专利名称：一种生物除草剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种利用微生物防除农田杂草的技术领域，尤其涉及一种利用真菌菌株防除农田杂草的生物除草剂及该除草剂的制备方法，专用于农田杂草马唐、牛筋草和稗草等的防除。
背景技术：
随着人们对化学除草残留、环境污染以及耐药和抗药性杂草发展的认识、绿色食品和有机农业的大力推广，研制生物除草剂防除杂草已成为生产上的迫切需求，它具有投资少、研制周期短、专一性强、对环境安全、不产生污染等优点。目前，商业化的生物除草剂品种有80年代初研制出的DeVine和Collego以及90年代末推出的Comperico和Biochon。这些除草剂在控制相对的目标杂草上起到了重要作用，如DeVine的持效性可以保证使用一次，2-3年无须再除草。有希望商业化的生物除草剂项目有数十项，其中防除稗草、野荸荠等杂草的生物除草剂品种具有十分诱人的前景。
单子叶杂草马唐(Diditaria sanguinaris)是世界上公认的18种恶性杂草之一，广泛分布于世界热带和温带地区，是玉米、高粱、大豆、花生等秋熟旱作物田的恶性杂草，对棉花、烟草、麻类、甘蔗等幼苗生长危害也十分严重，同时也是蔬菜田、果园、草坪和园艺作物田的优势杂草。在中国，马唐的危害面积大约在6千万公顷左右，由其引起的作物损失占秋熟旱作物田杂草总损失的一半以上。该杂草繁殖能力强，生长速度快，生长期长，消耗地力、遮光、耐药性强，人工、机械防除比较困难。目前，化学防除虽然有效，但是，化学除草剂的长期使用引起抗性杂草的产生和严重的环境污染，导致土地退化。因此研制生物除草剂防除马唐不仅可以有效防除该杂草，而且对环境安全性高。目前，关于马唐真菌除草剂的研究，美国已申请了利用弯孢霉属(Curvulariaintermedia Boedijn)菌株(国际真菌学会收藏，保藏号为361688(MT-5)，361689(CG-L)，375263(MT-6)，375264(MT-7))生物控制马唐的专利，专利号为5,635,444和5,952,264。但该专利文献在提出其使用技术与生产方法时，仅明确对大豆、棉花比较安全，而对玉米和水稻等单子叶作物的安全性及其使用并未提及。此外，国内南京农业大学已申请了利用双曲孢霉(Nakataea Hara)菌株QZ-2000(保藏号CGMCC NO.0640)生物控制马唐的专利(ZL专利号01134002.9)，但其单菌株防效不理想，需由几个单株的孢子按比例混合后喷施才能达到较好的防除效果，这就增加了生产的难度。同时，真菌除草剂的一个重要特点就是它对环境条件的要求较为苛刻，只有当在能充分满足该菌剂对水分和温度的要求条件下，才能保证该菌株对杂草的有效侵染，才能取得良好的防除效果，而对异地生态条件不一定能适应，易具有一定的地域性，因此，为解决这一难题只有选择对寄主侵染时所要求的环境条件较宽，易能满足的寄生真菌菌株，才具有较宽广的推广应用前景。
发明内容
本发明目的是针对恶性杂草-马唐，长期使用化学除草剂所带来的弊病，和现有生物除草剂品种稀少、对异地生态条件不易适应、使用麻烦、效果不佳的缺陷，提出一种由筛选获得的真菌菌株制备而成，以防除马唐为主，兼除狗尾草、稗草、牛筋草等杂草，对农作物安全，尤其是对单子叶作物安全，应用适应性广，成本低廉，无污染的生物除草剂；本发明的另一目的是提出该生物除草剂的制备方法。
本发明致病真菌的分离、筛选与鉴定从浙江省余姚采集到罹病马唐叶片，剪取病健交界处叶片，用6％次氯酸钠溶液进行表面消毒，然后置于PSA培养基上，在25℃恒温箱中培养，一周后进行单菌分离纯化，进而，进行单菌株产孢子量、防除马唐等单子叶杂草效果试验，从中筛选出高产高效菌株Mds0404，并在PSA培养基上观察该病原菌的显微形态和形态特征，按照真菌鉴定手册进行鉴定菌株Mds0404属半知菌类(Fungi Imperfecti)，丛梗孢目(Moniliales)，丛梗孢科(Moniliadeae)，弯孢霉属(Curvularia Boedijn)；在含有蔗糖、葡萄糖和硝酸钾基质的PDA培养基中生长良好，菌落为灰褐色或灰绿色，以磷酸氢二铵和尿素为基质时菌落为黄褐色，以甘油和柠檬酸三钠为基质时菌落为无色；该菌分生孢子梗分化明显，单生或丛生，直立或弯，橄榄色或黑色，有隔膜，48-196×4-6um，单枝或偶尔在顶部分枝，细长；分生孢子连续形成，顶部产孢部分合轴式延伸，常作屈膝状，新孢子生在前一个孢子下方生出的新枝顶端；孢子大小为24-36×8-15um，梭形或椭圆形，具3个隔膜，中隔居中或基本居中，直或弯向一侧，两端细胞小而钝圆，无色或淡色，中部两个细胞大，色深分生孢子褐色，宽纺锤形，3个隔膜，中隔居中，不弯曲或微弯，两侧对称，大小为24-36um*10-18um。
该菌株已于2006年9月30日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号No.1827。
本发明目的通过以下技术方案来实现一种生物除草剂，以弯孢霉(Curvularia Boedijn)菌株Mds0404为产孢菌种，该除草剂的组分与各组分的重量百分比含量为
纯孢子80-95％化学除草剂0-18％辅助剂2-5％。
所述化学除草剂为阿特拉津、甲草胺、乙草胺、异丙甲草胺、丙草胺、异丙隆、绿麦隆、恶草灵、敌草隆、果尔或玉农乐等；所述辅助剂为吐温20、吐温80、葡聚糖、植物油、纤维素、聚醚硅油等；一种制备所述生物除草剂的方法，按以下步骤进行(1)培养基的准备菌株Mds0404可用PDA培养基、PSA培养基、麸皮培养基、玉米粉培养基、淀粉酵母培养基或Czapek培养基活化并诱导分生孢子的产生；(2)菌株Mds0404的活化培养挑取少许保存的该菌菌丝块至步骤(1)任一平皿培养基中，28℃恒温暗培养，活化菌株；(3)菌株种子液的培养挑取少许步骤(2)培养的菌块，接入盛有步骤(1)任一培养液(不含琼脂)的三角瓶中，28℃，150rpm，振荡培养3-5天至产生丰富菌丝球，待用；(4)菌种孢子的生产培养与收集可以采用固体或液体-固体联合培养的方法，在无菌条件下，将Mds0404菌丝块或液体培养的菌丝球接种于装有半熟麦粒的茄子瓶中，置于25-28℃黑暗培养6-8天，待菌丝长满固体培养基后，将麦粒捣散，平铺于平板上，控制至40-65％的湿度，12小时间隔黑光灯光照2天，即可得孢子，用孢子振筛机或孢子收集器收集孢子，备用；(5)将按配方秤取的纯孢子、化学除草剂和辅助剂，混合成生物除草剂，分装，密封，即成产品。
上述弯孢霉菌株Mds0404除草剂用于防除杂草的方法为
可用浓度为3-50g/L的弯孢霉菌株Mds0404的纯分生孢子水悬浮液对杂草进行叶面喷施或种子处理；或将该菌的分生孢子加以各类辅助剂配成水悬浮液使用；或分生孢子与辅助剂的混合物与5-20％常规用量的化学除草剂混合水悬浮液使用；或者与其他杂草上分离得到的致病性菌株联合使用，其配合使用方法都是本领域技术人员所掌握的常规技术。
本发明与现有技术相比，其有益效果如下1、菌株Mds0404对小麦、大豆、棉花、豇豆、向日葵、玉米、花生、水稻等作物的小苗都安全，对狗尾草、稗草、牛筋草等杂草有部分感染，而对马唐是是严重感染，一周后的控制效果在85％以上，该菌的寄主范围相对专一，对农业生产是安全的(见表2)；故采用本发明马唐弯孢霉菌剂不仅可用于防除大豆、棉花、花生等双子叶作物田块杂草，也可用于防除水稻、玉米和麦子等单子叶作物田块杂草，这明显优于几乎不能在单子叶作物与单子叶杂草间进行选择的常规防除单子叶杂草的化学除草剂，因此，也就优于现有技术中的美国专利。
2、与相关辅助剂配合使用，该菌剂对目标杂草马唐的控制效果可以达到85％-100％，特别是3叶龄以下的植株。
3、本发明筛选获得的菌株Mds0404，作为制备菌剂的生产用种，其对培养条件适应性广，在10-40℃，pH5-10均可生长，培养基原料易得，成本低廉，利用常用的农业基础产品即可进行大批量生产，孢子产量高(2.0×107个孢子/克干重麦粒)；而作为防除杂草的感病菌剂，其在田间致病条件较宽，10-40℃孢子均可萌发，失活温度为55℃，容易感染防除对象，研究显示该菌有较大的潜力开发成商品化生物除草剂，可用于大多数作物田控制杂草马唐。
4、本发明生物除草剂是利用活的生物本身，出自于所使用的环境，其降解产物均为可循环有机物，不会因使用导致污染，因此对环境安全，可用于生产绿色或有机农产品。
因此，本发明利用弯孢霉菌株Mds0404发展生物除草剂控制马唐，该菌株对主要农作物安全性高，不感染禾本科作物和阔叶植物，应用范围广，因而该生物除草剂具有极为显著的经济和社会效益。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明，但这并不对本发明构成任何意义上的限定。
实施例1(防除马唐高效菌株Mds0404的筛选)从自然发生于浙江余姚地区的野外马唐病害植株上，采集马唐的病叶，用PDA培养基进行病原真菌的分离培养，从中分离出数种真菌菌株，并对它们的致病性进行了如下试验；在显微镜下挑取各菌株的单孢子，分别接种在PDA培养基上，于黑暗、28℃下培养，观察病原真菌纯培养的菌落特征；另取直径6mm的各菌落圆片接种在PDA平板中央，分别于7天后测量各菌落直径；将各菌株配制成浓度为1×106个/ml的孢子悬浮液喷施2叶1心马唐植株上，处理4天后，观察各菌株的致病特性(见表1)，从中选择出发病死亡率最强的弯孢霉属菌株Mds0404，保存；马唐罹病植株叶片病斑初为圆点状，后扩大为大小不等的扁椭圆形或梭形病斑，病斑中央为褐色，周围为紫色或紫红色，外围有黄色晕圈，两端有坏死线，严重时多个病斑联合，致使整个叶片呈焦枯状皱缩卷曲；受该菌株侵染的马唐病斑中央可见黑色子实体，做病叶镜检可见少量与培养条件相同的分生孢子。
表1马唐病原真菌菌落特征及其对马唐致病率的比较
实施例2(菌株Mds0404寄主范围的测定)经寄主范围测定明确，菌株Mds0404对棉花、向日葵、大豆、豇豆、花生、玉米、小麦及水稻等作物安全；稗草、牛筋草及狗尾草有感染，而马唐为严重感染(见表2)，一周后的控制效果在85％以上。
表2马唐弯孢霉属菌株Mds0404的寄主范围测定
注NS表示没反应；LS表示有感染；HS表示严重感染实施例3(本发明一种生物除草剂及其制备方法1)按配方称取菌株Mds0404纯孢子83克、阿特拉津15克、吐温2克，混合成生物除草剂100克。该剂的制备方法按以下步骤进行(1)培养基的准备菌株Mds0404可用以下任一种培养基活化并诱导分生孢子的产生
PDA培养基马铃薯150g，葡萄糖10g，琼脂18g，水1L；PSA培养基马铃薯150g，蔗糖10g，琼脂18g，水1L；麸皮培养基麸皮50g，琼脂18g，水1L；玉米粉培养基玉米粉50g，琼脂18g，水1L；淀粉酵母培养基淀粉10g，酵母粉2g，琼脂18g，水1L；Czapek培养基KNO32g；K2HPO41g；KCl 0.5g；MgSO4.7H2O 0.5g；FeSO40.01g；蔗糖30g；琼脂18g；水1L。
(2)菌株Mds0404的活化培养挑取少许保存的该菌菌丝块至步骤(1)PDA平皿培养基中，28℃恒温暗培养，活化菌株；(3)菌株种子液的培养挑取少许步骤(2)培养的菌块，接入盛有步骤(1)PD培养液(PDA培养基不加琼脂即成)的三角瓶中，28℃，150rpm，振荡培养3-5天至菌液产生丰富菌丝球，待用；(4)菌种孢子的生产培养与收集可以采用固体或液体-固体联合培养的方法；在无菌条件下，将Mds0404菌丝块或液体培养的菌丝球接种于装有半熟麦粒的茄子瓶中，置于25-28℃黑暗培养6-8天，待菌丝长满固体培养基后，将麦粒捣散，平铺于平板上，控制至40％-65％的湿度，12小时间隔黑光灯(20W，垂直光照距离为25cm)光照2天，即可得孢子，干燥后用孢子振筛机或孢子收集器收集孢子，备用；(5)将按配方称取的纯孢子、阿特拉津、吐温，混合成生物除草剂，分装，密封，即成产品。
实施例4(本发明生物除草剂及其制备方法2)按配方称取菌株Mds0404纯孢子95克、植物油5克，混合成生物除草剂100克；该剂的制备方法同于实施例3。
实施例5(本发明生物除草剂及其制备方法3)按配方称取菌株Mds0404纯孢子90克、甲草胺7克、聚醚硅油3克，混合成生物除草剂100克；该剂的制备方法同于实施例3。
实施例6(纯孢子防除马唐草效果试验)将菌株Mds0404在PDA培养基，28℃，黑暗培养8天后，刷除表面菌丝，用黑光灯12小时间隔照射1天后，用无菌水冲洗通过纱布过滤，收集滤液并镜检孢子浓度(1×106个/ml)，用手持喷雾器喷施滤液，接种到1叶1心至3叶1心期的马唐上，保湿12小时，处理5天后，对该草的控制效果达到90％以上。这种孢子接种在马唐上的致病症状为叶片最初出现紫红色病斑，圆点状，随后扩大为近圆形或梭形褐色病斑，数量多时连接成片，最后叶大片或整片干枯。幼小植株叶片上为透明的圆斑，严重时整个植株很快死亡。病叶上可见黑色子实体。经观察，病叶表面的孢子与所喷施的弯孢霉属Mds0404孢子一样。以上实验条件下的发病症状与自然病症相似。
实施例7(孢子+辅助剂除马唐草效果试验)按实施例4方法，先配制出孢子悬浮液后，再添加辅助剂吐温、植物油、纤维素、淀粉或聚醚硅油，处理马唐，结果明显提高杀草速度和效率。(见表3)。
表3辅助剂对Mds0404接种效果的影响
每列中数据跟不同小写字母表示有显著差异(P≤0.05)。
实施例8(孢子+辅助剂+5-20％常规用量的化学除草剂除马唐草效果试验)按实施例3或5方法，先配制出添加有辅助剂的孢子悬浮液，再添加常规用量5-20％的阿特拉津、甲草胺、乙草胺、异丙甲草胺、丙草胺、异丙隆、绿麦隆、恶草灵、敌草隆、果尔或玉农乐，均匀喷施在2.5-3.5叶龄期的马唐上，分别保湿12小时和不保湿两组处理；处理后4天，保湿一组的马唐被控制100％，未保湿一组的马唐被控制70-90％(见表4)。
表4阿特拉津与Mds0404混配接种效果
实施例9(纯孢子防除马唐草种子效果试验)设置铺有滤纸的培养皿高压灭菌后，每皿中放50粒马唐种子，将按实施例6方法生产出的孢子浓度达(1×106个/ml)的孢子悬浮液施于培养皿中，每皿2毫升，重复5次；另设无菌水处理皿中马唐种子作为对照；4天后，对照马唐萌发及长势均正常，而菌液处理的马唐种子刚萌发即被侵染全部死亡。
权利要求
1.弯孢霉(Curvularia Boedijn)Mds0404菌株，其菌株保藏号为CGMCCNO.1827。
2.一种生物除草剂，其特征在于该除草剂以弯孢霉(Curvularia Boedijn)Mds0404菌株CGMCC NO.1827为菌种，其组分与各组分的重量百分比含量为纯孢子80-95％化学除草剂0-18％辅助剂2-5％。
3.根据权利要求2所述的生物除草剂，其特征在于所述的化学除草剂为阿特拉津、甲草胺、乙草胺、异丙甲草胺、丙草胺、异丙隆、绿麦隆、恶草灵、敌草隆、果尔或玉农乐。
4.根据权利要求2所述的生物除草剂，其特征在于所述的辅助剂为吐温20、吐温80、葡聚糖、植物油、纤维素或聚醚硅油。
5.一种制备权利要求2所述生物除草剂的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行(1)培养基的准备菌株Mds0404可用PDA培养基、PSA培养基、麸皮培养基、玉米粉培养基、淀粉酵母培养基或Czapek培养基活化并诱导分生孢子的产生；(2)菌株Mds0404的活化培养挑取少许保存的该菌菌丝块至步骤(1)任一平皿培养基中，28℃恒温暗培养，活化菌株；(3)菌株种子液的培养挑取少许步骤(2)培养的菌块，接入盛有步骤(1)任一不含琼脂培养液的三角瓶中，28℃，150rpm，振荡培养3-5天至产生丰富菌丝球，待用；(4)菌种孢子的生产培养与收集采用固体或液体—固体联合培养的方法，在无菌条件下，将Mds0404菌丝块或液体培养的菌丝球接种于装有半熟麦粒的茄子瓶中，置于25-28℃黑暗培养6-8天，待菌丝长满固体培养基后，将麦粒捣散，平铺于平板上，控制至40-65％的湿度，12小时间隔黑光灯光照2天，即可得孢子，用孢子振筛机或孢子收集器收集孢子，备用；(5)将按配方秤取的纯孢子、化学除草剂和辅助剂，混合成生物除草剂，分装，密封，即成产品。
全文摘要
本发明公开了一种生物除草剂及其制备方法，属于利用微生物防除农田杂草的技术领域。该除草剂以弯孢霉(Curvularia Boedijn)Mds0404菌株CGMCCNO.1827为菌种，其组分与各组分的重量百分比含量为纯孢子80－95％，化学除草剂0－18％，辅助剂2－5％；经培养基的准备，菌株Mds0404的活化与种子液的培养，菌种孢子的生产培养与收集及各组分的混合等步骤制备而成。该剂以防除马唐为主，兼除狗尾草、稗草、牛筋草等杂草，具有对农作物安全，尤其是对单子叶作物安全，应用适应性广，成本低廉，无污染等特点。可在马唐等杂草危害地区推广应用。
文档编号A01P13/00GK1994092SQ20061015547
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月26日 优先权日2006年12月26日
发明者杜新法, 邱海萍, 柴荣耀, 毛雪琴, 张震, 王艳丽, 王教瑜, 孙国昌 申请人:浙江省农业科学院