专利名称：生物降解除草剂氯嘧磺隆菌剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物降解剂的制备方法，具体地说是一种可以降解除草剂氯嘧磺隆的生物降解剂的制备方法。
背景技术：
氯嘧磺隆是80年代中末期由美国杜邦公司开发的磺酰脲类除草剂，自90年代大面积使用以来，由于其杀草谱广、超高效、高选择性、可混性强、价格低等特点，一直是大豆田化学除草的主要品种。近年来应用面积逐年扩大，在土壤中主要通过水解和微生物降解作用而消失，但由于其不易挥发，不易光解，残留期比较长，易对后茬敏感作物造成伤害，限制了其应用。同时，严重影响了作物轮作换茬及作物结构调整，因此，如何消除氯嘧磺隆的残留毒性一直受到各国科学工作者的关注。寻找有效的农药降解方式，解决农药残留问题是科学家需要面对、亟待解决的重要课题。
目前，国内外学者对解决除草剂残留药害问题采取了许多措施，但效果都不明显。美国等西方国家主要是通过降低此类除草剂使用剂量及限制使用此类除草剂来解决此类问题，但残留药害的问题仍然存在。许多学者在实验室内研究化学解毒剂来解决农药的残留问题，但只保护了作物，而对土壤中残留的农药没有起到降解的作用，从根本上解决不了农药的残留问题。大量研究证明，自然环境中存在的多种微生物在农药降解方面起着重要的作用，科研工作者通过富集培养、分离筛选等技术已从土壤、污泥、污水、天然水体、垃圾场和厩肥中分离到降解有机磷类农药、拟除虫菊酯类农药的微生物、除草剂中的阿特拉津在国内外使用最广泛，其降解菌的研究报道相对较多，但能够有效降解氯嘧磺隆的微生物尚未见报道。农药的微生物降解目前虽已得到了很大的发展，各种降解农药的微生物的微生物菌株(包括细菌、真菌等)也相继被分离和鉴定，但是应用微生物进行生物修复的实际应用却往往由于其较低的降解率而受到影响。生物降解是解决农药残留的发展方向，虽然该方法绿色环保，但由于其较低的降解率而影响了该项技术的发展。
发明内容本发明的目的在于提供一种对除草剂氯嘧磺隆有良好的降解效果的生物降解除草剂氯嘧磺隆菌剂的制备方法。
本发明的目的是这样实现的本发明中所用的百分比均为重量百分比。
取田间多年施用氯嘧磺隆的土壤为处理对象，用无菌生理盐水溶解后制得土壤悬浊液；在蛋白胨培养基中添加氯嘧磺隆的浓度为100mg/L，该培养基在121℃、20分钟灭菌冷却后，接种土壤悬浊液，接种量10％，在30℃下摇瓶培养5天，将培养液按10％接种量接种于氯嘧磺隆的浓度为200mg/L的蛋白胨培养基中，然后在30℃下摇瓶培养5天，依次类推10次接种，按氯嘧磺隆100mg/L的浓度梯度增长，使最终蛋白胨培养基中的氯嘧磺隆的浓度在接种前达1000mg/L，得到富集降解菌株培养物种子；富集降解菌株培养物种子经过斜面培养、一级扩大培养、二级扩大培养后加入降解菌株培养基在28℃温度下发酵36-40小时经包装制成产品。
本发明还可以包括这样一些特征1、所述的降解菌株培养基是由5波美度麦芽汁、0.1％KH2PO4、0.05％MgSO4·7H2O和余量水组成的。
2、所述的降解菌株培养基是由1％KH2PO4、0.5％MgSO4·7H2O、2％葡萄糖、10％水和余量的麸皮组成的。
3、所述的包装制成产品是将发酵液无菌罐装。
4、所述的包装制成产品是将发酵物在50℃温度下进行通风干燥，粉碎后进行包装。
将10次富集后得到富集降解菌株培养物种子进行平板分离，经30℃培养24小时后，观察平板菌落生长情况，镜检结果发现所有生长旺盛的菌种微观形态一致，系真菌；经生理生化实验，结果相同。由此证明，通过氯嘧磺隆浓度梯度逐渐增长的富集培养过程，土壤中仅有一种微生物适应高浓度氯嘧磺隆而生存下来，故确定该微生物为本发明的出发菌株。
以玉米为指示作物进行生物测定，结果发现氯嘧磺隆的降解半衰期由自然条件的45天降低到15天。
选取黄瓜、南瓜、水稻为指示作物进一步验证该菌株的降解功效。
将本发明的产品喷洒在含氯嘧磺隆的土壤中(氯嘧磺隆浓度10μg/kg)，经28℃、30天时间的降解后，处理氯嘧磺隆的降解率为75％，而对照的降解率为45％，60天后处理降解率为95％，此残留浓度下对大多数作物的生长无不良影响，而对照降解率为60％，加菌处理在4个月内完全清除土壤中残留的氯嘧磺隆。充分证明了使用此项生物技术可以有效解决氯嘧磺隆对后茬敏感作物的伤害问题。
大豆是我国主要经济作物之一，而氯嘧磺隆的使用面积之大，其残留药害严重影响后茬作物的轮种，这是几十年来一直困绕我国乃至世界农业的最棘手的问题之一。本项发明采用生物技术，菌种取之于土壤而用之于土壤，适应环境能力极强，在条件适宜情况下，即可大量繁殖而作用于氯嘧磺隆，从而消除氯嘧磺隆对后茬作物的影响，为解决大豆田氯嘧磺隆的残留药害问题提供了一条切实可行的途径，并且保护了了氯嘧磺隆这个老除草剂品种的使用。采用绿色降解技术在保护环境的同时减少农作物损失，可能会有肥料的作用，降低同等功效其它方法的生产成本，减轻农民负担，增加农民收入，具有显著的社会效益。而且，降低土壤中残留农药对绿色食品生产有极其重要的意义。
本发明具有极其重要的学术价值(1)将微生物技术应用于长残留除草剂的降解，在农业领域中尚属首创。(2)通过驯化微生物使其服务于农业生产，在基础理论研究范畴中占有重要位置。(3)通过对微生物降解农药机理的研究指明微生物在农业生产中的地位和作用，对研究现代化农业具有深远的指导意义。
附图是本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面举例对本发明作更详细的描述1、取田间多年施用氯嘧磺隆的土壤为处理对象，用无菌生理盐水溶解后制得土壤悬浊液；在蛋白胨培养基中添加氯嘧磺隆的浓度为100mg/L，该培养基在121℃、20分钟灭菌冷却后，接种土壤悬浊液，接种量10％，在30℃下摇瓶培养5天，将培养液按10％接种量接种于氯嘧磺隆的浓度为200mg/L的蛋白胨培养基中，然后在30℃下摇瓶培养5天，依次类推10次接种，按氯嘧磺隆100mg/L的浓度梯度增长，使最终蛋白胨培养基中的氯嘧磺隆的浓度在接种前达1000mg/L，得到富集降解菌株培养物种子；富集降解菌株培养物种子经过斜面培养(8波美度麦芽汁和2％的琼脂斜面28℃培养36小时)、一级扩大培养和二级扩大培养后(扩大培养基均采用5波美度麦芽汁、0.1％KH2PO4、0.05％MgSO4·7H2O，28℃通风培养24小时)，按照10％的接种量加入由5波美度麦芽汁、0.1％KH2PO4、0.05％MgSO4·7H2O和余量组成的降解菌株培养基中，在28℃温度下通风发酵36小时，发酵液无菌罐装，包装制成产品。
2、取田间多年施用氯嘧磺隆的土壤为处理对象，用无菌生理盐水溶解后制得土壤悬浊液；在蛋白胨培养基中添加氯嘧磺隆的浓度为100mg/L，该培养基在121℃、20分钟灭菌冷却后，接种土壤悬浊液，接种量10％，在30℃下摇瓶培养5天，将培养液按10％接种量接种于氯嘧磺隆的浓度为200mg/L的蛋白胨培养基中，然后在30℃下摇瓶培养5天，依次类推10次接种，按氯嘧磺隆100mg/L的浓度梯度增长，使最终蛋白胨培养基中的氯嘧磺隆的浓度在接种前达1000mg/L，得到富集降解菌株培养物种子；富集降解菌株培养物种子经过斜面培养(8波美度麦芽汁和2％的琼脂斜面28℃培养36小时)、一级扩大培养和二级扩大培养后(扩大培养基均采用5波美度麦芽汁、0.1％KH2PO4、0.05％MgSO4·7H2O，28℃通风培养24小时)，按照10％的接种量加入由1％KH2PO4、0.5％MgSO4·7H2O、2％葡萄糖、10％水和余量的麸皮组成的降解菌株培养基中，在28℃温度下通风发酵36小时，将发酵物在50℃温度下进行通风干燥，粉碎后进行包装，包装制成产品。
权利要求
1.一种生物降解除草剂氯嘧磺隆菌剂的制备方法，其特征是取田间多年施用氯嘧磺隆的土壤为处理对象，用无菌生理盐水溶解后制得土壤悬浊液；在蛋白胨培养基中添加氯嘧磺隆的浓度为100mg/L，该培养基在121℃、20分钟灭菌冷却后，接种土壤悬浊液，接种量10％，在30℃下摇瓶培养5天，将培养液按10％接种量接种于氯嘧磺隆的浓度为200mg/L的蛋白胨培养基中，然后在30℃下摇瓶培养5天，依次类推10次接种，按氯嘧磺隆100mg/L的浓度梯度增长，使最终蛋白胨培养基中的氯嘧磺隆的浓度在接种前达1000mg/L，得到富集降解菌株培养物种子；富集降解菌株培养物种子经过斜面培养、一级扩大培养、二级扩大培养后加入降解菌株培养基在28℃温度下发酵36-40小时经包装制成产品。
2.根据权利要求1所述的生物降解除草剂氯嘧磺隆菌剂的制备方法，其特征是所述的降解菌株培养基是由5波美度麦芽汁、0.1％KH2PO4、0.05％ MgSO4·7H2O和余量水组成的。
3.根据权利要求1所述的生物降解除草剂氯嘧磺隆菌剂的制备方法，其特征是所述的降解菌株培养基是由1％KH2PO4、0.5％ MgSO4·7H2O、2％葡萄糖、10％水和余量的麸皮组成的。
4.根据权利要求2所述的生物降解除草剂氯嘧磺隆菌剂的制备方法，其特征是所述的包装制成产品是将发酵液无菌罐装。
5.根据权利要求3所述的生物降解除草剂氯嘧磺隆菌剂的制备方法，其特征是所述的包装制成产品是将发酵物在50℃温度下进行通风干燥，粉碎后进行包装。
全文摘要
本发明提供的是一种生物降解除草剂氯嘧磺隆菌剂的制备方法。取田间多年施用氯嘧磺隆的土壤为处理对象，用无菌生理盐水溶解后制得土壤悬浊液；在蛋白胨培养基中添加氯嘧磺隆的浓度为100mg/L，该培养基在121℃、20分钟灭菌冷却后，接种土壤悬浊液，接种量10％，在30℃下摇瓶培养5天，将培养液按10％接种量接种于氯嘧磺隆的浓度为200mg/L的蛋白胨培养基中，然后在30℃下摇瓶培养5天，依次类推10次接种，按氯嘧磺隆100mg/L的浓度梯度增长，使最终蛋白胨培养基的氯嘧磺隆的浓度在接种前达1000mg/L，得到富集降解菌株培养物种子；富集降解菌株培养物种子经过斜面培养、一级扩大培养、二级扩大培养后加入降解菌株培养基在28℃温度下发酵36－40小时经包装制成产品。
文档编号A01P13/00GK1860882SQ20061000980
公开日2006年11月15日 申请日期2006年3月13日 优先权日2006年3月13日
发明者陶波, 滕春红, 栾凤侠 申请人:东北农业大学