为本发明的转基因植物。在编码序列的起始和终止密码子处或附近设计用于PCR扩增重组DNA的蛋白质编码核苷酸的引物，以消除大部分5，和3'非翻译区。编码表l中鉴别的蛋白质的每种重组DNA在插入如表1中参考的基础载体之一的插入位点中之前通过PCR进行扩增。使用GATEWAYDestination植物表达载体系统(从InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA获得)建造基础植物转化载体pMON65154用于制备转化到玉米组织中的重组DNA。参考下表3中<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>是稻肌动蛋白启动子和稻肌动蛋白内含子，(b)加入来自土壤杆菌属的左和右T-DNA边界序列，右边界序列位于稻肌动蛋白1启动子的5',并且左边界序列位于35S启动子的3，，和(c)加入DNA以促进质粒在大肠杆菌和根癌土壤杆菌中的复制。在T-DNA边界序列外加入质粒的DNA包括在土壤杆菌属中起作用的on'V广泛宿主范围的DNA复制起点，在大肠杆菌中起作用的pBR322复制起点，和在大肠杆菌和土壤杆菌属中用于选择的壮观霉素/链霉素抗性基因。使用本领域已知的技术装配表4中举例说明的另一基础载体pMON82060(SEQIDNO:10026)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>B.用于大豆转化的植物表达载体还制备了在大豆转化中使用的质粒。下表5中显示了示例性共同表达载体质粒pMON74532(SEQIDNO:10027)的元件。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>密码子处或附近设计用于PCR扩增的引物，以消除大部分5，和3，非翻译区。实施例2.玉米转化这个实施例说明了在生产本发明的转基因玉米植物细胞、植物、种子和花粉中有用的植物细胞转化方法，以及具有增强的性状的转基因玉米植物和种子的生产和鉴别，所述增强的性状即增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。通过将表1中鉴别的DNA克隆到鉴别的基础载体中制备质粒载体，以用于玉米植物细胞的玉米转化中以生产转基因玉米植物和后代植物、种子和花粉。对于土壤杆菌属介导的玉米胚细胞转化，将容易转化的玉米植物系(命名为LH59)在温室中培育，并且当胚长度为1.5-2.0mm时收获谷穗。通过喷雾或将谷穗浸泡在80%乙醇中，随后风干来表面灭菌谷穗。从表面灭菌的谷穗上的个别谷粒分离出未成熟胚。在接种玉蜀黍细胞前，土壤杆菌属细胞在室温下生长过夜。未成熟的玉蜀黍胚细胞在切割后很快用土壤杆菌属接种，并在室温下与土壤杆菌属一起温育5-20分钟。未成熟胚植物细胞随后与土壤杆菌属在23。C在黑暗中共培养1-3天。将共培养的胚转移至选择培养基并培养大约2周，以允许胚发生愈伤组织发育。胚发生愈伤组织转移至包含100mg/L巴龙霉素的培养基中并在约2周的时间间隔进行传代培养。在选择开始后6-8周回收转化的植物细胞。对于土壤杆菌属介导的玉蜀黍愈伤组织的转化，未成熟胚在切割后培养大约8-21天以允许愈伤组织发育。愈伤组织随后在室温下与土壤杆菌属悬浮液一起温育约30分钟，随后通过抽吸去除液体。愈伤组织和土壤杆菌属不加选择地共培养3-6天，随后通过对巴龙霉素选择大约6周，每两周一次转移至新鲜培养基，并且巴龙霉素抗性愈伤组织鉴别为在表达盒中包含重组DNA。对于通过微粒轰击的转化，在轰击前3-4天分离并培养未成熟的玉蜀黍胚。在微粒轰击前，制备金颗粒悬浮液，在其上沉淀所需重组DNA表达盒。如美国专利5,550,318和6,399,861中所述，使用放电粒子加速基因递送装置将DNA导入玉蜀黍细胞中。在微粒轰击后，组织在黑暗中在27°C培养。用于制备本发明转基因植物的另外的转化36方法和材料，例如，各种培养基和受体靶细胞、未成熟胚的转化和后续能育的转基因植物的再生公开于美国专利6,194,636和6，232，526以及美国专利申请序列号09/757,089中，其引入本文作为参考。为了再生转基因玉米植物，由转化产生的转基因植物细胞的愈伤组织置于培养基上以起始小植物的枝条发育，所述小植物转移至盆栽土壤以在生长室中在26。C起始生长，随后为喷雾苗床，之后移植至5英寸罐中，在其中植物生长至成熟。再生的植物自体受精并收获种子以用于在一种或多种方法中选择种子、幼苗或后代第二代转基因植物(R2植物)或杂交体，例如通过与对照植物比较选择显示增强的性状的转基因植物。转基因玉米植物细胞用来自表1中鉴别的每种基因的重组DNA转化。如实施例5中报告的，筛选后代转基因植物和转化的植物细胞的种子的增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。实施例3.大豆转化物转化，^及具有下列特性的转基因大豆^转基因种子的生产和鉴别增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。对于土壤杆菌属介导的转化，大豆种子发芽过夜并切下分生组织外植体。分生组织和外植体置于创伤容器中。大豆外植体和诱导的土壤杆菌属细胞在种子发芽开始后不迟于14小时混合，并且使用超声处理进行创伤，所述土壤杆菌属细胞来自包含具有目的基因盒和植物选择标记盒的质粒DNA的菌林。创伤后，外植体置于共培养中2-5天，在这个点上它们转移至选择培养基6-8周，以允许选择和培育转基因枝条。大约6-8周收获性状阳性枝条并置于选择性生根培养基中2-3周。生根的枝条转移至温室并在土壤中进行盆载。对选择保持健康但不产生根的枝条转移至非选择性生根培养基另外2周。对来自中止选择产生根的任何枝条的根测试植物选择标记的表达，之后将它们转移至温室并土壤中进行盆载。另外，如引入本文作为参考的美国专利5,015,580中所述，DNA构建体可以通过粒子轰击转移至大豆细胞基因组中，并且细胞再生为能育的大豆植物。用来自表1中鉴别的每种基因的重组DNA转化转基因大豆植物细胞。如实施例5中报告的，筛选后代转基因植物和转化的植物细胞种子的增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。实施例4.同源物鉴别这个实施例说明了表1中鉴别的DNA编码的蛋白质同源物的鉴别，它用于提供具有增强的农艺性状的转基因种子和植物。从来自同源物的序列中，可以鉴别同源DNA序列以用于制备本发明的具有增强的农艺性状的另外的转基因种子和植物。使用有所有权的序列数据库和国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(NCBI)非冗余氨基酸数据库(nr.aa)构建已知蛋白质序列的"所有蛋白质数据库"。对于从中获得本文提供的多核苷酸序列的每种生物，构建生物的已知蛋白质序列的"生物蛋白质数据库"；它是基于生物的NCBI分类学ID的所有蛋白质数据库的子集。使用NCBI"blastp"程序，E值截止值le-8，使用本文提供的氨基酸序列如SEQIDNO:84-SEQIDNO:166查询所有蛋白质数据库。记录最高达1000的最高命中并通过生物名称分开。对于除查询序列的生物以外的每种生物，记录来自查询生物自身的命中列表，其具有比生物的最佳命中更显著的E值。列表包含本文提供的多核苷酸的可能的重复基因，并称为核心列表。另一列表记录来自每种生物的所有命中，通过E值分选，并称为命中列表。使用NCBI"blastp"程序，E值截止值le-4，使用本文提供的多肽序列如SEQIDNO:84-SEQIDNO:166查询生物蛋白质数据库。记录最高达1000的最高命中。基于这些命中构建BLAST可检索数据库，并称为"SubDB"。使用NCBI"blastp"程序，E值截止值le-8,使用命中列表中的每种序列查询SubDB。具有最佳E值的命中与来自相应生物的核心列表比较。如果命中属于核心列表，则认为它是可能的直向同源物，否则就认为它不是可能的直向同源物，并且不在相同生物的命中列表中进一步检索序列。通过SEQIDNO:167-SEQIDNO:10023的氨基酸序列鉴别并报告来自大量不同生物的同源物。在表2中鉴别了SEQIDNO:84-166的蛋白质以及SEQIDNO:167_1002338的同源物之间的这些关系。对于每种同源物的来源生物见序列表。表2PEPSEQIDNO:同源物SEQIDNOs84:427440077537147224651788187385382486210120903705513726462804902262488201614590782472717"4755591631727865666687211690181922002515032263146458628112857292422645432496990314785545383775124844954769558216271333944385421561232158766877345228"34972097425774497281370845132001"259319413366862146969810362026129255661816951979424392621520287880811392195099994392'21217824236751026717154194"70515294096602826685:1163395495655913809613103871301929261456277044612570509979463，96651600727073126531"788803892049176067635269022025251642139"6謂354042213431137249926959938357278396190370174787064038714954131538809494677385752072753299365886:2511251370677055564796089399"20986745642527776923233476509205252584504536338473297133175132438135476755582719617761616180160630665"77254747-286839533995921882451471105046029環5705104387:73382565137261988197803721692638478728620518010462925698521765960816080272719445731761681988166631295862010780146944265392899251675609957251040593327041356356859370153351904551059655387459512184792194763408709512149077321170507106478835343093771588:900484503918372151685068664345863652464156443227760367375472603814617557919454243622784913245396512319365967846403600417111561807576566192992354823323869454945388371238697178746538825813711609312034378825715856231313733561373691823941575805147881862824612543663396867662768376627664527852608016255825662530951559218962389271746793表2(续)693669388284522593232932493253286697660251099625187674357758171966269].340955563491981886,3609790774277452584877680048626690875751936618959522548155192105540614017978199558231125459444087823431911804631925865466993498866588'1894577.'124453323952981827009827695871673762925935044434496832048580107752759915"749160165327011637535052991843417810018704028942821562468093707560457321"68136722368967213373890266568928846213369106695622031962216118416271719683387040948343834221330<563358822248238061766'2692903838490089007384320407982900190024781606彻74852559515091018810087516816934789:9376798779948028800897327256725866056606728031399607743967119237923665851956198219797291729012008901729372957315729772796624660166226584658363877341961226428431637321732439476330662066006598667539224296375348996243425341288555206998313105607360746.0757571915731577568807175655977"6772441849782072353250600010586372938173694775410960999989373657965596561206872《11664317186357103812162427066806925"752226840863943783059626293382659814566469005429464576451807580933747355874767"5"73171709655837"32806580184590:"643384342973241697256725872606605660672809607313131486585438839401"7243729172901200123112076265729572937315729772797792778866246601662265836584689172537277726272727271732473216598662066009922762366759831206931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389918229779439078892477014825002134120645313647767117295638848997235.9967431784738500407766468807920050614796915889499519830015873081887110622037474514534857691531541699236723773"624332506579186384691717"72372236862691846714,5205827681979098157941958865768120415003392386751745725692377315725342538494655979563126841087778075864216286576244314782"5917909976925210884976.91917247603925867769282707258658572797277412817665613,8477288330598093表2(续)2767774677491321600777247373737635587476173217341740173821220067147317731816891709655877163764435797179686580847654571346实施例5.具有增强的农艺性状的转基因植物的选择这个实施例说明了通过筛选衍生的植物和种子的增强的性状鉴别本发明的植物细胞。具有表1中鉴别的重组DNA的转基因玉米种子和植物通过用DNA转化的植物细胞制备，所述DNA稳定整合到玉米细胞的基因组中。使用测量方法选择转基因种子、小植物和后代植物。转基因玉米植物细胞用来自表1中鉴别的每种基因的重组DNA转化。与对照植物比较筛选转化的植物细胞的后代转基因植物和种子的增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。A.增强的氮利用效率的选择可以在高通量氮(N)选择方法中测试转基因玉米植物(作为杂交体测试)的生理效率的氮利用效率(NUE)性状。使用统计学模型比较收集的数据与来自野生型对照的测量结果，以确定改变是否归因于转基因。使用SAS软件分析原始数据。本文显示的结果是转基因植物相对于野生型对照的比较。(1)用于设置NUE方案的培养基制备使用的种植培养基是MetroMix200(厂商Hummert)Cat.#10-0325，ScottsMicroMaxNutrients(厂商Hummert)Cat.#07-6330,OS41/3"x37/8"罐(厂商:Hummert)Cat.#16-1415,OS盘(厂商:Hummert)Cat.#16-1515,Hoagland氏大量营养物溶液，Plastic5"桩(厂商Hummert)黄色Cat.#49-1569,白色Cat.弁49-1505,具有说明材料的编号的标签包含在罐中。用MetroMix200装填500个罐至边缘，重量为140g/罐。通过使用平衡器均一地装填罐。向每个罐中加入0.4gMicroMax营养物。用刮4产4觉拌成分至3英寸深，同时防止材料损失。(2)在温室中设置NUE选择(a)种子发芽-使用逆向渗透的纯化水给每个罐轻微地浇水277次。安排第一次浇水紧在种植之前发生；并且第二次浇水在种子已种植到罐中之后。种植每次入组的IO粒种子(每罐1粒种子)以选择8个健康状态均一的幼苗。种植另外的野生型对照用作边界行。可替代地，种植每次入组的15粒种子(每罐1粒种子)以选择12个健康状态均一的幼苗(这个较大的种植数目用于第二次或证实种植)。将罐在Conviron生长室中的12个架子的每一个上放置7天。这样做是为了允许更均一的发芽和早期的幼苗生长。随后的生长室设定为25°C/曰和22。C/夜，14小时光照和10小时黑暗，湿度~80%,以及光强度350|imol/m2/s(在罐的水平上)。经由类似于温室工作台的毛细管垫子在每天3次10分钟的持续时间内进行浇水。(b)幼苗转移-7天后，分别选择第一次或证实途径运行的最佳的8或12个幼苗，并转移至温室工作台。使用毛细管垫子上印刷的间隔图案使罐相隔8英寸(中心与中心)并置于工作台上。Vattex垫子产生384位网格，其中所有列、行组合随机化。另外的对照罐沿着实验区组外放置以减少边界作用。允许植物在低N运行下生长28天或在高N运行下生长23天。大量营养物以大量营养物溶液(参见下文的组合物)的形式分配，所述溶液包含精确量的添加的N(对于限制性N选择为2mMNH4N03并且对于高N选择运行为20mMNH4NO3)。每个罐分别在高N和低N运行种植后8和10天时开始隔日人工分配100ml营养物溶液，一周3次。在营养物应用的当天，跳过05:00和13:00时的2次20分钟浇水。每第3次运行应当更换Vatter垫子以避免N积聚和根物质的累积。表7显示对于低或高氮选择的营养物溶液中营养物的量。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>注用HC1或KOH将pH调整至5.6(c)收获测量结果和数据收集-植物在低N运行下生长28天和植物在高N运行下生长23天后，进行下列测量(括号中为phenocodes):通过Sartorius电子天平测量的总枝条新鲜质量(g)(SFM)，通过MinoltaSPAD计测量的V6叶叶绿素(相对单位XLC),通过Li-Cor叶面积计测量的V6叶面积(cm2)(LA)，通过Sartorius电子天平测量的V6叶新鲜质量(g)(LFM)，以及通过Sartorius电子天平测量的V6叶干质量(g)(LDM)。通过SAS软件分析原始数据。显示的结果是转基因植物相对于野生型对照的比较。为了进行叶读取，从V6叶上切下样品。因为玉米叶的叶绿素计阅读受到叶的部分和叶在取样的植物上的位置影响，所以SPAD计阅读在植物的第6片叶上进行。每片叶进行3次测量，其中第一次阅读取自在叶尖和环之间一半距离，以及从叶缘到中脉的一半的点，而2次向叶尖获取。测量限制在叶总长度的1/2-3/4(从底部)的区域，它们之间的间隔大约相等。从SPAD机器获取3次测量结果的平均值。记录切下的V6叶的叶新鲜质量，将叶置于纸袋中。包含叶的纸袋随后置于强制空气烘箱中在80。C进行3天。3天后，从烘箱中取出纸袋并进行叶干质量测量。由收集的数据进行2次衍生测量(1)叶叶绿素面积(LCA),这是V6相对叶绿素含量与其叶面积(相对单位)的乘积。叶叶绿素面积=叶叶绿素x叶面积。这个参数给出了叶绿素在整个叶面积上的展开的指示；(2)比叶面积(LSA)计算为V6叶面积与其干质量的比(cmVg干质量)，这个参数还识别为NUE的测量。数据显示于表8中。<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>表8(续)<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表8(续)<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>氮使用田间效率测定源。转基因植物和对照植i通过i因型和构建体分群，其;对照随i安排在基因型区组中。每种类型的转基因植物通过3次重复并横过5个位置进行测试。通过收集来自0-24"和24-48"土壤层的30个样品土壤核心在4月初的预先种植中分析田间的氮水平。分析土壤样品的硝酸盐-氮、磷(P)、钾(K)、有机物质和pH以提供基线值。基于土壤测试建议应用P、K和微量营养物。水平II.将本发明提供的转基因植物种植在应用3种氮(N)肥料水平的田间，即低水平(0N)、中等水平(80磅/英亩(lb/ac))和高水平(180磅/英亩)。液体28%或32%UAN(尿素，铵态氮)用作N源并通过散播吊杆应用，且合并在与预期的农作物行相同的方向具有后翻滚篮(rearrollingbasket)的田地中耕机。尽管对于ON处理没有应用N，但土壤仍应当以与处理的区域相同的方式扰动。转基因植物和对照植物通过基因型和构建体分群，其中对照随机安排在基因型区组中。每种类型的转基因植物通过3次重复并横过4个位置进行测试。通过收集来自0-24"和24-48"土壤层的30个样品土壤核心在4月初的预先种植中分析田间的氮水平。分析土壤样品的硝酸盐-氮、磷(P)、钾(K)、有机物质和pH以提供基线值。基于土壤测试建议应用P、K和微量营养物。表9.基因在不同氮水平的转基因植物中增加种子产量。<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>B.对于增加的产量的选择本发明的多种转基因植物与对照植物比较显示出改善的产量。改善的产量可以由增强的种子库潜力(sinkpotential)，即胚乳细胞或谷粒的数目和大小和/或增强的库强(sinkstrength),即淀粉生物合成的速率引起。库潜力可以在谷粒发展过程的非常早期确定，因为胚乳细胞数目和大小在4受^^分后最初几天内测定。在过去几十年中玉米产量的许多增加由种植密度的增加产生。在那个时期，玉米产量以2.1蒲式耳/英亩/年的速率增加，而种植密度已以250林植物/英亩/年的速率增加。现代杂交玉米的特征是这些变种以高密度种植的能力。许多研究已显示高于目前的种植密度应当导致更多生物量产生，但目前的种质在这些更高的密度上执行得不好。在高密度种植中增加产量的一个方法是增加收获指数(HI)，这是与总生物量比较分配给谷粒的生物量的比例。增强的所得转基因玉米事件的有效产量选择使用在多个位置的转基因事件的杂交后代，其中植物在最佳生产管理实践和最大害虫控制下生长。对于改善的产量有用的靶是，与来自对照植物种子培育的植物产生的产量比较，产量增加5%-10%。选择方法可以在多个和不同的地理位置中应用，例如最高达16或更多个位置，经过一个或多个种植季节，例如至少2个种植季节，以统计学区分产量改进与天然环境作用。在标准地块中种植多重转基因植物、阳性和阴性对照植物、以及授粉者植物，例如2排地块，20英尺长5英尺宽，排间距为30英寸，并且行之间有3英尺小径。转基因事件可以通过重组DNA构建体分群，群随机置于田间。当使用雄性不育转基因事件时，每2块地块种植高质量玉米系的授粉者地块以允许自由传粉。有用的种植密度是约30,0004朱植物/英亩。高种植密度大于30,0004朱植物/英亩，优选约40,000株植物/英亩，更优选约42,000株植物/英亩，最优选约45,000株植物/英亩。关于产量改善的替代指示包括源容量(生物量)、源输出(蔗糖和光合作用)、库组分(谷粒大小、谷穗大小、种子中的淀粉)、发育(光应答、高度、密度耐受性)、成熟度、早期开花性状和对高密度种植的生理学应答，例如45,000抹植物/英亩，例如如表10和11中说明的。87表10<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>表11时间选4奪评价描述V8-V12叶绿素V12漏VT谷穗、叶面积V15-15DAPChl焚光V15-15DAPCER15-25DAP碳水化合物蔗糖、淀粉收获前第一个节间的直径收获前底部第三个节间的直径收获前谷穗节间的直径成熟谷穗性状直径、长度、谷粒数目、谷粒重量电子传递速率(ETR)和C02交换速率(CER):使用Li6400LCF(Licor，Lincoln,NE)在约V9-R1阶段测量ETR和CER。叶叶绿素荧光是监控来源活性的快速方法并且报告与在各种条件下的C02同化作用高度关联(PhotosynResearch,37:89-102)。用光化性光1500(具有10%的蓝光)微摩尔m—2s_1,28°C,C02水平450ppm测量最年幼的完全伸展的叶或耳穗叶上方的2片叶。在每个事件中测量10抹植物。对于每林植物进行2次阅读。手提式叶绿素计SPAD-502(Minolta-日本)用于测量在活转基因植物和野生型配对物上的总叶绿素水平。分析来自每抹植物的3个三小叶，并且每个三小叶分析3次。随后将9个数据点平均以获得叶绿素水平。每种基因型分析的植物数目为5-8。<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>当选择产量改善时，有用的统计学测量方法包括3个组分，即模拟对于每个位置分开的测试田间的空间自相关，调整对于每个位置的空间依赖性的重组DNA事件的性状，和进行交叉位置分析。模拟空间自相关的第一个步骤是估计半变异函数(semivariogram)的协方差参数。假定球形协方差模型以模拟空间自相关。由于试验的大小和性质，空间自相关可能可以改变。因此，连同球形协方差结构一起也假定各向异性。下列方程式组描述了各向异性球形协方差模型的统计学形式。其中s产(x,,力)是一个位置的空间坐标并且s尸(x2，力)是第二个位置的空间坐标。共有5个相等协方差各向异性椭圆的协方差参数，6=(V,CT2，/)，Q>，C^),其中是V是块金效应，"2是偏基台值，/是由北顺时针方向旋转的度数，c^是对于短轴的定标参数并且a是对于长轴的定标参数。限定空间趋势的5个协方差参数随后将通过使用来自大量重复授粉者地块的数据经由限制的最大似然方法估计。在多位置田间试验中，对于每个位置分开模拟空间趋势。在获得模型的方差参数后，产生方差-协方差结构用于要分析的数据集。这个方差-协方差结构包含调整空间依赖性的产量数据所需的空间信息。在这种情况下，最佳代表本研究的处理和实验设计的嵌套模型连同方差-协方差结构一起使用以调整产量数据。在这个过程中，还可模拟并估计苗圃或种子批次作用，以关于由种子批次差异引起的任何产量相等调整产量。来自不同位置的空间调整的数据产生后，组合并分析所有调整的数据，其中假定位置作为复制。在这次分析中，组合位置内和位置间的方差以估计来自转基因植物和对照植物的产量标准误。相对平均数比较用于指示统计学显著的产量改善。其中/()是指示物函数，"V"少2，且i-[cos(/;r/180)(;^—x2)-sin(/;r/180)(乂一少2)]/",少-[sin(p;r/180)(a:,—jc2)+cos(/cw/180)Cy,-_y2)]/w表14<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>于每个枝条使用式[RWC。/。=(SWM-SDM)/(STM-SDM)*100]计算含水量(RWC)。这个年龄的充分浇水的玉米植物为约98%RWC。通过根据上述标准方法的选择方法选择本发明提供的转基因植物，并且这些转基因植物的性能显示于下表16中。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>在Satanta,IL和DixonCA使用中等干旱条件在田间测试用pMON67754转化的转基因植物，所述pMON67754包括如SEQIDNO:3中列出的重组DNA。与对照植物比较，在中等干旱应激下叶上的SPAD读数显示转基因植物中的叶绿素水平显著增加。2个事件显示叶绿素水平的SPAD读数显著增加，从而表明干旱耐受性的改善。在重复的田间试验中，6个测试的事件中的2个事件(ZM—M16396和ZM—M16401)显示2个不同位置中显著(p<0.1)改善的叶SPAD读数，从而表明干旱耐受性的改善。D.在冷应激下生长的选择(1)冷发芽测定-对于本测定使用3组种子。第一组由阳性转基因事件(Fl杂交)组成，其中本发明的基因在种子中表达。第二个种子组是非转基因的、野生型阴性对照，由与转基因事件相同的基因型制备而成。第三组由2个耐寒性和1个冷敏感性玉米商业对照系组成。所有种子都用杀真菌剂"克菌丹"(MAESTRO80DFFungicide,ArvestaCorporation,SanFrancisco,CA,USA)处理。通过将其充分混合并在实验前干燥杀真菌剂，对每45g玉米种子应用0.43mL克菌丹。玉米谷粒胚侧向下置于发芽盘(54x36cm)的个别单元(8.9x8.9cm)中的吸墨纸上。来自一个事件的10粒种子置于发芽盘的一个单元中。每个盘可以容纳21个转基因事件和3份重复的野生型(LH244SDms+LH59),这在完全区组设计中随机化。对于每个事件，有5次重复(5个盘)。将盘置于Convrion生长室(ConvironModelPGV36,ControlledEnvironments,Winnipeg,加拿大)内在9.7。C下24天(无光)。将250毫升去离子水加入每个发芽盘。发芽计数在实验开始日后的第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第17天、第19天、第21天和第24天进行。如果出现的胚根大小为lcm,那么种子视为发芽的。从发芽计数计算发芽指数。发芽指数根据下式计算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage98</formula>其中T为其中进行发芽测定的总天数。n定义种植后的天数。"i"表明已计数发芽的次数，包括当天。P是在任何给定等级中发芽种子的百分比。计算转基因事件和野生型对照之间的统计学差异。统计学分析后，显示相对于野生型对照统计学显著性为p水平小于0.的事件将进行第二次冷选择。第二次冷筛选以第一次选择相同的方式进行，只将重复数目增至10。进行来自第二次选择数据的统计学分析以鉴别显示相对于野生型对照统计学显著性为p水平小于0.05的事件。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>实本发明基因的表达。对于表达分析，随机收获来自每次选择的6个VI叶尖。浅苗床移至设定为5。C的生长室。所有其他条件例如湿度、曰/夜周期和光强度在生长室中保持不变。在移至冷温度后浅苗床每天进行地下灌溉。在第4天测量叶绿素荧光。在冷休克处理6天后将植物转移至正常生长条件并允许其在接下来的3天恢复。在这个恢复时间段期间，在第1天和第3天测量V3叶的长度。在恢复2天后，通过估计绿色V2叶的百分数视觉测定V2叶损害。在休克前和冷休克过程中V3叶生长、V2叶坏死和荧光的统计学差异可以用于估计冷休克对玉米植物的损害。(3)早期幼苗生长测定-对于本实验使用3组种子。第一组由阳性转基因事件(Fl杂交)组成，其中本发明的基因在种子中表达。第二个种子组是非转基因的、野生型阴性对照，由与转基因事件相同的基因型制备而成。第三个种子组由2个耐寒性和2个冷敏感性玉米商业对照系组成。所有种子用杀真菌剂"克菌丹"(3a，4，7,a-四氢-2-[(三氯曱基)硫代]-lH-异吲咮-l,3(2H)-二酮，DrexChemicalCo.Memphis,TN)处理。通过将其充分混合并在实验前干燥杀真菌剂，对每45g玉米种子应用克菌丹(0.43mL)。种子在发芽纸中生长以用于早期幼苗生长测定。对于测试中的每次入组使用3张12"xl8"发芽纸(AnchorPaper#SD7606)(每个转基因事件重复3次)。纸在0.5。/oKNO;3和0.1%Thyram的溶液中湿润。对于每张纸，在沿着纸长度均匀隔开的线上放置15粒种子。将15粒种子定位在纸上，从而使得胚根(radical)将向下生长，例如与纸的边缘更长的距离。湿纸从短末端之一开始巻起来。纸均匀且足够紧地巻起以使种子维持在一定位置。纸巻用2个大纸夹固定在一定位置，一个纸夹在顶端并且一个在底部。在适当容器中的随机化的完全区组设计中纸巻在生长室于23。C温育3天。室设定为65%的湿度，没有光周期。对于冷应激处理，纸巻随后在生长室中于12。C温育12天。室设定为65%的湿度，没有光周期。冷处理后，将发芽纸打开并丟弃不发芽的种子。通过自动化成像程序测量每个种子的胚根和胚芽鞘的长度，所述程序自动收集并处理图像。成像程序自动测量每一个单独幼苗的枝条长度、根长度和整个幼苗长度并随后计算每个纸巻的平均数。统计学分析后，显示相对于野生型对照统计学显著性为p水平小于0.1的事件将进行第二次冷选择。第二次冷筛选以与第一次选择相同的方式进行，只将重复数目增至5。进行来自第二次选择数据的统计学分析以鉴别显示相对于野生型对照统计学显著性为p水平小于0.05的事件。<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>4.冷田间效力试验种和模拟I无耕种环境中在早春田^间种植条下所述构建体给予发芽时增强的冷活力和早期幼苗生长。在当地农民开始种植玉米前大约2周将种子种植到地里，从而使得对农作物施加显著的冷应激，命名为冷处理。种子还在当地最佳种植条件下种植，从而使得农作物只有很少或没有暴露于冷条件，命名为正常处理。冷田间效力试验在5个i也点进4亍，包4舌GlyndonMN、MasonMI、MonmouthIL、DaytonIA、MysticCT。在每个地点，种子在冷和正常条件下种植，每个处理重复3次，每行20个谷粒，并且每地块单行。种子种植到土壤中1.5-2英寸深，以避免多泥条件。在每个地点安置2个温度监视器以每天监控空气和土壤温度。种子突出(emergence)定义为生长中的枝条刺破土壤表面时的时刻。从最早的地块开始突出那天开始每天计数每地块中突出的幼苗数目直至突出发生没有显著变化。此外，对于每个种植日期，还记录所有地块中突出为0时的最迟日期。还在玉米植物平均高度达到10英寸前的V3-V4阶段评价幼苗活力，其中1=极佳的早期生长，5=平均生长和9=生长差。使用SAS软件对于每个地点中或跨越所有地点的数据计算50%突出的天数、最大百分比突出和幼苗活力。下列表列出了基于上文说明的方法收集并分析的数据。跨越所有地点分析的数据只包括来自GlyndonMN、MasonMI和MysticCT的那些。<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>E.具有增加的蛋白质和/或油水平的转基因植物种子的筛选这个实施例阐述了使用Infratec1200系列谷粒分析仪鉴别在种子组成中具有改善的植物种子的高通量选择，所述谷粒分析仪是近红外透射率分光计，用于测定大批种子样品的组成。近红外分析是无破坏性、高通量的方法，它可以分析单一样品扫描中的多重性状。目的分析物的NIR校准用于预测未知样品的值。使用复合化学计量软件包获得样品的NIR光谱并与校准值比较，所述软件包提供预测值以及关于样品在校准中拟合得如何好的信息。FossNorthAmerica具有转运模块的InfratecModel1221、1225或1227与比色杯，条目#1000-4033，FossNorthAmerica—起使用，或对于小样品与小单元比色杯，由LeonGirardCo.修改的Foss标准比色杯，一起使用。维持在对照单元比色杯中各种组成的玉米和大豆对照样品由LeonGirardCo.供应。NIT收集库欠件由MaximumConsultingInc.Software提供。通过软件自动进行计算。种子样品在具有来自消费者的条形码标签的包装或容器中收到。在收到时将种子倾倒入比色杯中并进行分析。表20<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>表21.<table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table>在100%干物质基础上报告的谷粒蛋白质A关于2003和2004的对照是轮回亲本__b关于2005年实验的对照是pMON69462的授丰分者以及pMON83769和pMON80868的轮回亲本<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table>植物用于增强的性状的筛选。种子发芽和幼苗发育选择5个事件连同其他转基因材料一起分析在黑暗条件下对种子发芽和幼苗发育的表型作用。每个野生型和转基因玉蜀黍事件的12天。测量每个幼;的中胚轴、胚芽鞘和根的长度。与非'转基因对照比较，鉴别显示中胚轴和展开的胚芽鞘极大延长生长的转基因玉蜀黍幼苗，所述生长由表达PHYA蛋白质的重组DNA赋予。密度研究转基因植物以3个密度在田间生长高密度为42,000抹植物/英亩；中等密度为35,000株植物/英亩；和低密度为28,000株植物/英亩。选择来自表达PHYA的3个植物细胞事件的植物用于研究针对不同密度的生理学和产量应答。来自密度试验YI130的生理学数据概括于下文显示的表23中。在高种植密度下事件ZM—S83483显示植物高度、谷穗高度和节间长度显著减少并且叶绿素含量具有显著增加。表23<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>谷粒性状分析如表24中所示，事件ZM—S83444、ZM—S83446、ZM—S83473、ZM—S83480、ZM—S83483和ZM—S83907显示单谷粒重量显著增加。事件ZM—S83452显示单谷粒重量和总谷粒重量显著增加。筛选数据显示具有稳定整合、非天然、表达光敏色素A蛋白的重组DNA的植物细胞可以再生为与对照植物比较显示增加的产量的植物。<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>实施例7这个实施例说明了转基因植物细胞的制备，其包含表达大豆MADS框转录因子蛋白质的重组DNA(SEQIDNO:77)，并鉴别为G1760。编码大豆MADS框转录因子的DNA从大豆文库中克隆，并插入重组DNA构建体中，所述构建体包括与编码转录因子的DNA可操作地连接的CaMV35S启动子，随后为终止子。重组DNA构建体插入转化载体质粒中，以产生如SEQIDNO:10029中所列出的质粒pMON74470，它用于土壤杆菌属介导的大豆植物细胞转化。使用MON74470用表达MADS框转录因子的重组DNA转化大豆植物细胞并用于再生转基因植物群体。将转基因大豆植物再生并选择用于筛选增强的性状。转基因大豆植物显示具有高度扩大的萼片和缠绕茎的花。主茎显示减少的侧出分枝和增加的总状花序形成。与对照植物比较，在短白昼(10小时)和长白昼(14小时)条件下，开花时间减少约2-4天。当置于非诱导的20小时光时，转基因植物还开花5周；野生型对照植物在此类条件下不开花。在转基因植物中花和荚果的脱离极大地减少，从而导致每抹植物的荚果数目增加。野生型对照植物产生100个荚果左右，特定的转基因植物产生至少125个荚果/植物，并且由一个转基因事件的植物细胞再生的植物产生大于200个荚果/植物。成熟期也有所延迟，从来自单一拷贝事件A29204的植物显示的l周到来自多拷贝事件A28877的植物显示的l个月。来自事件A29204的转基因植物上超过95%的荚果在一个时间段内成熟；但来自事件A28877的转基因植物上只有50%的荚果在相同时间段内成熟。来自转基因植物的种子小于来自对照植物的种子，并且在数目上大于来自对照植物的种子，例如约多1800粒种子/磅。转基因植物还显示具有增强的水利用效率。在测试大豆的干旱耐受性时，将4.5"罐用Metromix200制备并将罐调整至相同重量。罐用水饱和。R2或R3纯合种子置于罐的土壤中，每个事件15个罐，每个构建体3-6个事件。植物在600|iEM-2S"的光强度；温度28°C;相对湿度(RH):60%下生长。使用基因检查条(TraitRURLateralFlow50观'H式,来自StrategicDiagnostics,Inc.)对选择的植物进行关于CP4基因存在的基因检查。丟弃不需要的阴性植物。当植物达到VI阶段时，通过彻底灌溉用水饱和罐。拍摄在水饱和罐中的植物的照片。排出过量的水并停止进一步的浇水直至对于良好浇水的对照和干旱处理的植物分别为50%的罐含水量和10%的持水量(通过每3-5天测量土壤湿度或罐重量监控含水量)。在大约10%的饱和水重量时，植物开始显示萎蔫表型的起始。每l-2天继续限制浇水以将罐含水量维持在50或10%。接下来的14天测定干旱伤害表型(参见测量结果表)。在干旱处理开始后14天的每一天进行植物的拍照和生理学测定。这些包括，但不限于，植物高度、叶相对含水量、叶水势、叶绿素含量和叶绿素荧光。在14天后罐用营养物溶液饱和并重新开始规律浇水时间表。表25测量结果方案农艺学测量结果突出，早季节活力，高度(cm)视觉干旱得分分数为1-4:1.健康植物，与对照植物没有差异；2.看见萎罵，叶变得萎蔫；3.植物萎蔦，仍为绿色并可恢复；4.严重萎蔫，萎黄病并且不可恢复如表25中描述对转基因大豆植物进行的干旱测定法测量结果显示，来自事件GM29204的转基因植物细胞的转基因大豆植物呈现增强的水利用效率。与150粒种子/植物的平均数比较，从来自41个转基因植物细胞事件中的一个转基因植物细胞事件(28877)再生的RO植物产生大数目的荚果/节和种子/植物-531Rl种子/植物，即产量增加。实施例6.共有序列这个实施例说明了对于DNA编码的蛋白质和同源物的共有氨基酸序列的鉴别，所述DNA用于制备本发明的具有增强的农艺性状的转基因种子和植物。选择ClustalW程序用于SEQIDNO:136的氨基酸序列及其9个同源物，以及SEQIDNO:151及其11个同源物的多重序列比对。显著影响序列比对的3个主要因素是(1)蛋白质权重矩阵；(2)缺口开放罚分；(3)缺口延伸罚分。对于ClustalW程序可用的蛋白质权重矩阵包括Blosum、Pam和Gonnet系列。广泛地测试具有缺口开放罚分和缺口延伸罚分的那些参数。在测试结果的基础上，对于多重序列比对选择Blosum权重矩阵、缺口开放罚分IO和缺口延伸罚分1。图2显示SEQIDNO:136、其同源物和结尾的共有序列(SEQIDNO:10031)的序列。图3显示SEQIDNO:151、其同源物和结尾的共有序列(SEQIDNO:10032)的序列。关于共有序列的符号是(1)大写字母为多重序列比对输出的所有位置中100%的同一性；(2)小写字母为>=70%的同一性；符号；(3)"X"指示<70%的同一性；(4)破折号"-，，指缺口在>=70%的序列中。共有氨基酸序列可以用于鉴别对应本发明完全范围的DNA，所述DNA在提供转基因植物例如具有增强的农艺性状的玉米和大豆植物中有用，所述增强的农艺性状例如改善的氮利用效率、增加的产量、改善的水利用效率和/或在冷应激下改善的生长，这是由于编码的氨基酸序列等同于共有氨基酸序列的蛋白质的DNA在植物中的表达。实施例7.通过Pfam分析鉴别氨基酸结构域使用附加的计算机列表中的HMMER软件，针对多重序列比对的目前Pfam集合和隐马尔可夫模型分析Pfam蛋白质家族中显示与增强的性状结合的表达蛋白质的氨基酸序列。表26中显示了SEQIDNO:84-166的蛋白质的Pfam蛋白质家族。附加的计算机列表中还有关于鉴别的专利家族的隐马尔可夫模型数据库，其允许鉴别其他同源蛋白质及其同源编码DNA，以使得本领域普通技术人员能够充分外延本发明。通过单个Pfam结构域鉴别特定蛋白质，并且通过多个Pfam结构域鉴别其他的蛋白质。例如，具有SEQIDNO:91的氨基酸的蛋白质的特征为2个Pfam结构域，即SRF-TF和K-框；并且具有SEQIDNO:165的氨基酸的蛋白质的特征为6个Pfam结构域，即GAF、光敏色素、PAS、重复的PAS、HisKA和HATPase。<table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table>表27<table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table>123<table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>实施例8.具有增强的农艺性状的转基因植物的选择这个实施例说明了通过选择来源于本发明转基因植物细胞的转基因种子和植物的制备和鉴别，其中通过筛选由蛋白质表达赋予的增强的农艺性状来鉴别植物和种子，所述蛋白质选自实施例4中鉴别的同源蛋白质，SEQIDNO:121、128、152-160、162和164。用重组DNA转化玉米、大豆、棉花、低芥酸菜子、小麦和稻的转基因植物细胞，以表达实施例4中鉴别的每种同源物。由转化的植物细胞再生植物并将其用于生产后代植物和种子，筛选所述后代植物和种子的增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。通过同源蛋白质的表达鉴别显示赋予的增强的性状的植物。权利要求1.一种具有稳定整合的重组DNA的植物细胞，其包括在植物细胞中起作用并且与来自植物、细菌或酵母的DNA可操作地连接的启动子，所述DNA编码在序列中具有至少一个氨基酸结构域的蛋白质，所述氨基酸结构域对于与Pfam名称组中由Pfam名称鉴别的蛋白质结构域家族的氨基酸序列比对超过Pfam聚集截止值，所述蛋白质结构域家族由AAA、AP2、Aldoketred、α淀粉酶、Aminotran12、Ank、ArfGap、Asn合酶、BRO1、CBFDNFYBHMF、过氧化氢酶、CorA、Cpn60TCP1、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、DNA光解酶、DSPc、DUF1685、DUF296、Di19、E2FTDP、FAD结合7、FA去饱和酶、FBPase、GAF、GATA、GATase2、Glycohydro1、乙二醛酶、Got1、HATPasec、HSFDNA-结合、HSP20、HisKA、同源异型框、Hpt、异淀粉酶N、K-框、内酰胺酶B、Metallophos、MtN3slv、NAF、NAM、NIF、OxidoredFMN、PAS、PDZ、PRA1、肽酶C15、肽酶S10、肽酶S41、光敏色素、Peinase、PkinaseTyr、吡哆醛deC、RIO1、RRM1、RTC、RTC插入片段、Ras、应答reg、SPC25、SPX、SRF-TF、小突触小泡蛋白、UPF0057、zf-C2H2、和zf-C3HC4组成；其中关于所述蛋白质结构域家族的Pfam聚集截止值在表28中说明；其中通过筛选由所述群体中的植物细胞再生并表达所述蛋白质的植物与不具有所述重组DNA的对照植物相比增强的性状，从具有所述重组DNA的植物细胞群体选择所述植物细胞；并且其中所述增强的性状选自增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。2.权利要求1的植物细胞，其中所述蛋白质具有的氨基酸序列与共有氨基酸序列群中的共有氨基酸序列具有至少90%的同一性，所述共有氨基酸序列群由关于SEQIDNO:84构建的共有氨基酸序列和表2中列举的其同源物，以及关于SEQIDNO:166构建的共有氨基酸序列和表2中列举的其同源物组成。3.权利要求1的植物细胞，其中所述蛋白质选自表1中鉴别的蛋白质群。4.权利要求1的植物细胞，其进一步包括表达蛋白质的DNA,所述蛋白质提供来自暴露于除草剂的耐受性，所述除草剂以对野生型所述植物细胞致死的水平应用。5.权利要求4的植物细胞，其中所述此类除草剂的试剂是草甘膦、麦草畏或草铵膦化合物。6.—种转基因植物，其包括许多权利要求1的植物细胞。7.权利要求6的转基因植物，其对于所述重组DNA是纯合的。8.—种转基因种子，其包括许多权利要求1的植物细胞。9.权利要求8的转基因种子，其来自玉米、大豆、棉花、低芥酸菜子、苜蓿、小麦或稻植物。10.权利要求9的非天然、转基因玉米种子，其中所述种子可以产生对来自MaldeRioCuarto病毒或高粱柄锈菌真菌或两者的疾病有^氐抗力的玉米一直物。11.一种转基因花粉粒，其包括权利要求1的植物细胞的单倍体布亍生物。12.—种用于制备非天然、转基因种子的方法，所述种子可以用于生产一批具有增强的性状的转基因植物，所述增强的性状由稳定整合的重组DNA表达产生，所述重组DNA包括(a)在植物细胞中起作用并且(b)与来自植物、细菌或酵母的DNA可操作地连接的启动子，所述DNA编码在序列中具有至少一个氨基酸结构域的蛋白质，所述氨基酸结构域对于与Pfam名称组中由Pfam名称鉴别的蛋白质结构域家族的氨基酸序列比对超过Pfam聚集截止值，所述蛋白质结构域家族由AAA、AP2、Aldoketred、a淀4分酶、Aminotmn12、Ank、ArfGap、Asn合酶、BROl、CBFDNFYBHMF、过氧化氢酶、CorA、Cpn60TCP1、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、DNA光解酶、DSPc、DUF1685、DUF296、Dil9、E2FTDP、FAD结合7、FA去々包和酶、FBPase、GAF、GATA、GATase2、Glycohydrol、乙二醛酶、Gotl、HATPasec、HSFDNA-结合、HSP20、HisKA、同源异型框、Hpt、异淀粉酶N、K-框、内酰胺酶B、Metallophos、MtN3slv、NAF、NAM、NIF、OxidoredFMN、PAS、PDZ、PRA1、肽酶C15、肽酶SIO、肽酶S41、光l文色素、Peinase、PkinaseTyr、吡,醛deC、RIOl、RRM1、RTC、RTC插入片段、Ras、应答reg、SPC25、SPX、SRF画TF、小突触小泡蛋白、UPF0057、zf-C2H2、和zf-C3HC4组成；其中关于所述蛋白质结构域家族的Pfam聚集截止值在表28中说明；并且其中所述增强的性状选自增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油，用于制备所述种子的所述方法包括(a)在植物群体中筛选所述增强的性状和所述重组DNA,其中在所述群体中的个体植物可以显示的所述性状水平低于、基本上等于或高于所述性状在不表达所述重组DNA的对照植物中显示的水平，(b)从所述群体中选择一种或多种植物，它们显示的性状水平大于所述性状在对照植物中显示的水平，(c)证实所述重组DNA稳定整合在所述选择的植物中，(d)分析所选植物的组织以确定生产的蛋白质具有由SEQIDNO:1-83之一序列中的核普酸编码的蛋白质的功能；和(e)收集来自所选植物的种子。13.权利要求12的方法，其中所述群体的植物进一步包括表达蛋白质的DNA,所述蛋白质提供针对暴露于除草剂的耐受性，所述除草剂以对野生型植物细胞致死的水平应用，并且其中所述选择通过用所述除草剂处理所述群体来实现。14.权利要求13的方法，其中所述除草剂包括草甘膦、麦草畏或草铵膦化合物。15.权利要求12的方法，其中所述选择通过鉴别具有所述增强的性状的植物来实现。16.权利要求12的方法，其中所述种子是玉米、大豆、棉花、苜蓿、小麦或稻种子。17.—种生产杂交玉米种子的方法，其包括(a)从除草剂耐受性玉米植物获得杂交玉米种子，所述玉米植物还具有稳定整合的重组DNA，所述重组DNA包括(a)在植物细胞中起作用并且(b)与DNA可操作地连接的启动子，所述DNA编码在序列中具有至少一个氨基酸结构域的蛋白质，所述氨基酸结构域对于与Pfam名称组中由Pfam名称鉴别的蛋白质结构域家族的氨基酸序列比对超过Pfam聚集截止值，所述蛋白质结构域家族由AAA、AP2、Aldoketred、a淀粉酶、Aminot體12、Ank、ArfGap、Asn合酶、BROl、CBFDNFYBHMF、过氧化氢酶、CorA、Cpn60TCPl、半胱氨酸蛋白酵4中制剂、DNA光解酵、DSPc、DUF1685、DUF296、Dil9、E2FTDP、FAD结合7、FA去饱和酶、FBPase、GAF、GATA、GATase2、Glycohydrol、乙二醛酶、Gotl、HATPasec、HSFDNA-结合、HSP20、HisKA、同源异型框、Hpt、异淀粉酶N、K-框、内酰胺酵B、Metallophos、MtN3slv、NAF、NAM、NIF、OxidoredFMN、PAS、PDZ、PRA1、肽酶C15、肽酶SIO、肽酶S41、光敏色素、Peinase、PkinaseTyr、吡,醛deC、RIOl、RRM1、RTC、RTC插入片l殳、Ras、应答reg、SPC25、SPX、SRF-TF、小突触小泡蛋白、UPF0057、zf-C2H2、和zf-C3HC4组成；其中关于所述蛋白质结构域家族的Pfam聚集截止值在表28中说明；(b)由所述杂交玉米种子生产玉米植物，其中由所述杂交玉米种子产生的所述植物的一部分对于所述重组DNA是纯合的，由所述杂交玉米种子产生的所述植物的一部分对于所述重组DNA是半合子的，并且由所述杂交玉米种子产生的所述植物的一部分没有一种所述重组DNA;(c)通过用除草剂处理选择对于所述重组DNA是纯合和半合子的玉米植物；(d)收集来自除草剂处理存活的玉米植物的种子并种植所述种子以产生进一步的后代玉米植物；(e)将步骤(c)和(d)重复至少一次以产生近交玉米系；(f)使所述近交玉米系与第二种玉米系杂交以生产杂交种子。18.选择包括权利要求1的细胞的植物的方法，其中使用免疫反应性抗体检测所述蛋白质在种子或植物组织中的存在。19.防伪的研磨种子，其具有作为来源指示的权利要求1的植物细胞。20.—种无需灌溉水培育玉米、棉花或大豆农作物的方法，其包括种植具有权利要求1的植物细胞的种子，所述种子根据增强的水利用效率进行选择。21.权利要求20的方法，其包括在所述农作物生产过程中提供最高达300毫米的地下水。22.—种无需添加氮肥料培育玉米、棉花或大豆农作物的方法，其包括种植具有权利要求1的植物细胞的种子，所述种子根据增强的氮利用效率进行选择。全文摘要本发明提供了具有重组DNA用于表达蛋白质的转基因植物细胞，所述蛋白质对于赋予转基因农作物植物增强的农艺性状有用。本发明还提供包括转基因植物细胞的转基因植物和后代种子，其中植物根据具有增强的性状进行选择，所述性状选自增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。还公开了用于制备具有增强的性状的转基因种子和植物的方法。文档编号A01H1/00GK101442902SQ200580048534公开日2009年5月27日申请日期2005年12月19日优先权日2004年12月21日发明者M·阿巴德申请人:孟山都技术有限公司