一种利用组织培养筛选耐盐番茄的方法

专利名称：：一种利用组织培养筛选耐盐番茄的方法
技术领域：
：本发明涉及耐盐番茄的筛选方法，具体涉及利用组织培养结合营养液栽培筛选耐盐番茄的方法。
背景技术：
：番茄是一种人们十分喜爱的蔬菜，营养丰富，但是，土壤的含盐量对番茄的生长影响较大，筛选一种耐盐番茄，对生产优质高产的番茄具有十分重要的意义。目前，常规的筛选方法，如只在大田中筛选或者在组培条件下利用种子发芽期筛选；文献报道的方法，如刘志媛报道番茄幼苗在温室中进行盐处理筛选，陈火英报道了NaCl胁迫对不同品种番茄种子发芽特性的影响，姜冷若报道了不同浓度NaCl胁迫对番茄种子发芽特性的影响，因此十分不便和不准确。现在实验技术只在大田中筛选或者在组培条件下利用种子发芽期筛选，大田中筛选时，外界环境条件可能不一致，使结果不可靠。除发芽期外，幼苗期也是植物对盐胁迫最敏感的时期。而且在自然条件下，番茄幼苗容易受到一些病害特别是病毒的侵染，影响了鉴定结果。本实验首先在组培条件一致的情况下进行初选并获得健康的幼苗，然后再在水培条件下进一步验证幼苗耐盐性，使结果更加可靠、准确。
发明内容本发明需要解决的技术问题是公开一种利用组织培养筛选耐盐番茄的方法，且在水培条件下进一步验证幼苗耐盐性，以克服现有技术存在的上述缺陷，满足番茄生产的需要。本发明的方法包括如下歩骤(1)将供试品种种子消毒，接种于火菌水中，置于振荡培养箱中，在2030°C，优选25士rC进行恒温振荡催芽，直至胚根长度为3~5mm，获得发芽种子；所说的供试品种种子为番茄普通栽培品种所说的种子消毒可采用常规的方法进行，优选方法如下将供试品种种子用体积浓度为75%的乙醇表面消毒1030s，然后用重量浓度为0.050。15%的HgCl2水溶液消毒515min，无菌水漂洗35次；振荡培养箱的振荡频率为80120r.min:(2)NaCl胁迫处理，将步骤(1)的发芽种子在无菌条件下分别接种在NaCl浓度为0180mmoH/1的MS培养基上，培养容器为玻璃瓶，用组培专用耐高温透明薄膜封口。在培养架上随机区组排列，培养室温度为(2030)。C，光照时间11~13h-cT1，光照度55~57nmoHiT2's_l。NaCl胁迫后812天，按下述方法调査幼苗的盐害情况；(3)高浓度NaCl胁迫处理将步骤(1)的发芽种子和砧木品种，分别接种在NaCl浓度为120mmol丄"的MS培养基卜.，采用步骤(2)相同的方法胁迫处理；所说的砧木品种为日本Takii种苗公司和日本Sakata种苗公司提供的耐盐番茄砧木品种；所说的MS培养基的组分和重量含量在同文献中已经有公开的报道，其组分和重量含量包括<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(4)盐害调査和盐胁迫指数的计算，NaCl胁迫处理后812d调査盐害级别，按幼苗叶片的受害程度和侧根数目的多少将盐害程度由轻至重分成0~4级，分级标准参考王海英等的方法并稍作修改-.0级正常生长；1级植株生长略有抑制，侧根数目多(^7条)；2级植株生长受到轻微抑制，侧根数目较多(46条)；3级植株生长受到抑制，侧根数目较少(23条)；4级植株生长受到严重抑制，无恻根。根据盐害级别计算盐胁迫指数(Saltstressindex,SSI),计算公式如下盐胁迫指数(SSI)=Z(代表级值x株数)/(最高级值x总株数)xlOO其中代表级值，即0级、l级、2级、3级和4级，最高级值，即4级。(5)将NaCl浓度为90mmol'L/1时组织培养下的幼苗转移到温室中，缓苗10d后，将幼苗根部MS培养基洗净，移栽于长47cm、宽34cm、高12cm的塑料箱中，每箱盛NaCl浓度为90mmol'L"的12L营养液，营养液栽培期间用电动气泵24小时连续通气。IO天后收获，记载幼苗株高、茎粗、根长、地上部鲜重、地下部鲜重。所说的营养液的组分和浓度见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>采用本发明的方法，可以方便的对不同番茄品种的耐盐性能进行评判,从而获得耐盐性能的番茄品种。通过组织培养可以一方面可以保证各个品种在发芽和幼苗期生长环境条件的一致，同时可以避免了苗期各种病害特别是病毒的侵染；利用组培条件下的幼苗定植到含有不同NaCl浓度的营养液中，在正常的自然生长条件下进行耐盐性筛选，进一步验证了结果的可靠性。具有十分重要的意义。具体实施方式实施例1(1)将供试品种种子消毒，接种于灭菌水中，置于振荡培养箱中，在25士rC进行恒温振荡催芽，直至胚根长度为4mm，获得发芽种子；所说的供试品种种子为番茄普通栽培品种，分别为大禹中蔬4号、宝大903、江蔬14号、美国大红亲黄、番茄大红、中蔬4号、日本大粉皇后、宝粉、粉宝18号、大禹天津白果、苏红2003、白果强丰。所说的种子消毒方法如下将供试品种种子用体积浓度为75。％的乙醇表面消毒20s，然后用重量浓度为0.1%的HgCl2水溶液消毒10min，无菌水漂洗4次；振荡培养箱的振荡频率为100fmin'1。(2)NaCl胁迫处理，将步骤(1)的12个栽培品种的发芽种子在无菌条件下分别接种在NaCl浓度为0、30、60、90、120、150、lSOmmol'l/1的MS培养基上，培养容器为直径6cm，高9cm，体积200mL的圆柱形玻璃瓶，用组培专用耐高温透明薄膜封口。每浓度接种30粒发芽种子，每瓶5粒(均匀分布于培养基表面)，共6瓶，分成3组，每组2瓶，在Jt养架上随机区组排列，3次重复。培养室温度为(25±2)'C，光照时间12Fvd'1，光照度56拜01*111-2<1。NaCl胁迫后lO天，按下述方法调査幼苗的盐害情况。(3)高浓度NaCl胁迫处理将步骤(1)的发芽种子12个栽培品种和3个砧木品种，共15份材料的发芽种子分别接种在NaCl浓度为120mmoK/1的MS培养基上，采用步骤(2)相同的方法胁迫处理每个品种接种30粒发芽种子，培养容器、培养条件、分组排列方法及调査时间同上。所说的砧木品种为日本Takii种苗公司和日本Sakata种苗公司提供的耐盐番茄砧木品种。(4)盐害调查和盐胁迫指数的计算，NaCl胁迫处理后10d调査盐害级别，按幼苗叶片的受害程度和侧根数目的多少将盐害程度由轻至重分成0~4级，分级标准如下0级正常生长；1级植株生长略有抑制，侧根数目多(^7条)；2级植株生长受到轻微抑制，侧根数目较多(4~6条)；3级植株生长受到抑制，侧根数目较少(2~3条)；4级植株生长受到严重抑制，无侧根。根据盐害级别计算盐胁迫指数(Saltstressindex,SSI)，计算公式如下盐胁迫指数(SSI)=Z(代表级值x株数)/(最高级值x总株数)xlOO其中代表级值，即O级、l级、2级、3级和4级，最高级值，即4级。上述的番茄普通栽培品种的具体的试验结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>宝大903Baoda903NaCI浓度江蔬14号Jiaiigshu14NaCI浓度美国大红亲黄AmericanDahongNaCI浓度番茄大红TomatoDahongNaCI浓度301303017118003060卯12015018003060卯12015018003060卯12015018003030460卯120150180303014109413324416821138104212144126126136814263030826303052430303223030100036.6765.8381.6796.67100100032.5055.8373.3396.67100100035.8355.0060.8395.00100100035.0053.3360.0092.50100100中蔬4号Zhongshu4NaCI浓度日本大粉皇后JapaneseDafenQueenNaCI浓度宝粉B加feiiNaCI浓度粉宝18号Fenbao18NaCI浓度3018130124大禹天津030609012015018003060卯120150180030609012015018003060790120150180030301430267116181216244114111106625921212221111993149131486212130122128302142230111924017.5048.3357.5092.5092.50100015.0037.5057.5092,5098.33100013.3330.0055.8379.1791.6710003.3329.1756.6778.3387.5095.00011白果DayuTianjinBaiguoNaCI3060272221513.3329.16浓度90014102446.6712000121178.33150161486.6718062495.00苏红20030300.00Suhong20033028112.50NaCI60281127.5浓度卯12949.1712081574.17150181285.0018062495.00白果强丰B:iiguoQi肌gfeng0303027302.50NaCI601312518.33浓度90181220.001208110946.67150121880.00180282090.00(5)将NaCI浓度为90mmol丄"时组织培养下的幼苗转移到温室中，缓苗10d后，将幼苗根部MS培养基洗净，移栽于长47cm、宽34cm、高12cm的塑料箱中，每箱盛NaCl浓度为90mmol丄"的12L营养液，营养液栽培期间用电动气泵24小时连续通气。IO天后，记载幼苗株高、茎粗、根长、地上部鲜重、地下部鲜重。所说的营养液的组分和浓度见下表成分使用浓度(niinol/L)上述的番茄普通栽培品种的具体的试验结果如下:品种株高(era)茎粗(cm)根长(cm)地上部鲜重(g)根部鲜重<g)大禹中蔬4号12.323.0815.922.230.44DayuZhongshu-4宝大9(B13.423.3816.103.110.61Baoda903江蔬U号14.823.4616.383.730.76Jiangshu14美国大红亲黄15.023.5217.344.101.09AmericanDahong番茄大红15.043.8619.304.181.10TomatoDahong中蔬4号15.163.9920.825.021.20Zhongshu4曰本大粉皇后16.164.0421.305.231.25JapaneseDafenQueen宝粉16.644."21.445.881.31Baofen粉宝18号18.464.2621.646.271.35Fenbao18大禹天津白果DayuTian〗inBaiguo18.884.5821.886.491.44苏红2003Suhong200319.284.7321.986.621.54白果强丰19.524.8122.167.471.72BaiguoQiangfeng综合系列浓度NaCl胁迫时的盐胁迫指数和半致死盐浓度认为，大禹中蔬4号(半致死盐浓度为51.61mmol'I^X宝大903、江蔬14号、美国大13大量元素微量元素KN034Ca(N03)2.4H202.5氢钾KH2P041MgS04.7H201H3B030.0461MnS04.4H200.0126ZnS04.7H200.00076(NH4)6M07O24.4H2O0.000016CuS04.5H200細3四乙酸二钠铁2NaFe-EDTA0.08钾钙二镁锰锌钠铜胺酸酸酸酸酸酸酸酸酸二硝硝磷硫硼硫硫钼硫乙红亲黄、番茄大红为盐敏感品种；中蔬4号、日本大粉皇后、宝粉、粉宝18号为中等耐盐性品种；大禹天津白果、苏红2003、白果强丰的耐盐性较强。大禹中蔬4号耐盐性最弱，白果强丰(半致死盐浓度为118.91mmol丄—1)耐盐性较强。综合12个普通番茄栽培品种在卯mmol七"NaCl的水培生长的形态学指标株高、茎粗、根长、地上部鲜重、地下部鲜重，认为结果和上述结论相一致。在12个番茄栽培品种中，除白果强丰盐胁迫指数为46.2外，其余品种的盐胁迫指数均大于50，耐盐性较弱；3个砧木品种("影武者"、"Magnet"和"Support")的盐胁迫指数分别为22.2、17.1、16.7，绝大部分幼苗能正常生长，耐盐性显著强于12个普通栽培品种。大禹中蔬4号的盐胁迫指数最高，为98.3，耐盐性最弱；3个砧木品种中，"Support"盐胁迫指数最低，为16.7，耐盐性最强。权利要求1.一种利用组织培养筛选耐盐番茄、在水培条件下进一步验证结果可靠性的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)将供试品种种子消毒，接种于灭菌水中，置于振荡培养箱中，在20～30℃，进行恒温振荡催芽，直至胚根长度为3～5mm，获得发芽种子所说的供试品种种子为番茄普通栽培品种；(2)NaCl胁迫处理，将步骤(1)的发芽种子在无菌条件下分别接种在NaCl浓度为0～180mmol·L-1的MS培养基上，培养容器为玻璃瓶，用组培专用耐高温透明薄膜封口。在培养架上随机区组排列，培养室温度为20～30℃，光照时间11～13h·d-1，光照度55～57μmol·m-2·s-1，NaCl胁迫后8～12天，按下述方法调查幼苗的盐害情况；(3)高浓度NaCl胁迫处理将步骤(1)的发芽种子和砧木品种，分别接种在NaCl浓度为120mmol·L-1的MS培养基上，采用步骤(2)相同的方法胁迫处理；(4)盐害调查和盐胁迫指数的计算，NaCl胁迫处理后8～12d调查盐害级别；(5)将NaCl浓度为90mmol·L-1时组织培养下的幼苗转移到温室中，缓苗10d后，将幼苗根部培养基洗净，移栽于NaCl浓度为90mmol·L-1的营养液中，营养液栽培期间连续通气，10d后收获，记载幼苗株高、茎粗、根长、地上部鲜重、根部鲜重。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的种子消毒方法如下将供试品种种子用体积浓度为75%的乙醇表面消毒1030s,然后用重量浓度为0.050。15%的HgCl2水溶液消毒515min，无菌水漂洗3、5次。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，振荡培养箱的振荡频率为80120r.mirT1。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按幼苗叶片的受害程度和侧根数目的多少将盐害程度由轻至重分成0~4级0级正常生长；1级植株生长略有抑制，侧根数目多(27条)2级植株生长受到轻微抑制，侧根数目较多(46条)；3级植株生长受到抑制，侧根数目较少(2~3条)；4级植株生长受到严重抑制，无侧根。根据盐害级别计算盐胁迫指数，计算公式如卜'盐胁迫指数(SSI)=Z(代表级值x株数)/(最高级值x总株数)xl()O其屮代表级值，即0级、l级、2级、3级和4级，最高级值，即4级。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，歩骤(5)中，将NaCI浓度为90mmol'L"时组织培养下的幼苗转移到温室中，缓苗10d后，将幼苗根部MS培养基洗净，移栽于NaCl浓度为90mmoH/1的塑料箱中，营养液栽培期间连续通气，10天后收获，记载幼苗株高、茎粗、根长、地上部鲜重、根部鲜重。全文摘要本发明公开了一种利用组织培养结合营养液栽培筛选耐盐番茄、并把在一定盐浓度下组织培养的幼苗在水培条件下进一步筛选耐盐番茄的方法，包括如下步骤(1)将供试品种种子消毒，接种于灭菌水中，催芽；(2)将步骤(1)的发芽种子分别接种在MS培养基上，NaCl胁迫处理；(3)盐害调查和盐胁迫指数的计算；(4)将NaCl浓度为90mmol·L^-1时组织培养下的幼苗转移到温室中，缓苗后移栽于NaCl浓度为90mmol·L^-1的营养液中。10天后收获，记载幼苗各项指标。采用本发明的方法，可以更加准确对不同番茄品种的耐盐性能进行有效评判。为番茄耐盐种质资源的筛选和利用及设施耐盐栽培提供理论依据具有十分重要的意义。文档编号A01H4/00GK101189956SQ200610118700公开日2008年6月4日申请日期2006年11月23日优先权日2006年11月23日发明者万延慧,吴雪霞,朱为民,朱龙英申请人:上海市农业科学院园艺研究所