专利名称：一种拟壳二孢素及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种拟壳二孢素及其应用，属生物农药技术领域。
背景技术：
迄今已发现的来源于微生物的抗生素已近万余种之多，其中许多已广泛用于治疗各种微生物感染性疾病。近年来由于线虫、真菌等造成植物侵染性病害的各种病原物的抗性、原有的农用抗菌素、杀线剂抗生素治疗效果在减退，需要不断开发新的抗生素，而发明新的抗生素活性成份是问题的关键。
经文献检索，未发现与本发明相同的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提拱一种其化学结构新颖的拟壳二孢素，拟壳二孢素作为制备农用抗生素的应用。
本发明是这样实现的1、拟壳二孢素的制备(1)拟壳二孢素生产菌的分离筛选本发明的生产菌株为Pseudohalonectria adversaria ZD1，该菌株于2003年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0931。P.adversaria ZD1属于水生真菌，系本发明人从云南的淡水湖泊的腐木中分离得到的。
(2)拟壳二孢素的制备用Pseudohalonectria adversaria ZD1菌株，通过抗生素常规的液体或固体的发酵方法，制得本发明所述的拟壳二孢素。
本发明所述的拟壳二孢素对培养基中的营养源为常用于微生物培养的碳源、氮源及其它营养源。其中碳源可为淀粉，糊精，甘油，葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，麸皮等。氮源可为黄豆粉，黄豆饼粉，花生饼粉，棉籽饼粉，玉米浆，酵母粉，胨，铵盐，硝酸盐，以及其它有机或无机含氮化合物。对其它营养源，可适量添加一些复合维生素B和C、及无机盐类，例如，食盐，磷酸盐以及钾、钙、铁、镁、锰、锌之类的金属盐。还可添加些动、植、矿物油等作为消泡剂。
本发明所述的拟壳二孢素对培养条件(培养基、通气量等)同现有技术，其中培养温度为20-30℃，以24℃下菌丝体生长较快；培养基的pH范围为4-9，以接近中性为好。
拟壳二孢素由上述所得的培养物，通过常规提取代谢物的方法提取。例如可利用拟壳二孢素与杂质在溶解度、离子结合力、吸咐亲和力及分子量等方面的差别进行提取。具体地讲，拟壳二孢素存在于发酵液中时，可用大孔吸咐树脂进行吸咐，然后用含水甲醇进行解吸。这样可得到粗提物，粗提物再通过硅胶和Sephedex-LH20凝胶柱层析，即可得到拟壳二孢素的淡黄色结晶。而菌丝体中存在拟壳二孢素时，则用任选的有机溶剂(例如甲醇、乙醇、丙醇，氯仿，四氢呋喃，乙腈)冷浸提取4次，将浓缩的粗提物吸收在固体吸收材料(例如粉碎的天然材料，如高岭土、粘土、滑石，石英等；或粉碎的合成材料，如微粒状硅胶，氧化铝等)上，在硅胶柱中进行色谱分离，干法上样，以氯仿/甲醇为洗脱剂进行梯度解吸。这样得到的粗提物再进行类似于从发酵液中提取拟壳二孢素的操作，依次通过硅胶和Sephedex-LH20凝胶柱层析，即可得到拟壳二孢素的淡黄色结晶。
2、拟壳二孢素的理化及生物性质a.分子式为C14H18O3，分子量为234(ESI-TOF法测定)，结构式如下图所示
b.物化特征为外观淡黄色粉未状物质；溶解性溶于氯仿、丙酮、甲醇、二甲亚砜等，不溶于己烷和水等；高分辨正离子ESI-TOF质谱实测值为235.1335，计算值为235.1334；紫外吸收UV(pyridine)λmax(ε)为350.0(11947)，202.5(20879)nm；红外吸收IR(film)νmax为3441，2960，2925，2855，1725，1629，1544，1461，1382，1273，1160，1117，1073，1034，561cm-1；核磁谱特征见表1，其溶解溶剂为CDCl3，500MHz，TMS为内标，δppm.
表1拟壳二孢素的核磁谱特征(CDCl3，500MHz)
c.生物活性目前经实验已证明在离体叶片浸渍法植物毒害性活性的测定试验中，当拟壳二孢素溶液浓度为200ppm时，处理时间为24小时时，其造成一种多年生宿根性杂草——空心莲子草(Alternanthera philoxeroides Griseb)离体叶片出现明显的水渍斑和褐色坏死斑。
在液体浸泡法的抗线虫活性测试中，当拟壳二孢素溶液浓度为100ppm时，处理时间为24小时时，其对松材线虫的致死率为53.8％。
在纸片法抗植物病原真菌活性的测定试验中，当拟壳二孢素溶液浓度为200ppm时，处理时间为120小时时，其造成烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、半夏立枯病菌(Rhizoctonis solani)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)等四种植物病原真菌的抑菌圈分别为1.20、1.80、1.11、和1.53cm。
本发明的积极效果在于拟壳二孢素能毒杀空心莲子草和松材线虫、抑制植物病原真菌的生长，在科研及相关药物的开发利用中具有重要的研究和应用价值。
具体实施例方式实施例1从P.adversaria ZD1的固体发酵物中提取分离得到本发明化合物拟壳二孢素，具体步骤如下a.真菌P.adversaria ZD1的固体发酵培养改良的PDA培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母提取物1.0g，甘油6.0g，琼脂17g，医用复合维生素B和C各1片，水1000mL，制成平板，挑取菌株接入平板，25℃培养7天；
b.将上述培养好的P.adversaria ZD1的菌丝体冻干，再用任选的有机溶剂(例如甲醇、乙醇、丙醇，氯仿，四氢呋喃，乙腈)冷浸提取4次，将浓缩的粗提物吸收在固体吸收材料(例如粉碎的天然材料，如高岭土、粘土、滑石，石英等；或粉碎的合成材料，如微粒状硅胶，氧化铝等)上，在硅胶柱中进行色谱分离，干法上样，以氯仿/甲醇＝0-30％为洗脱剂梯度洗脱。
c.收集1％-10％的氯仿/甲醇洗脱液，减压浓缩。
d.将上述浓缩液再次在硅胶柱中进行色谱分离，干法上样，以石油醚/丙酮＝90-50％为洗脱剂梯度洗脱。
f.收集TLC板上硫酸显色为黄色的70-80％的石油醚/丙酮洗脱液，浓缩得黄色结晶，即为结构式所示的混合物。再经Sephedex-LH20多次分离，即可获得拟壳二孢素。
实施例2采用离体叶片浸渍法检测拟壳二孢素对空心莲子草离体叶片的毒害活性实验。
1.试验用药剂将试验用样品先溶于少量有机试剂DMSO，再加入一定浓度的吐温水溶液分别制备浓度为200ppm的样品测试溶液。在该溶液中，DMSO的终浓度＜3％、吐温的终浓度＜5‰。另将相同浓度的DMSO溶解于含有0.5％(V/V)的吐温-20的水溶液作为对照。
2.试验用的空心莲子草的准备将采自昆明市盘龙江边的空心莲子草种于花盆中。测试时将健康无病斑的空心莲子草叶片用剪刀剪下，用水冲洗干净，再用70％的酒精浸洗1min，然后用无菌水洗3次备用。
3.空心莲子草除草活性的测试方法将配制好的试验用药剂倒入放有6片空心莲子草的90mm的平板中，以有无水渍斑和坏死斑及其病斑大小来判断测试样品除草活性的强弱。
4.试验结果在处理时间为24小时、拟壳二孢素溶液浓度为200ppm时，观察到其造成空心莲子草离体叶片出现明显的水渍斑和褐色坏死斑。
结果表明拟壳二孢素对杂草——空心莲子草有较好的毒杀活性。
实施例3采用液体浸泡法的抗线虫活性测试方法检测本发明化合物对线虫的毒害活性实验。
1.试验用药剂试验用样品的配制方法同实施例2。
2.松材线虫的培养与制备松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus(Steiner & Buhrer)Nickle)的培养方法将灰葡萄孢(Botrytis cinerea)接入PDA平板，在25℃下培养至长满平板，接入一块带有B.xylophilus的培养基，在25℃下培养至菌丝消失，线虫长满平板。
使用时将载有线虫的培养基挑出，放到线虫分离器中，用无菌水将线虫洗出后，离心浓缩，制备成线虫悬液(每毫升500条左右)。
3.试验方法将本发明化合物的200ppm、100ppm、50ppm等三种不同浓度供试药液2ml置于直径为5cm的培养皿中，再加入活线虫20ul(约300条)线虫的悬液，轻轻混匀后将培养皿放置于25℃的培养箱中。分别于12，24和48小时检查计算线虫的死亡率。并在双目显微镜下观察，观察线虫体壁变化情况。
鉴定线虫死亡的方法为在处理平板中加入1-5滴5％NaCl溶液，2分钟后观察，死虫僵直，活虫则卷曲或扭动。
死亡率％＝死线虫数/总线虫数×100以未加样品的测试溶液为对照，整个实验重复三次，取三次平均值计算出平均死亡率。
4.试验结果结果表2.拟壳二孢素在不同浓度下对松材线虫的毒杀活性结果
结果表明拟壳二孢素对松材线虫有较好的毒杀活性。
实施例41.试验用药剂试验用样品的配制方法同实施例2。
2.植物病原真菌的培养培养基配方为常规PDA培养基，将待测试病原真菌菌种接种到250mL三角瓶中(每瓶装50mL)，25℃下摇床(转速为220rpm)培养36小时。
制备混菌平板将直径9cm培养皿灭菌后，倒入20mL 45℃的前述常规PDA培养基和0.3mL的植物病原真菌发酵菌液，充分混匀，制成混菌平板。
3.试验方法纸片测定法。使用的纸片直径为2mm，进行试验时，先将纸片在配制好的测试样品溶液中蘸一下，再将蘸有药液的纸片放在混菌平板中间，于25℃下培养120小时，测量抑菌圈直径，重复三个样品。
4.试验结果表3拟壳二孢素(200ppm)对植物病原真菌的抑菌作用
结果表明培养120小时后，对照未出现抑菌圈，而拟壳二孢素对所测试的四种植物病原真菌的生长具有明显的抑制作用，抑菌圈最大的为1.80cm，最小的也为1.11cm，显示了其对植物病原真菌的较好抗性。
权利要求
1.一种拟壳二孢素，由生产菌株，通过液体或固体发酵及提取代谢物的方法得到，其特征在于a.生产菌株是Pseudohalonectria adversaria ZD1，该菌株于2003年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0931；b.拟壳二孢素的分子式为C14H18O3，分子量为234，结构式如下图所示
2.权利要求1所述拟壳二孢素的应用，其特征在于拟壳二孢素作为制备农药制剂的应用。
全文摘要
本发明涉及一种拟壳二孢素及其应用，属生物农药技术领域。该活性化合物，由生产菌株、通过液体或固体发酵及提取代谢物的方法得到。其生产菌株为Pseudohalonectria adversaria ZD1，该菌株于2003年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.0931；拟壳二孢素的分子式为C
文档编号A01P5/00GK1837371SQ20061001085
公开日2006年9月27日 申请日期2006年4月26日 优先权日2006年4月26日
发明者董锦艳, 张克勤, 李铷 申请人:云南大学