专利名称：蟋蟀草平脐蠕孢菌的培养方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于植物病原真菌技术领域，具体涉及蟋蟀草平脐蠕孢菌的培养方法及其用途。
背景技术：
稗草是全球最难防除的杂草之一，目前主要依靠化学除草剂来防治。然而化学除草剂的长期使用使稗草的抗(耐)药性问题及环境污染问题越来越严重。开发安全高效的生物除草剂符合农业可持续发展要求，虽然目前生物除草剂还不能完全替代化学除草剂，但它能有效减少化学除草剂的使用剂量，从而减少对环境的污染。
水稻纹枯病是由土壤真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani kuhn)引起的一类严重制约水稻生产的全球性水稻病害。发病严重的区域水稻减产可达50％。由于缺少抗纹枯病的供体，目前世界上尚未育出真正意义上的抗纹枯病的水稻品种，因此开发高效安全的杀菌剂，尤其是生物来源的杀菌剂尤为重要。国内防治水稻纹枯病主要利用井冈霉素，虽然井冈霉素是一种低毒的抗生素类生物农药，但是井冈霉素已经使用了几十年，品种单一老化，而且需要多次用药才能达到预期的防治效果，成本较高。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明目的在于提供一种蟋蟀草平脐蠕孢菌培养方法的技术方案，其培养物具有防治杂草和水稻病害的用途。
蟋蟀草平脐蠕孢菌，拉丁名称Bipolaris eleusines，其有性态为Cochliobolus eleusines。是从农田自然感病的稗草上分离到的植物病原真菌，可以从浙江中稻高科技种业有限公司购买得到，其商品名称为克草霉；也可以从中国水稻研究所杂草控制和利用实验室购买得到。
蟋蟀草平脐蠕孢菌培养方法，其特征在于包括以下工艺步骤1)蟋蟀草平脐蠕孢菌菌种的分离纯化采集的感病稗草标样，用无菌纸袋带回，取感病稗草叶片，用自来水冲洗后，剪成小片状，用70％酒精消毒，置于PDA培养基上，室温(25-30℃)下保湿培养，3～4天后解剖镜下观察到平脐蠕孢菌属的分生孢子，用火焰灭菌的解剖针挑出，涂在PDA培养基上培养，取只含一个孢子的琼脂块，转接到PDA斜面上培养成单孢系，然后转接到稗草种子上培养9-11天后分装于无菌的Eppendorf离心管中，3-5℃保藏菌种；2)蟋蟀草平脐蠕孢菌的培养取一粒长有菌丝及孢子的稗草种子接种于新鲜PDA平板上，27-29℃黑暗培养6-8天后，取直径6-8mm菌块接种于PDB液体培养基中，室温25-30℃静置培养13-15天获得发酵液。
所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌培养方法，其特征在于所述的PDA培养基含有马铃薯180-220g/L、葡萄糖18-22g/L和琼脂15-20g/L。
所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌培养方法，其特征在于所述的培养基为稗草基质培养基，即采集于孕穗期的稗草植株，切成1-2cm长小段，60℃烘干备用，使用时加水高压灭菌。
所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌培养方法，其特征在于所述的PDB液体培养为振荡培养。
所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌培养方法，其特征在于步骤1)中用火焰灭菌的解剖针挑出，涂在PDA培养基上培养7天。
所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌培养方法，其特征在于步骤1)中转接到稗草种子上的培养时间为10天，菌种保藏温度为4℃。
所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌培养方法，其特征在于步骤2)中长有菌丝及孢子的稗草种子接种于新鲜PDA平板上，28℃黑暗培养7天后，取直径7mm菌块接种于PDB液体培养基中，室温28℃静置培养14天。
所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌培养方法，其特征在于所述的PDA培养基含有马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L。
所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌培养方法，其特征在于所述培养基的pH值为6-7。
所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌孢子和发酵液在生物除草剂和防治水稻纹枯病的抑菌剂中的应用。
蟋蟀草平脐蠕孢菌孢子和发酵液的代谢产物ophiobolin A在培养皿生测法中对稗草种子胚根生长有较强抑制作用，其IC50值为7.5μM，试验发现稗草对ophiobolin A敏感，对水稻安全。它可以单独使用，也可以与化学除草剂同时使用从而减少化学除草剂使用剂量并且达到良好的除草效果。同时Ophiobolin A对水稻纹枯病菌有极好的抑菌作用，其抑菌效果明显优于目前常用的井冈霉素，它在25μg/mL浓度下就有100％抑制作用，而5％井冈霉素在有效成分浓度为200μg/mL时只能达到45.2％的抑制率。
具体实施例方式
以下通过实施例及试验例对本发明作进一步详细说明。
取感病稗草叶片，用自来水冲洗后，将叶片剪成适当大小，用70％酒精消毒，置于PDA培养基上，室温28℃下保湿培养，4天后解剖镜下观察到平脐蠕孢菌属的分生孢子，用火焰灭菌的解剖针挑出，涂在PDA培养基上培养7天，取只含一个孢子的琼脂块，转接到PDA斜面上培养成单孢系，然后转接到稗草种子上培养10天后分装于无菌的1.5mL Eppendorf离心管中，4℃保藏菌种。
取一粒长有菌丝及孢子的稗草种子接种于新鲜PDA平板上，28℃黑暗培养7天后，取直径7mm菌块接种于PDB液体培养基中，室温28℃静置培养14天。
主要培养基PDA培养基，稗草基质培养基。
PDA培养基马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L；稗草基质培养基稗草植株，采集于孕穗期，切成1-2cm长小段，60℃烘干备用，使用时称取2g上述制备好的稗草，加20ml水高压灭菌。
(1)培养特性蟋蟀草平脐蠕孢菌培养要求不高，在普通的PDA培养基上室温(28-30℃)、pH6-7下生长良好，生长状态用显微镜连续观察如下1-1.5h成熟孢子从两端或一端开始萌发；3h未成熟的孢子(分隔4个以下的孢子)开始萌发，早期萌发的孢子处于菌丝生长的旺盛阶段，菌丝分枝成直角或近似直角，菌丝无隔，细胞核清晰；4.5h有的菌丝开始变粗；6h膨大的菌丝出现环痕状的隔；9h膨大的菌丝顶端开始有乳突状的小孢子出现；12h有小的分生孢子出现；24h新生的分生孢子不成熟，没有明显的分隔；
54h培养基底部变黑。
66h新生的分生孢子已成熟并萌发；(2)生理特性不同温度下蟋蟀草平脐蠕孢菌生长速度和孢子产量明显不同，28℃生长最快，产孢最多。温度高于30℃菌生长和产孢受严重抑制，温度低于25℃，菌生长速度明显减慢。
蟋蟀草平脐蠕孢菌可在一个较宽的pH范围内生长，pH6-10之间菌落直径生长速率没有显著差异，pH6-7时产孢量最多，在pH低于5和高于11之外生长缓慢。
光照可影响蟋蟀草平脐蠕孢菌的生长和产孢。在12h光照/12h黑暗交替条件下菌落生长稍快，连续光照条件下次之，而连续黑暗条件下较慢。在连续黑暗条件下产孢量最多，连续光照条件下产孢量最少。
氧气对孢子产量有明显的促进作用。
(3)代谢特性蟋蟀草平脐蠕孢菌在PDB培养基内黑暗静置培养14d后，培养物中可产生倍半萜类毒素，该毒素具有杀草和抑菌活性。
(4)菌种安全性评价供试作物为水稻(秀水11、嘉育293、协优46)、玉米、高粱、大麦、小麦、大豆、蚕豆、豇豆和油菜，供试杂草为无芒稗，分别在小塑料盒(15×10×10厘米)中育苗。利用稗草基质培养基培养孢子，无菌水制备孢子悬液(含0.05％吐温20)，在禾本科植物1叶1心和双子叶植物1片真叶时喷施孢子悬液；28℃保湿24h，14d后调查发病情况。
试验结果显示蟋蟀草平脐蠕孢菌对水稻安全，对高粱和大麦轻度致病，对稗草高度致病。
表1蟋蟀草平脐蠕孢菌安全性评价
孢子悬液浓度为2.5×105个/mL，喷雾量为200mL/m2；NS表示不感病；LS表示轻度感病；HS表示高度感病。
(4)孢子杀草活性a.蟋蟀草平脐蠕孢菌孢子对不同类型稗草的杀草活性将无芒稗、光头稗、稗(稗子)、硬稃稗(台湾稗)分别播种在小塑料盒中，在2.0叶期间苗，拔除长势弱的，每盒保留15株健壮、生长一致的稗苗。2.5-3.0叶期用蟋蟀草平脐蠕孢菌孢子悬液喷雾接种。蟋蟀草平脐蠕孢菌孢子用0.05％吐温20液洗下，调浓度至孢子5×106个孢子/mL，每平方米接种孢子数5×107个。以喷0.05％吐温20液做对照，接种后置生长箱，28±0.5℃黑暗保湿(RH95％)培养24h，然后移入28±2℃的温室，前2d喷术保湿。接种14d后调查发病情况。每个处理重复3次。试验结果表明蟋蟀草平脐蠕孢菌对硬稃稗、光头稗和无芒稗100％感病，但对稗子致病力稍差。接种后保持露珠期24h(在人工接种箱中一直细雾喷雾)，移入温室后保持RH95％以上7天，温度25-30℃的条件下，蟋蟀草平脐蠕孢菌可杀死大部分稗草。
表2蟋蟀草平脐蠕孢菌对不同稗草的致病性
注0-3表示病级，0＝无病斑，1＝不扩展小型病斑，2＝轻到中等扩展病斑，3＝大型病斑。
b.蟋蟀草平脐蠕孢菌孢子不同剂量对稗草的杀草活性供试杂草为无芒稗，用无菌水配制孢子悬液(含0.05％吐温20)，以不含孢子的0.05％吐温20作为对照，对2-3叶期无芒稗进行叶面喷施，28℃保湿24h，14d后进行稗草株高、鲜重、干重、死亡率调查。按下式计算抑制率抑制率＝(对照调查值-处理调查值)/对照调查值×100％，试验结果显示，当喷雾较高剂量孢子悬液时，蟋蟀草平脐蠕孢菌杀草活性较高，稗草鲜重抑制率38.3％，株高抑制率27.6％，死亡率达53.9％。
表3蟋蟀草平脐蠕孢菌孢子不同剂量下杀草活性比较
(5)蟋蟀草平脐蠕孢菌发酵液对纹枯病菌的抑菌活性取已活化直径为7mm菌块接种于PDB液体培养基中，25～28℃黑暗静置培养14d，4层灭菌纱布过滤得到发酵液，再用0.22μm微孔滤膜过滤得到无菌发酵液。用熔化并冷却到45～50℃的PDA培养基将无菌发酵液稀释5×，10×，20×，40×，80×，160×，在直径9cm培养皿内加入20mL含发酵液的PDA培养基制成平板，对照为空白PDA平板。从培养2d的纹枯病菌落边缘取直径7mm菌块接种于上述平板中央，28℃培养24h，用十字交叉法测菌落直径，并按下式计算发酵液对纹枯病菌的抑制率。
实验结果显示发酵液对纹枯病菌有较强的抑制作用，5X稀释的发酵液的抑菌率可达84.1％，随着稀释倍数增加，抑制作用下降，10×，20×，40×，80×稀释的发酵液的抑菌率分别为79.5％、69.3％、63.0％、46.0％，160X稀释后仍有32.9％的抑菌率。
权利要求
1.蟋蟀草平脐蠕孢菌的培养方法，其特征在于包括以下工艺步骤1)蟋蟀草平脐蠕孢菌菌种的分离纯化采集的感病稗草标样，用无菌纸袋带回，取感病稗草叶片，用自来水冲洗后，剪成小片状，用70％酒精消毒，置于PDA培养基上，室温(25-30℃)下保湿培养，3～4天后解剖镜下观察到平脐蠕孢菌属的分生孢子，用火焰灭菌的解剖针挑出，涂在PDA培养基上培养，取只含一个孢子的琼脂块，转接到PDA斜面上培养成单孢系，然后转接到稗草种子上培养9-11天后分装于无菌的Eppendorf离心管中，3-5℃保藏菌种；2)蟋蟀草平脐蠕孢菌的培养取一粒长有菌丝及孢子的稗草种子接种于新鲜PDA平板上，27-29℃黑暗培养6-8天后，取直径6-8mm菌块接种于PDB液体培养基中，室温25-30℃静置培养13-15天获得发酵液。
2.如权利要求1所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌的培养方法，其特征在于所述的PDA培养基含有马铃薯180-220g/L、葡萄糖18-22g/L和琼脂15-20g/L。
3.如权利要求1所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌的培养方法，其特征在于所述的培养基为稗草基质培养基，即采集于孕穗期的稗草植株，切成1-2cm长小段，60℃烘干备用，使用时加水高压灭菌。
4.如权利要求1所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌的培养方法，其特征在于所述的PDB液体培养为振荡培养。
5.如权利要求1所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌的培养方法，其特征在于步骤1)中用火焰灭菌的解剖针挑出，涂在PDA培养基上培养7天。
6.如权利要求1所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌的培养方法，其特征在于步骤1)中转接到稗草种子上的培养时间为10天，菌种保藏温度为4℃。
7.如权利要求1所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌的培养方法，其特征在于步骤2)中长有菌丝及孢子的稗草种子接种于新鲜PDA平板上，28℃黑暗培养7天后，取直径7mm菌块接种于PDB液体培养基中，室温28℃静置培养14天。
8.如权利要求1所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌的培养方法，其特征在于所述的PDA培养基含有马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L。
9.如权利要求1所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌的培养方法，其特征在于所述培养基的pH值为6-7。
10.如权利要求1所述的蟋蟀草平脐蠕孢菌孢子和发酵液在生物除草剂和防治水稻纹枯病的抑菌剂中的应用。
全文摘要
蟋蟀草平脐蠕孢菌的培养方法及其用途，属于植物病原真菌技术领域。采集的感病稗草标样消毒处理后，置于PDA培养基上，室温(25－30℃)下保湿培养，3～4天后解剖镜下观察到平脐蠕孢菌属的分生孢子，用火焰灭菌的解剖针挑出，涂在PDA培养基上，取只含一个孢子的琼脂块，转接到PDA斜面上培养成单孢系，然后转接到稗草种子上培养10天后分装于无菌的Eppendorf离心管中，4℃保藏菌种；取一粒长有菌丝及孢子的稗草种子接种于新鲜PDA平板上，28℃黑暗培养7天后，取直径7mm菌块接种于PDB液体培养基中，室温28℃静置培养14天。蟋蟀草平脐蠕孢菌孢子和发酵液可用于制备生物除草剂和防治水稻纹枯病的抑菌剂。
文档编号A01N63/04GK1986772SQ20061015540
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月22日 优先权日2006年12月22日
发明者张建萍, 余柳青 申请人:中国水稻研究所