专利名称：防治烟草花叶病毒病的方法
技术领域：
本发明属于植物保护，尤其涉及一种利用双链RNA干扰技术防治烟草花叶病毒病的方法。
技术背景烟草花叶病毒引起的花叶病是烟草、番茄等作物上的花叶病是十分重要的 病害，世界各地发生普通，损失严重。如在烟草上自苗期至大田期可连续发生， 幼苗被侵染后，新叶的叶脉颜色变浅，呈半透明的"明脉症"，而后形成黄绿相间 的花叶症；苗期侵染的植株发育缓慢，几乎没有经济价值。大田期植株发病， 除显示明脉、花叶症状以外，病叶上会形成疱斑，厚薄不匀；叶形也会出现各 种畸形，如叶缘反巻、皱縮扭曲.叶缘缺刻或成带状。病毒致病功能被认为与 衣壳蛋白进入叶绿体有关，衣壳蛋白上个别氨基酸的改变导致症状的较大变异。 烟草花叶病毒寄主范围广，属于世界性分布；自然传播不需要介体生物，靠植 株间的接触(或有时种子)传播；对外界环境的抵抗力强。烟草花叶病毒形态为 直杆状，直径18nm，长300nm;粒体分子量为40xl06u。 TMV是研究相当深 入的植物病毒典型代表，其体外存活期一般在儿个月以上。在干燥的叶片中可 以存活50多年；钝化温度9(TC左右。TMV主要靠病汁液接触传播，在农事操作中沾染了病株汁液的手或工具通过接触烟苗的微伤口侵入。由于病毒的抗逆 力很强，混有病株残体的肥料、种子、土壤和带病的其它寄主植物及野生植物， 甚至烤过的烟叶、烟末都可以成为病害的初侵染来源。这些初侵染源或移入大 田的病苗，通过各种接触媒介引起再侵染，使病害在田间扩展蔓延。目前，烟草花叶病毒的防治主要利用化学农药和转基因烟草方法。化学农 药的大量使用使病毒的抗药性日益明显，人们不得不加大药量，这是一种恶性 循环，结果造成了高量的农药残留。残留的农药不但会危害烟草使用人员的健 康，而且直接影响了我国烟草的出口创汇。同样，虽然转基因技术可以高效的 控制病毒病的发生和发展，其生物安全性却引起了国内外专家和政府的高度重 视，转入的基因及其附带成分具有插入人类基因组的可能性，因此转基因产品 在大多数国家都有法律限制。根据这些情况，人们必须找到一种更为安全和有 效的抵御植物病毒病的方法。
RNA干扰(RNA interference ,RNAi)是一种古老而保守的生物现象，由21 23个核苷酸双链siRNA介导产生的转录后基因沉默可以显著控制病毒的复制 增殖，达到防治烟草病毒病的目的。siRNA由较大的双链RNA经Dicer酶的降 解产生,然后再以单链siRNA为引物以mRNA为模板合成长dsRNA ,再由Dicer 酶切割形成siRNA，以此反复进行实现RNAi的放大效应。多种蛋白酶参与RNAi 过程，包括Dicer酶、RDRP、 RDE-1、 Argonaute家族、螺旋酶和核酸酶等。其 中Dicer酶非常重要，一些参与siRNA的形成,而另一些则参与RNA诱导的沉默 复合体的形成。Dicer酶有l个螺旋结构域、2个RNA酶III结构域、2个dsRNA 结合域以及1个PZA结构域，进化上很保守,以二聚体的形式起作用，有类似 RNasein酶的活性，被认为是RNaseIII家族成员之一。在植物、线虫、果蝇和哺 乳动物体内均存在Dicer酶的同源体,这些蛋白结构相似,而且具有相似的生化功 能,提示RNA干扰具有进化保守的相似的生化功能。目前，虽然已有多家单位 正在研究如何利用siRNA防治植物病毒病，但是因该RNA化学合成方法的成本 很高，而且将RNA注射进大量的植物体内很难实现，所以其成果难以产业化。那么，如果人们能够利用发酵生产的办法大量制造siRNA,而且不必将 siRNA注射进烟草植株内部就可以控制烟草花叶病毒的复制和增殖，这将是-一 种十分理想的方法。发明内容本发明的目的是提供一种利用双链RNA干扰技术防治烟草花叶病毒病的方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案 一种防治烟草花叶病毒病的 方法，包括以下步骤提取录烟草花叶病毒的RNA基因组；利用烟草花叶病毒的RNA基因组，反转录得到烟草花叶病毒运动蛋白的cDNA;利用PCR技术分 离烟草花叶病毒运动蛋白cDNA上150-800bp内21-23bp长的片断；将上述片段 克隆入可表达RNA的质粒载体；使克隆的片段在缺失RNA酶的大肠杆菌内表 达成RNA;粉碎细胞，并将其制成浓度为2-20ng/ml悬浮溶液；将悬浮液稀释 1000倍后喷施于烟草的叶面上。在烟草上的喷施量为10-100 ng/亩。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果本方法生产简便、成本低 廉、对人畜和高等动物无害，适于在烟草上大量施用，具有广阔的产业化前景。 制成的悬浮剂克服了可湿性粉剂和乳油剂的缺陷，助剂易于分散，田间施用更 方便，没有残留和环境污染。
具体实施方式
实施例l:利用酚氯仿法提取烟草花叶病毒的RNA基因组；以烟草花叶病毒的基因组RNA为模板，反转录得到烟草花叶病毒运动蛋白的cDNA;利用PCR 技术分离烟草花叶病毒运动蛋白cDNA上150-800bp范围内21-23bp长的片断； 将得到的上述片段克隆入可表达RNA的质粒载体；使克隆的片段在缺失RNA 酶的大肠杆菌(￡.co/f)内表达成对应的RNA;粉碎表达有目的RNA的细胞， 并将其制成悬浮溶液；该溶液中RNA的含量为2-20 n g/ml，光保护剂芳香族氨 基酸色氨酸占溶液体积的0.01-0.1%，分散剂1-2%,甘油2-5%，无菌水 96.99-92.9%。分散剂为L602或LH656。配制时，依次在粉碎的细胞中加入甘油、 芳香族氨基酸色氨酸、分散剂和灭菌水，搅拌均匀得到悬浮剂，然后分装即可。 试剂要避光保存在棕色试剂瓶里，若长时间存放需保存在4摄氏度以下。田间 施用时，将悬浮液稀释1000倍后，在早晨9点前或下午5点后喷施于烟草的叶 面上，在烟草上的喷施量为10-100 ng/亩。实施例2:在本实施例中，悬浮溶液的成份为RNA的含量为5ng/ml，光 保护剂芳香族氨基酸色氨酸0.05%， L602分散剂1.5%，甘油3.5%，无菌水 94.95%。其它与实施例l相同。实施例3:在本实施例中，悬浮溶液的成份为RNA的含量为15ng/ml, 光保护剂芳香族氨基酸色氨酸0.08%， LH656分散剂1.8%，甘油4%，无菌水 94.72%。其它与实施例l相同。实施例4:在本实施例中，悬浮溶液的成份为RNA的含量为20ng/ml， 光保护剂芳香族氨基酸色氨酸0.03%， LH656分散剂1.8%，甘油4.5%，无菌水 94.95%。其它与实施例1相同。实施例5:在本实施例中，悬浮溶液的成份为RNA的含量为2ng/ml，光 保护剂芳香族氨基酸色氨酸0.07%, L602分散剂1.2%，甘油2.5%，无菌水 94.72%。其它与实施例l相同。实施例6:在本实施例中，悬浮溶液的成份为RNA的含量为3ng/ml，光 保护剂芳香族氨基酸色氨酸0.01%， LH656分散剂1%，甘油2%，无菌水96.99%。 其它与实施例l相同。实施例7:在本实施例中，悬浮溶液的成份为:RNA的含量为12ng/ml， 光保护剂芳香族氨基酸色氨酸0.1%， L602分散剂2。/。，甘油5%，无菌水92.9%。
其它与实施例l相同。实施例8:在本实施例中，悬浮溶液的成份为RNA的含量为18ng/ml， 光保护剂芳香族氨基酸色氨酸0.02%， L602分散剂1.4%，甘油4%,无菌水 94.95%。其它与实施例l相同。实施例9:在本实施例中，悬浮溶液的成份为RNA的含量为8ng/ml，光 保护剂芳香族氨基酸色氨酸0.02%，L602分散剂1.7%，甘油3%，无菌水94.72%。 其它与实施例l相同。
权利要求
1. 一种防治烟草花叶病毒病的方法，其特征在于包括以下步骤提取录烟草花叶病毒的RNA基因组；利用烟草花叶病毒的RNA基因组，反转录得到烟草花叶病毒运动蛋白的cDNA；利用PCR技术分离烟草花叶病毒运动蛋白cDNA上150-800bp内21-23bp长的片断；将上述片段克隆入可表达RNA的质粒载体；使克隆的片段在缺失RNA酶的大肠杆菌内表达成RNA；粉碎细胞，并将其制成浓度为2-20ng/ml悬浮溶液；将悬浮液稀释1000倍后喷施于烟草的叶面上。
2、 如权利要求1所述的防治烟草花叶病毒病的方法，其特征在于在烟草 上的喷施量为10-100 ng/亩。
全文摘要
本发明公开了一种防治烟草花叶病毒病的方法，包括以下步骤提取录烟草花叶病毒的RNA基因组；利用烟草花叶病毒的RNA基因组，反转录得到烟草花叶病毒运动蛋白的cDNA；利用PCR技术分离烟草花叶病毒运动蛋白cDNA上150-800bp内21-23bp长的片断；将上述片段克隆入可表达RNA的质粒载体；使克隆的片段在缺失RNA酶的大肠杆菌内表达成RNA；粉碎细胞，并将其制成浓度为2-20ng/ml悬浮溶液；将悬浮液稀释1000倍后喷施于烟草的叶面上。本方法生产简便、成本低廉、对人畜和高等动物无害，适于在烟草上大量施用。制成的悬浮剂克服了可湿性粉剂和乳油剂的缺陷，助剂易于分散，田间施用更方便，没有残留和环境污染。
文档编号A01N63/00GK101209055SQ20061016000
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月29日 优先权日2006年12月29日
发明者张小霞, 戚元成, 梁振普, 邱立友, 高玉千 申请人:河南农业大学