专利名称：一种营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法
技术领域：
本发明涉及一种营养繁殖花卉石蒜的保存方法，具体的说，涉及一种营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法。
背景技术：
石蒜属(Lycoris)植物为多年生球根花卉，分布于我国西南至东南部，是我国的珍贵花卉之一。可能是人为传播，或者自然分布、演化的原因，目前从我国东南地区到沿海诸岛、朝鲜半岛、琉球群岛，以及日本的九州、四国和本岛等地方均已报道有其分布，但70％以上的石蒜资源都分布于我国。石蒜开花时无叶陪伴，花茎从裸露的地面出现，并开放出艳丽、硕大的花朵，芳姿独特、艳丽夺目，西方又称之为“魔术花”、“中国郁金香”、“惊喜百合”。除了其重要的观赏价值外，石蒜还有重要的药用价值，其中的重要成分加兰他敏对治疗老年痴呆等神经性疾病有效(Piotrovsky，V.，A.Van.Peer，N.V.Osselaer，M.Armstrong and J.Aerssens.2003.Galantamine PopulationPharmacokinetics in Patients with Alzheimer′s DiseaseModeling andSimulations.The Journal of Clinical Pharmacology，43514-523.)。我国虽具丰富野生资源，但栽培种类单一，繁殖系数不高，药用成份含量低，适用种球严重不足。特别是近年来，以日本为主的东南亚国家，从国内大量收采石蒜属资源，培育繁殖新品种，广泛应用于绿地、花坛绿化。由于人工栽培的石蒜在我国还非常稀少，因此，野生石蒜资源被大量盲目挖采，造成巨大的资源破坏，现有的石蒜资源已经变得十分贫乏。如何有效保存野生资源成为我们面临的新课题。
对于多数能产生种子的植物，基因资源保存的重点是种子的低温干燥保存(Roberts H.F.1973.Predicting the viability of seeds.SeedScience and Technology 1，499-514.)。但是对于以下三类植物，种子保存则行不通。一是根本不产生种子的植物，只能进行营养繁殖；二是块根、块茎类植物，有些是不育的，而有些种类是可育的，能产生传统意义上的种子，但因种子高度杂合，成长后性状高度分离，不能用于基因资源的保存，也只能用营养繁殖来保持纯种基因型；三是有些植物产生顽拗型种子，含水量高，既不能忍受干燥，又不能忍耐低温，很难长期保存。针对这些种子繁殖有问题的植物资源，如百合、石蒜、大蒜、草莓、薯类等难以获得种子的营养繁殖的植物遗传资源，一般通过繁种圃或保存圃的田间种植方式来保存。这种保存方法不仅需要占用耕地、耗时、费力，还存在受干旱、洪涝、低温、热害、病虫害等自然灾害的影响以及人工驯化栽培不适的影响而导致种质变异或种质毁灭的危险性，不适应于种质资源的长期保存(Withers L.A.and Engels J.M.M.1990.The test tube genebank-a safe alternative tofield conservation，IBPGR Newsletter for Asia and the Pacific 3，1-2.)。
超低温保存是指在液氮(-196℃)下的低温保存。在此条件下，植物的生物化学活性近乎停止，贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内，被认为是植物遗传资源长期保存的最优选择(Engelmann F.1997.In vitro conservation methods.InCallow JA，Ford-Lloyd BV，Newbury HJ(eds)Biotechnology and plant geneticresources.CAB International，Oxford，pp 119-161.)。它避免了田间保存易受自然灾害影响而导致种质变异或毁灭，以及组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险。关于植物超低温保存的研究，在进入到上世纪的90年代后，保存技术的多样化与简易化方面不断取得进步，能够保存的植物物种数也在不断地增长，但多数集中在苹果、樱桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及马铃薯、红薯、草莓等薯类植物为主的植物遗传资源的超低温保存(Sakai A andNishiyama Y.1978.Cryopreservation of winter vegetative buds of hardyfruit trees in liquid nitrogen.Hortic Sci 13225-227.)。目前国际上针对石蒜的超低温保存技术尚未确立。
虽然利用超低温保存技术保存植物遗传资源的实践，在上述物种中有了成功应用的报道，但并不意味着任何植物物种或品种具有通用的方法。因为大多数植物材料如悬浮细胞、愈伤组织、茎尖、芽尖、胚等，含有大量的细胞间水分，对冷冻伤害特别敏感。特别是植物分生组织、芽端的超低温保存较细胞培养物保存难度更大，原因在于分生组织、芽端的细胞质分布均匀而且稠密，对低温冰冻极为敏感，冰冻过程中的损伤效应特别突出，哪怕是局部的冰冻损伤都会影响冻后的正常分化与再生。同时，分生组织、芽端必须保持结构的完整性才能快速分化。所以，超低温保存面临的课题是尽可能采取更多的、更有效的手段来保证分生组织、芽端在冻存过程中免受损伤。以上特征因物种不同而存在差异，此外，植物离体材料经超低温保存后，因植物种类而异的复苏培养技术的建立也是超低温保存面临的课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法。
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法，包括如下步骤将石蒜的鳞茎诱导后，取同时带有根原基和芽原基的茎尖预培养后，放于预处理溶液中于室温下处理15～30min后，转入玻璃化保护剂中进行70～90min的冰浴处理，再将茎尖转移至装有预冷过的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中，10～15个茎尖/管，投入液氮中保存即可。
所述石蒜的鳞茎诱导优选为取石蒜的3～4年生鳞茎，用70％酒精消毒1min，0.1％的升汞消毒15min，无菌水冲洗若干次后将带3～4层鳞片及部分茎盘的鳞茎切块接种于含3mg·L-1BA及0.5mg·L-1NAA的MS培养基上诱导小鳞茎，培养温度为23～27℃，光照12h·d-1，光照强度36μmol m-2s-1，继代3个月。
所述预培养优选为取诱导后的鳞茎，切取2～3mm大小的同时带有根原基和芽原基的茎尖，接种到含0.4mol·L-1蔗糖的MS培养基内，25℃下暗培养5d。
石蒜优选为红花石蒜(Lycoris radiata Herb)。
所述预处理溶液优选为含有2mol·L-1甘油和0.4mol·L-1蔗糖的MS液体培养基。
玻璃化保护剂优选由3.26mol·L-1甘油、2.42mol·L-1乙二醇、1.9mol·L-1DMSO和0.4mol·L-1蔗糖组成。
解冻后的培养方法优选为取冷冻管，立即放入40℃水浴中快速解冻2min，茎尖在室温下用含1.2mol·L-1蔗糖的MS培养液洗涤2～3次，每次5～10min，洗涤后的茎尖用滤纸吸干后，转移至含0.5mg·L-1BA、0.1 mg·L-1NAA和0.5 mg·L-1GA3的MS半固体培养基中暗培养7d，再转入含3mg·L-1BA和0.5mg·L-1NAA的MS固体培养基中，在鳞茎诱导的条件下培养。
本发明所述的营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法简便易行，稳定可靠，保存后石蒜恢复生长状况良好。
石蒜为营养繁殖的球宿根植物，其组织含水量较多，易结冰，所以其超低温保存难度较大。本试验成功创造出了红花石蒜茎尖的超低温保存技术及其工艺流程，并在解冻和恢复培养后可以分化成再生植株，这对其他球宿根类植物遗传资源的超低温保存来说，具有很好的参考价值。
图1红花石蒜超低温保存流程图； 图2红花石蒜茎尖状态与变化图； 图3茎尖大小对石蒜超低温保存成活率的影响图； 图4蔗糖浓度及预培养时间对茎尖成活率的影响图； 图5玻璃化试剂处理时间对茎尖成活率的影响图。
图2中a诱导出的整齐小鳞茎；b冻后成活(中)与未成活茎尖(两侧)；c茎尖恢复培养的3种类型；d恢复培养60d后的再生植株。
具体实施例方式 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1红花石蒜(Lycoris radiata Herb)诱导 取红花石蒜(Lycoris radiata Herb)的3～4年生鳞茎，用70％酒精消毒1min，0.1％的升汞消毒15min，无菌水冲洗若干次后将带3～4层鳞片及部分茎盘的鳞茎切块(约1cm大小)接种于含3mg·L-1BA及0.5 mg·L-1NAA的MS培养基上诱导小鳞茎。培养温度为25±2℃，光照12h·d-1，光照强度36μmol m-2s-1。
实施例2红花石蒜(Lycoris radiata Herb)预培养 取实施例1所得的小鳞茎，切取2.5mm大小的同时带有根原基和芽原基的茎尖，接种到含0.4mol·L-1蔗糖的MS培养基内，25℃下暗培养5d。
实施例3 将预培养后的茎尖放在预处理溶液(2mol·L-1甘油和0.4mol·L-1蔗糖的MS液体培养基)中于室温下处理20min后，转入玻璃化保护剂(3.26mol·L-1甘油+2.42mol·L-1乙二醇+1.9mol·L-1DMSO+0.4mol·L-1蔗糖)中进行80min的冰浴处理，再将茎尖转移至装有预冷过的新鲜玻璃化保护剂的2mL冷冻管中(10个茎尖·管-1)，迅速投入液氮中保存。
实施例4 从液氮中取出冻存的冷冻管，立即放入40℃水浴中快速解冻2min。茎尖在室温下用含1.2mol·L-1蔗糖的MS培养液洗涤3次，每次7min。洗涤后的茎尖用滤纸吸干后，转移至含0.5mg·L-1BA+0.1mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1GA3的MS半固体培养基中暗培养7d，再转入含3mg·L-1 BA和0.5mg·L-1NAA的MS固体培养基中，在同小鳞茎诱导的条件下培养，2周后茎尖将恢复生长(萌发根、芽或愈伤组织)，约2个月后再生植株可达4cm，植株强健(见图2-d)。
实施例5茎尖大小对石蒜超低温保存成活率的影响 超低温保存中，石蒜茎尖大小对超低温保存的成活率及恢复培养均有影响。材料体积小，在冻存中容易脱水，受冰晶伤害小，但在其后的恢复生长中不易成活，所以选用体积大小适当的和成活率较高的茎尖，是应注意的问题。在本试验中，用1～1.5mm、2～3mm、4～5mm的茎尖在蔗糖浓度为0.4mol·L-1的MS培养基内预培养3d后，用预处理液处理20min，再以玻璃化保护剂处理80min，冻存后恢复培养的结果表明茎尖直径为2～3mm的成活率最高(可达80％)。茎尖小于2mm或大于4mm的成活率仅为40％和33％(图3)。这可能是由于石蒜茎尖外层鳞片包裹紧密，保护剂渗入受阻以及过大不利于保护剂和恢复培养时营养物质的渗入，以致成活率低；但茎尖过小，裸露的生长点直接接触高浓度的保护剂，可能会引起伤害，因而成活率下降。
实施例6蔗糖浓度及预培养时间对茎尖成活率的影响 茎尖的生理状态对冻后成活率有显著影响。通过较长时期的继代培养和短期的高浓度蔗糖预培养后，组织可缓和地脱去部分水分，促使细胞分泌保护物质，从而有利于冻后存活。对此，一般是切取较大茎尖组织经预培养后再切取适当大小的组织进行超低温保存，但由于石蒜茎尖外鳞片包裹紧密，经高浓度的蔗糖预培养后，茎尖组织会变软，水渍化，这给尔后的剥取操作很大不便。茎尖极易受到损伤，而且在其后的恢复培养中只能形成愈伤组织，所以分化比较困难。本试验先在解剖镜下仔细逐层剥去茎尖的鳞片，并切成适当大小组织块，经预培养后直接进行玻璃化处理。取2～3mm的茎尖放在蔗糖浓度分别为0.3、0.4、0.5、0.7mol·L-1的MS培养基上预培养3d，再用预处理液处理20min，并以玻璃化保护剂处理80min。冻后24h进行恢复培养的结果显示含0.4mol·L-1的蔗糖的培养基其成活率最高可达80％(图4)；含0.5mol·L-1的蔗糖的培养基次之，为64％。若蔗糖浓度高于0.7mol·L-1，茎尖在预培养时容易褐变，解冻后茎尖明显变软且呈水渍状，成活率降至21％。这可能是高渗透压对组织造成伤害的结果。
从最佳预培养时间来说，茎尖在0.4mol·L-1蔗糖的MS培养基上分别预培养1、3、5、7d后再冷冻保存和恢复培养的结果显示预培养时间1d的成活率仅为18％。预培养3和5d的效果较好，成活率分别可达80％及90％。预培养时间长于7d，则可能由于茎尖外围的鳞片过度闭合，以致外植体不易玻璃化，所以其成活率仅为33％。
实施例7玻璃化试剂处理时间对茎尖成活率的影响 经玻璃化试剂处理的组织会脱去水份，这样在冻存中可进入玻璃化状态，从而有效地保护细胞活性。但由于保护剂成份中含有毒性及导致变异的物质，所以必需严格掌握，在保证有足够高的成活率的前提下，尽量缩短处理时间。本试验取2～3mm的石蒜茎尖放在蔗糖浓度为0.4mol·L-1的MS培养基上培养5d后，用预处理液处理20min并以预冷过的玻璃化保护剂分别处理30、60、80、120、150min。恢复培养的结果表明处理时间少于30min，由于保护剂处理时间过短，材料脱水不够，不能成活，而后随着处理时间的延长成活率上升，80min时最高可达90％。但若延长至150min时，成活率反而降为20％(图5)。
实施例8茎尖恢复培养与植株再生 茎尖解冻后接种在培养基上约5～7d后，未成活的茎尖发生褐变或漂白，而成活的茎尖则转成淡黄至黄褐色(图2-b)。继续培养约14～28d后便恢复生长，但最长的需40～60d才能在茎尖见到有芽萌动，再生率可达53％。茎尖恢复生长时会出现3种情况(1)直接在茎尖上长出苗；(2)从茎尖基部长出根，但不能分化成苗；(3)茎尖形成愈伤组织并膨大(图2-c)。后两种情况可能是茎尖剥取中的机械损伤所致。在恢复培养中，根比芽更易再生，且恢复生长较快，14d后根长可达0.5～1cm。我们还见到，同时带有根原基和芽原基的茎尖也能在长根时萌芽，且恢复生长快，约2个月的再生植株可长达4cm，植株强健(图2-d)，这样的结果和冷冻前茎尖结构的完整性有关。
权利要求
1、一种营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法，包括如下步骤将石蒜的鳞茎诱导后，取同时带有根原基和芽原基的茎尖预培养后，放于预处理溶液中于室温下处理15～30min后，转入玻璃化保护剂中进行70～90min的冰浴处理，再将茎尖转移至装有预冷过的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中，10～15个茎尖/管，投入液氮中保存。
2、如权利要求1所述的营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法，其特征在于石蒜的鳞茎诱导为取石蒜的3～4年生鳞茎，用70％酒精消毒1min，0.1％的升汞消毒15min，无菌水冲洗若干次后将带3～4层鳞片及部分茎盘的鳞茎切块接种于含3mg.L-1BA及0.5mg.L-1NAA的MS培养基上诱导小鳞茎，培养温度为23～27℃，光照12h·d-1，光照强度36μmolm-2s-1，继代3个月。
3、如权利要求1所述的营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法，其特征在于所述预培养为取诱导后的鳞茎，切取2～3mm大小的同时带有根原基和芽原基的茎尖，接种到含0.4mol·L-1蔗糖的MS培养基内，25℃下暗培养5d。
4、如权利要求1～3任一所述的营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法，其特征在于石蒜为红花石蒜(Lycoris radiata Herb)。
5、如权利要求1～4任一所述的营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法，其特征在于所述预处理溶液为含有2mol·L-1甘油和0.4mol·L-1蔗糖的MS液体培养基。
6、如权利要求1～5任一所述的营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法，其特征在于玻璃化保护剂由3.26mol·L-1甘油、2.42mol·L-1乙二醇、1.9mol·L-1DMSO和0.4mol·L-1蔗糖组成。
全文摘要
本发明涉及一种营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法，包括如下步骤将石蒜的鳞茎诱导后，取同时带有根原基和芽原基的茎尖预培养后，放于预处理溶液中于室温下处理15～30min后，转入玻璃化保护剂中进行70～90min的冰浴处理，再将茎尖转移至装有预冷过的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中，10～15个茎尖/管，投入液氮中保存即可。本发明所述的营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法简便易行，稳定可靠，保存后石蒜恢复生长状况良好。对其他鳞茎和球宿根类植物遗传资源的超低温保存来说，具有很好的参考价值。
文档编号A01N3/00GK1934941SQ20061011383
公开日2007年3月28日 申请日期2006年10月18日 优先权日2006年10月18日
发明者刘灶长, 林田, 李天菲, 郑海柔, 罗利军 申请人:上海市农业生物基因中心