专利名称：牛连续超数排卵方法
技术领域：
本发明涉及胚胎工程领域，特别是涉及牛的连续超数排卵方法。
背景技术：
牛为单胎动物，一个发情周期仅排卵1枚，怀孕期间不发情排卵，在实际生产中，由于妊娠、哺乳乏情、冬季休情等因素的影响及母牛实际利用年限的限制，多数母牛一生仅排几十个卵子，不足卵巢卵母细胞数的0.1％，有99.9％的卵母细胞都没有发育成熟，没有起到应有的作用。超数排卵技术即利用生殖激素刺激卵泡生长和发育，可使奶牛排出较正常多几倍、十几倍的卵母细胞，在人工授精后形成奶牛胚胎。
目前，在畜牧业发达的国家，奶牛的胚胎移植、超数排卵技术日趋成熟，胚胎移植已进入商品化阶段。
我国这项技术近几年也得到了迅速发展，在奶牛改良中发挥了重要作用。但是在我国，由于可用来做超数排卵的优良奶牛供体数量少，生产的胚胎远远不能满足市场的需要。每年要从国外进口大量胚胎，造成胚胎移植成本较高。超数排卵技术从70年代以来逐渐成熟，并应用于生产实际，在常规的超数排卵方案中，供体牛超排间隔时间至少需要2个月，这在过去的20年中几乎没有改进，人们依靠增加供体牛数量来提高胚胎产量。
在超数排卵中经常会用到促卵泡素(FSH)和氯前列烯醇(PG)。促卵泡素是垂体分泌的一种糖蛋白激素，主要作用是促进和维持正常的性腺发育和生殖功能。FSH的生理功能是通过分布于性腺的特异性受体所介导的。氯前列烯醇是PGF2α的类似物，在目前常用的前列腺素F2α(PGF2α)及其类似物中，其活性最高。氯前列烯醇具有很强的溶解黄体、促进平滑肌收缩以及促进催产素的分泌作用。
常规的同期发情超数排卵方法主要包括有自然发情方法和同期发情方法。
自然发情方法，按照牛表现站立，接受爬跨为发情0天，并从发情第9-12天开始肌注促卵泡素(FSH)，以注射FSH开始为第一天，每天的早6:00和晚18:00各注射一次。自然发情法注射的剂量如表1。
表1自然发情法的注射剂量
同期发情方法，注射PG同期在情期的3-16天，开始注射PG待发情后，以发情当天为0天，第9-13天，作二次注射，待发情后，第9d-13d开始注射FSH，方法同自然发情超排程序。如表2所示。以放入阴道栓(CIDR)计为第0天，第9天开始注射FSH，第11天取栓。
表2同期发情法的注射剂量(PG法)
上述超数排卵方法的缺点是常规的生产胚胎方法是在母牛超数排卵和冲胚之后，需要恢复2-3个月或更长时间，而且随着超数排卵处理次数的增加，每次处理所得胚胎数量和质量都有所下降。每年每头牛可生产胚胎10-15枚。时间间隔长，造成了优秀的供体牛的使用次数减少，无形中增加了胚胎移植的费用。上述说的FSH为加拿大进口，400mg/瓶。
发明内容
本发明针对现有技术的上次超排后需要恢复的时间间隔长的缺陷，提供了一种牛连续超数排卵方法。本方法缩短了供体牛处理的间隔时间，增加了一年中超数排卵的次数，得到更多的胚胎，充分利用优秀供体牛的遗传资源，降低了胚胎的生产成本，从而降低了胚胎移植的费用。
一种牛连续超数排卵方法，包括如下步骤以放栓为第0天，在第四，五天，六天，七天早晚各注射一次促卵泡素，第七天同时还早晚各注射一次注射氯前列烯醇；第九天和第十天人工受精；第十七天进行冲胚，并注射氯前列烯醇；第二十四天时注射氯前列烯醇；第三十天放栓，成为下一个超排的0天。
所述的牛连续超数排卵方法，其特征在于放栓前还对供体牛进行B超检查。
所述的第四天注射的促卵泡素按购自中科院动物所，规格10mg/瓶计，注射量是1.2-1.4mg。
所述的第五天和第六天的注射的促卵泡素按购自中科院动物所，规格10mg/瓶计，注射量是1.1-1.3mg。
所述的第七天注射的促卵泡素按购自中科院动物所，规格10mg/瓶计，注射量是1.0-1.2mg。
所述的第七天注射的氯前列烯醇按购自上海计划生育研究所，规格0.2mg/2ml/支计，注射量是0.3-0.5mg。
所述的第十七天天冲胚时，还可以注射青霉素、链霉素、土霉素或金霉素。
所述的第二十四天注射的氯前列烯醇按购自上海计划生育研究所，规格0.2mg/2ml/支计，注射量是0.3-0.5mg。
所述的第十一至十六天、十八至二十三天和二十五至二十九天不做处理，正常管理。
对于供体母牛的选择据其年龄、发情周期和生殖系统有一定的标准。要选择年龄在18月龄以上，肉牛达到成熟体重的65％-70％，奶牛要在产后2个月以上。母牛营养全面平衡，膘情达到中上等为宜。母牛的发情周期正常，至少2-3个情期正常，每个发情周期18-24天之间。而且所选的母牛无生殖器官疾病，无传染性疾病，超排前2-3个月以内最好不注射各类疫苗；供体牛无对激素及其他药品的过敏史。卵巢要求有弹性、质地好、无卵泡囊肿和黄体囊肿；卵巢系膜及卵巢与腹腔无粘连现象；子宫角质地柔软、无炎症、硬肿现象；直肠要求无炎症、过肥、紧缩现象。卵巢要求在上次超数排卵后，虽有退化黄体，但要求质地柔软、有弹性；卵巢发育静止时不能做超排；高产奶牛产奶高峰时每天产奶量不低于25公斤不做超排。
与改进前相比，在每次超数排卵之前，对准备进行超排的牛进行B超检查以了解牛只的卵巢发育情况，包括卵泡的大小、个数及黄体情况；本发明注射FSH提前到第4天，注射PG的时间也由原来的第9天提前到第7天，人工输精的时间也从原来的第13天提前到现在的第9天，克服了以往人们的一般就从第9天开始注射FSH的技术偏见，从而整体上节省了超排供体牛的处理时间，同时减少了输精次数，节约了精液；在整个超排程序中，第24天对超排牛只注射PG进行消黄处理，有利于下一次超排工作的进行。
常规超数排卵技术一般每年超排1～4次不等，以每年超排4次计算，每次每头牛平均获得胚胎5枚，每头牛年产胚胎20枚左右。本发明牛连续超数排卵方法，可以在一个固定时间内较快地重复进行激素处理，也不会影响到超排反应，这个方法可用于间隔25-30天连续进行超数排卵，不用考虑发情检测或发情的阶段，也不会影响胚胎质量；平均每次生产胚胎5枚，每头牛年产胚胎50枚左右，大大超过常规超排技术生产胚胎的数量；奶牛正常繁殖，年产一胎，一般为一头小牛。应用连续超数排卵技术，每头牛年产胚胎50枚左右，经过胚胎移植后，一般冻胚移植受胎率按平均水平45％计，可得到小牛22头，充分挖掘高产母牛的繁殖潜力。对于高价值的奶牛的快速扩繁提高了效率降低了成本。
注射FSH的量是以国产如中科院动物所的FSH，10mg/瓶为说明，如是进口，如加拿大进口的FSH，400mg/瓶，由于两者的浓度不同，但瓶装没有具体的说明，经过长期的摸索，得出如果注射的是进口的FSH，则注射剂量可以是第四天早晚各70mg，第五天60mg，第六天40mg，第七天30mg，达到同样的效果。本发明注射的时间提前，改进后的超排在每年7月、8月之外的时间都可以进行，每月1号放栓，4号开始注射FSH，17号冲胚，除7月、8月外，每年可以进行超数排卵10次，达到了较好的效果。
土霉素和金霉素的使用方法是，2～3g的土霉素或金霉素用生理盐水稀释成悬浮液后注入阴道。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1本实施例为优选实施例。
1试剂新洁尔灭；盐酸利多卡因；杜氏磷酸缓冲液(PBS)；0.9％生理盐水；酒精棉球；青霉素(160万单位)；链霉素(100万单位)；PG 0.2mg/2ml/支，购自上海计划生育研究所；FSH10mg/瓶，购自中科院动物所。
2实验器材所需器材冲卵管(16#)，直剪18cm，弯止血钳18cm，剪毛剪(18cm)，通芯，烧杯500ml，滤器，输液架，10ml注射器，三通管，乳胶管，夹子，1ml注射器，洗瓶500ml。
所需仪器液氮罐，胚胎移植车，B超仪。
4操作步骤4.1供体母牛的选择。奶牛年龄在18月龄以上，肉牛达到成熟体重的65％-70％，奶牛要在产后2个月以上。母牛营养全面平衡，膘情达到中上等为宜。
4.2配种牛发情后8-12小时开始第一次输精每隔8-12小时作第二次。
4.3冲胚冲胚的时间，以发情当天为0天，于第7d-7.5d开始冲胚。
冲胚前要作好准备工作，每头牛冲两侧子宫角所需要的足够的PBS，1000ml/头。凡所用器械均需事先高压灭菌消毒(金属高压、塑料制品气体灭菌)；将器械车放于牛的左侧，上面摆好(剪毛剪、持针钳、镊子)各一把，冲洗瓶一个，500ml烧杯一个(盖上滤器)、或集卵杯、通芯、导管、酒精棉球，输液架立于六柱栏旁挂上PBS，吊瓶连接硅胶管并与滤器相连接。将牛牵入保定架，保定确实。清除粪便后将牛的肛门及附近冲洗消毒，操作者指甲剪短，手臂用清水洗净并消毒，佩带一次性塑料长臂手套，涂少量润滑油。
冲胚的步骤4.3.1冲胚前10分钟进行荐尾椎间隙或第一、二尾间间隙硬膜外麻醉，注射6ml 2％盐酸利多卡因。首先用手抬举尾根，用手触摸间隙部位，在荐尾椎用剪毛剪剪毛，碘酒消毒，再用酒精脱碘。然后将利多卡因吸入10ml注射器，用9号针头呈45度左右方向刺入皮内，再刺入硬膜。最后在针头上滴一滴利多卡因看是否下渗，若下渗即可注入。
4.3.2用0.01％新洁尔灭消毒外阴部，用灭菌生理盐水冲洗后，吸水纸拭干。
4.3.3冲卵管用酒精消毒后冲卵液冲洗，检查气囊是否完好。
4.3.4将通芯插入冲卵管，一手通过直肠把握子宫颈，另一手将冲卵管通过子宫颈进入一侧子宫角大弯部。不要用力过猛，要缓慢，依肠腔向前伸入。努责和直肠扩张时，手在直肠内暂时不动。不能过度刺激肠粘膜。
4.3.5根据子宫颈粗细冲入一定量气体，抽出通芯。
4.3.6开始注入30ml左右PBS，再将子宫角提高并轻轻按摩，使PBS回流到滤器中，反复五次左右，然后每次注入量加到50ML左右，每侧冲洗总量为500ml PBS，一侧子宫角冲卵后，立即将回收液送实验室检胚。
4.3.7冲完一侧子宫角，抽出冲卵管，用生理盐水冲洗干净。
4.3.8按上述方法冲另一侧子宫角。
4.3.9冲完后肌注PG0.4mg/头，青霉素(160万单位/支)链霉素(100万单位/支)每头牛各两支注入子宫。
4.3.10冲胚结束后应将冲卵管立即泡入清水中进行清洗。
注意事项
1.激素剂量准确无误；2.输精时要稳、准、避免对卵巢强烈刺激；3.输精部位在子宫角；4.冻精解冻后精子活力要求0.35以上；5.插导管时要轻，防止损伤子宫颈或子宫角内膜；6.注PBS时不能多、快、猛；7.遇冲卵管插不进去时，不要强行，检查通芯是否穿出管外；8.宫颈粘液较多时，可用粘液吸取管先将黏液清除后再进行冲胚。
放栓为0天，第4天开始注射FSH，第7天撤栓。国产FSH注射剂量总共为10mg/头，加拿大进口FSH注射剂量为400mg/头。整个周期如表4所示。
表4本发明连续超数排卵的注射剂量
实施例2，3方法如实施例1，注射的剂量表5所示。实施例2，3也能达到与实施例1同样的效果。
表5本发明连续超数排卵的注射剂量
权利要求
1.一种牛连续超数排卵方法，包括如下步骤以放栓为第0天，在第四，五天，六天，七天早晚各注射一次促卵泡素，第七天同时还早晚各注射一次注射氯前列烯醇；第九天和第十天人工受精；第十七天进行冲胚，并注射氯前列烯醇；第二十四天时注射氯前列烯醇；第三十天放栓，成为下一个超排的0天。
2.根据权利要求1所述的牛连续超数排卵方法，其特征在于放栓前还对供体牛进行B超检查。
3.根据权利要求1或2所述的牛连续超数排卵方法，所述的第四天注射的促卵泡素按购自中科院动物所，规格10mg/瓶计，注射量是1.2-1.4mg。
4.根据权利要求3所述的牛连续超数排卵方法，所述的第五天和第六天的注射的促卵泡素按购自中科院动物所，规格10mg/瓶计，注射量是1.1-1.3mg。
5.根据权利要求1-4任一所述的牛连续超数排卵方法，所述的第七天注射的促卵泡素按购自中科院动物所，规格10mg/瓶计，注射量是1.0-1.2mg。
6.根据权利要求1-5任一所述的牛连续超数排卵方法，所述的第七天注射的氯前列烯醇按购自上海计划生育研究所，规格0.2mg/2ml/支计，注射量是0.3-0.5mg。
7.根据权利要求1-6任一所述的牛连续超数排卵方法，所述的第十七天冲胚时，还可以注射青霉素、链霉素、土霉素或金霉素。
8.根据权利要求1-7任一所述的牛连续超数排卵方法，所述的第二十四天注射的氯前列烯醇按购自上海计划生育研究所，规格0.2mg/2ml/支计，注射量是0.3-0.5mg。
9.根据权利要求1-8任一所述的连续超数排卵方法，所述的第十一至十六天、十八至二十三天和二十五至二十九天不做处理，正常管理。
全文摘要
“牛连续超数排卵方法”涉及胚胎工程领域，特别是涉及牛的连续超数排卵。一种牛连续超数排卵方法，包括如下步骤以放栓为第0天，在第四，五天，六天，七天早晚各注射一次促卵泡素，第七天同时还早晚各注射一次注射氯前列烯醇；第九天和第十天人工受精；第十七天进行冲胚，并注射氯前列烯醇；第二十四天时注射氯前列烯醇；第三十天放栓，成为下一个超排的0天，并作B超检查。本发明能够节省超排供体牛的处理时间，同时减少了输精次数，节约了精液；可以在一个固定时间内较快地重复进行激素处理，也不会影响到超排反应；平均每次生产胚胎5枚，每头牛年产胚胎50枚左右，大大超过常规超排技术生产胚胎的数量。
文档编号A01K29/00GK1919158SQ20061011296
公开日2007年2月28日 申请日期2006年9月13日 优先权日2006年9月13日
发明者李海洋, 张红霞, 吴亦芳, 张向利, 王月, 李荣旗 申请人:北京锦绣大地农业股份有限公司