专利名称：：变异碱性纤维素酶的制作方法
技术领域：
：本发明涉及可作为衣料用洗剂等的配料的变异碱性纤维素酶。
背景技术：
：使用衣料用洗剂时，洗涤液中的pH基本上在pH1011的碱性区域。因此，要求用作衣料用洗剂配料的酶适应碱性环境，且在碱性环境下具有稳定性。目前，就可用作衣料用洗剂等的配料的碱性纤维素酶而言，己知有，源于属于芽孢杆菌属(Bac/〃w)的万ac/〃"s取KSM-635的碱性纤维素酶(揭示于日本特公昭60-23158号公报，特公平6-030578号公报，美国专利第4945053号说明书等)、源于5a"7/w^.KSM-64的碱性纤维素酶(Shikata&a/.々".c.編.CTzew.，54，91-96，1990;Sumitomo"a/.，5/o"/.所o&c/mo/.历oc/ze附.，56，872-877，1992)、由嗜温嗜碱菌Sac!7/w^.KSM-S237(FERM-BP7875:于平成9年2月6日保藏于日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)的独立行政法人产业技术综合研究所的专利生物保藏中心)生成的耐热性碱性纤维素酶(日本特开平10-313859号公报)、源于Sa"7/wsKSM-N257的碱性纤维素酶(日本特愿平12-281378)、源于万a"7/ws取KSM-N131的碱性纤维素酶(日本特愿平12-373859)等，以羧甲基纤维素(CMC)为基质时，它们的最优反应pH值均在9附近，该pH值并不是最适于洗涤的。而就葡糖苷酶而言，改变其最优反应pH值的研究有构筑源于嗜碱性芽孢杆菌(Bacz7/w)的碱性纤维素酶(NK1)和源于枯草杆菌(^^7/ww^7&)的中性纤维素酶(BSC)的嵌合蛋白，改变其pH值特性的实例，它使最优pH值由碱性移向中性(ParkWa/.,￡"g.，6，921-926,1993)。而最近，有报告指出源于木霉(7Hc/20^rw"^Me/)的纤维二糖水解酶(Cel7A)，通过取代其活性中心附近的氨基酸，比野生型更能提高最优pH值(BekerWa/,说'oc/^w./，356,19-31,2001)，但因野生型酶的最优pH值在酸性区域，其变异体的最优pH值最多不过提高了1个pH值单位。因此，实际情况是，几乎还未被报知有使葡糖苷酶的最优反应pH值移向碱性侧的实例。
发明内容而本发明的目的在于，通过改变碱性纤维素酶的遗传基因，提供具有最适于洗剂用酶的pH值的变异碱性纤维素酶。本发明人等预判了序列号1所示的碱性纤维素酶(Egl-237)的立体构造，特别是以其活性域为中心的立体构造，利用位点特异性诱变法，导入各种变异，寻求目标酶，结果发现使形成环状构造的局部特定区域的氨基酸残基缺失，并在该部位插入新肽，就能提高CMC分解活性的最优反应pH值。艮P，本发明涉及序列号1所示氨基酸序列或与其具有90%以上同源性的纤维素酶，并提供使选自序列号1的343位377位或相当于该位置的氨基酸残基中的一个以上缺失，将氨基酸残基数215的肽插入该缺失部分的变异碱性纤维素酶以及对其进行编码的遗传基因。本发明还提供含该遗传基因的媒介物，以及含该媒介物的转化体。图lalc为与序列号1所示氨基酸序列具有90%以上同源性的纤维素酶的氨基酸序列排列图。图2为丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸变异体的最优反应pH值示意图。图3为丙氨酸-组氨酸-丙氨酸变异体的最优反应pH值示意图。图4为丙氨酸-精氨酸-丙氨酸变异体的最优反应pH值示意图。具体实施例方式本发明的变异碱性纤维素酶是以序列号1所示氨基酸序列或与其具有90%以上同源性的纤维素酶为变异对象的纤维素酶(下亦称为"母本碱性纤维素酶(parentalkalinecellulase)")，使选自该序列号1的343位377位或相当于该位置的氨基酸残基中的一个以上缺失，将氨基酸残基数215的肽插入到该缺失部分而形成的，母本碱性纤维素酶既可以是野生型的变异体，也可以是实施了人工变异的变异体。在本发明中，与母本碱性纤维素酶的序列号1所示的氨基酸序列有90%以上同源性的纤维素酶，更优选为显示出与该氨基酸序列有95%以上同源性的纤维素酶，进一步优选为显示出有98%以上同源性的纤维素酶，它们既可以是野生型，也可以是野生型的变异体。另外，氨基酸序列的同源性可使用GENETYX-WIN的最大匹配法或同源性检索等程序(SoftwareDevel叩mentCo.)进行计算。另外，与该以序列号1表示的氨基酸序列具有90%以上同源性的纤维素酶，在使用同源模拟法用3D-1D、XPLORE及PROCHECK程序预测纤维素酶分子构造后的情况下，优选为与序列号1中第42位的亮氨酸第404号的缬氨酸的活性域具有70%以上、更优选为80%以上、进一步优选为90%以上、更进一步优选为95%以上、特别优选为98%以上的同源性，且优选为相当于序列号1中第343位的天冬氨酸第377位的亮氨酸的氨基酸序列在纤维素酶分子内具有环状构造。且，此时的氨基酸序列的同源性能以例如Lipman-Pearson法""'e"ce,227,1435，1985)等为基准计算。而且，母本碱性纤维素酶优选具有以利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法或凝胶过滤法得到的的分子量为86000±2000的羧甲基纤维素为基质时的最优反应pH值在7.59.0之间，最优反应温度在4050'C的范围内等性质，且母本碱性纤维素酶优选为能像消化羧甲基纤维素一样高效消化地衣多糖，并优选为，即使在pH9、5(TC的条件下处理IO分钟也具有充分的稳定性。特别优选为具有如下性质的母本碱性纤维素酶，即，分子量为86000±2000(利用SDS-PAGE法或使用SephacrylS200柱的凝胶过滤法测得)；最优反应pH值为8.69.0;最优反应温度为50°C;能像消化羧甲基纤维素一样高效消化地衣多糖；在pH9的5mM氯化铞的存在下，进行5(TC、IO分钟的处理的情况下，具有95%以上(以30。C、IO分钟处理时的残存活性为100%)的残存活性。综上，本发明的母本碱性纤维素酶，除了以序列号1表示的碱性纤维素酶以外，如上所述，优选为还有与序列号1的特定活性域具有较高的同源性、且具有序列号1的特定氨基酸序列在纤维素酶分子内有环状构造的氨基酸序列上的特征和/或上述酶类学性质，特别是具有该氨基酸序列上的特征且具有酶类学性质，显示出与序列号1所示氨基酸序列90%以上、优选为95%以上、更优选为98%以上的同源性。具体可以举出"具有以序列号1表示的氨基酸序列的碱性纤维素酶"的Egl-237(源于5""'〃"s取KSM-S237(FERMBP-7875)、Hakamada等，所cwd.所o/ec/wo/.说oc/je肌，64，2281-2289，2000)、源于i5ac/〃"ss/.1139菌株的碱性纤维素酶(Egl-1139，Fukumori等，M'cra6/oU32,2329-2335，同源性91.4%)、源于Ba"7/w";.KSM-64菌株的碱性纤维素酶(Egl-64,Sumitomo等，S/o^c/mo/.B/oc/ze肌，56,872-877，1992，同源性91.9%)、源于Bfl"7/w平KSM-N131菌株的纤维素酶(Egl-N131b，日本特愿2000-47237号，同源性95.0%)等。本发明的变异碱性纤维素酶是在上述母本碱性纤维素酶中，使选自序列号1的343位377位或相当于该位置的氨基酸残基缺失一个以上，将氨基酸残基数215的肽插入该缺失部分的纤维素酶。缺失的氨基酸残基只要是在序列号1的343位377位的任意连续或非连续的135个氨基酸残基即可，优选为在350位377位中的、更优选为在355位365位中的、进一步优选为357位362位中的氨基酸残基。特别优选为343位377位中的任意127残基、215残基或310残基，355位377位中的任意18残基、36残基或所有氨基酸残基，357位362位中的任意2残基、25残基或所有氨基酸残基。发明人推定该序列号1的343位377位的氨基酸区域为，根据利用同源模拟的立体构造解析(OzawaW尸raWw￡"g.，14,501-504，2001)，是存在于较大偏离于Egl-237的活性中心的位置，自由度高且与纤维素酶构造的维持密切相关的形成环状构造的局部区域。而就辨识"相当于序列号1的343位377位的位置的氨基酸残基"的方法而言，可通过例如使用Lipman-Pearson法等公知算法比较氨基酸序列，赋予存在于各碱性纤维素酶的氨基酸序列中的保存氨基酸残基最大同源性进行。通过用这样的方法排列纤维素酶的氨基酸序列，就可在不受氨基酸序列中的插入、缺失影响地对相同氨基酸残基在各纤维素中的序列中的位置进行定位(图lalc)。发明人推测，假设存在于三维构造中的相同位置定义为相同位置，则具有与对象纤维素酶的特性相关的类似效果。例如，如表示上述Egl-1139、Egl-64、Egl-N131b的相当于以序列号1表示的具有氨基酸序列的纤维素酶(Egl-237)的357位362位的位置，则如下表l所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>应插入该缺失部位的肽，可由20种必需氨基酸的任一种构成，优选含有丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸，特别优选为含有丙氨酸、丙氨酸和组氨酸、丙氨酸和精氨酸。而构成肽的氨基酸残基的数目优选为215，更优选为210，进一步优选为26，特别优选为3。这类肽的优选例，可以举出例如天冬氨酸-苏氨酸-丙氨酸-缬氨酸-甘氨酸-异亮氨酸、丙氨酸-丝氨酸-蛋氨酸-亮氨酸-苯基丙氨酸-谷氨酸、半胱氨酸-亮氨酸-甘氨酸-组氨酸-丝氨酸、酪氨酸-谷氨酸-赖氨酸-丙氨酸-丙氨酸、天冬氨酸-蛋氨酸-异亮氨酸-缬氨酸、异亮氨酸-苏氨酸-脯氨酸-赖氨酸、甘氨酸-亮氨酸-半胱氨酸、丝氨酸-缬氨酸-苯基丙氨酸，其中，尤其优选为两端有丙氨酸残基的36残基的肽，更优选为丙氨酸-任一氨基酸-丙氨酸，特别优选为丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸、丙氨酸-组氨酸-丙氨酸或丙氨酸-精氨酸-丙氨酸。另外，本发明的变异碱性纤维素酶只要不丧失碱性纤维素酶活性和可变异性，则上述变异还包括氨基酸序列中1多个氨基酸残基缺失、取代或加成。本发明的变异碱性纤维素酶还可例如利用下述方法向母本碱性纤维素酶导入目标变异。艮P，可对培养母本碱性纤维素酶而得的培养液进行离心分离，从中分离出菌体，调制含有来自该菌体的碱性纤维素酶遗传基因的染色体DNA(例如，按照Marmar法UMo/.5/o/.，3,208-212,1961)或斋藤和三浦的方法说'op/2".Jcto，72，619-629，1963))，使用鸟枪克隆法或PCR法就可克隆对母本碱性纤维素酶(例如具有以序列号l表示的氨基酸序列的碱性纤维素酶)进行编码的遗传基因(序列号2)。向克隆的遗传基因导入变异，使用含变异遗传基因的质体，对适当的宿主菌进行转化，培养转化株，从而由该培养物得到本发明的变异碱性纤维素酶。将变异导入编码亲性纤维素酶的方法，可使用位点特异性诱变法等。例如，可使用日本Takara公司的"位点直接突变系统突变快速套件(Site-DirectedMutagenesisSystemMutan-SuperExpressKmkit)"等。导入了变异的碱性纤维素酶遗传基因可嵌入适当的媒介物。可用于本发明的媒介物，可使用任意物质，只要可保持在宿主菌内的复制，能表达碱性纤维素酶遗传基因，可稳定保持嵌入的该遗传基因即可。例如，以芽孢杆菌属细菌为宿主时，可举出pUBllO、pHY300PLK等，以大肠菌为宿主时，可举出pUC18、pUC19、pBR322或pHY300PLK等。为使采用如此得到的重组媒介物进行宿主菌的转化，可使用原生质法、感受态细胞法和电穿孔法。对宿主菌无特别限制，可以举出芽孢杆菌属(枯草杆菌)等的革兰氏阳性菌，大肠杆菌(&Wen'c/n'aco//)等革兰氏阴性菌，链霉菌属(Sfreptomw"，放线菌)、酵母菌属(&cc/7aram_ycw，酵母)、曲霉菌属(A/^g///w，霉菌)等菌属的真菌。所得转化体可在使用能用于孵化的包括碳源、氮源、金属盐、维生素等的培养基的情况下，在适当条件下培养。利用通常方法，从如此得到的培养液中分离出酶，并精制，通过冻结干燥、喷雾干燥、结晶，即可得到所需酶形态。如此得到的变异碱性纤维素酶的最优反应pH值高于母本碱性纤维素酶，优选为移向pH9.09.5、更优选为pH9.510.0的高碱性侧。并优选为除变异碱性纤维素酶的最优反应pH值之外，保持着上述母本碱性纤维素酶其它性质。实施例实施例lEgl-237环状区域的改变以结晶构造己被解析的CelK的解析数据为基础，通过同源模拟构筑Egl-237的分子模版，模版构造的精密化通过3D-1D、XPLORE和PROCHECK程序进行。然后，根据所得信息，使环状构造内的部分氨基酸(357号甘氨酸362号苏氨酸)缺失，同时导入新丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸、丙氨酸-组氨酸-丙氨酸及丙氨酸-精氨酸-丙氨酸。该环状区域的变异，分别使用变异导入引物1、2、3(序列号3、4、5)，反义引物使用变异导入引物4(序列号6)。在丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸的变异导入中，将在pHY300PLK中重组的Egl-237遗传基因用作模版DNA。而对于丙氨酸-组氨酸-丙氨酸及丙氨酸-精氨酸-丙氨酸的变异导入，将在pHY300PLK中重组的丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸变异体质体用作模版DNA。具体而言，将模版DNA质体0.5pL(10ng)、变异导入用引物20pL(lpM)、反义引物20pL(lpM)、10倍浓度的PCR用缓冲液10pL、10mM脱氧核苷三磷酸(dNTP)混合液8|aL、/>o6eWDNA聚合酶0.5|xL(2.5单位，Takara)和去离子水39.5|iL混合后，用"geneampPCRsystem9700"(Amersham-Pharmacia)实施PCR。反应条件为，经94。C的两分钟热改性后，在94°C-1分钟、60°C-1分钟、72°C-1.5分钟(30次循环)和72°C-3分钟的条件下进行。用"GfXPC7DA^aw/Ge/尸wnyc加》w尺"(Amersham-Pharmacia)"精制所得PCR产物(43.5|iL)，然后添加5.5pL的IO倍浓度的磷酸化用缓冲液和l^L(IO单位)多核苷酸激酶，在37。C下进行1小时磷酸化反应后，进行精制。将模版DNA质体2nL(20ng)、10倍浓度的PCR用缓冲液10pL、10mMdNTP混合液8pL、/yo&wDNA聚合酶lpL(5单位)和去离子水54pL与磷酸化的PCR产物25pL混合，然后进行PCR。反应条件为，经94"C的2分钟热改性后，在94'C-1分钟、58"C-1分钟、72'C-6分钟(30次循环)和72°C-12分钟的条件下进行。精制所得PCR产物后(43L)，添加5.5pL的10倍浓度的磷酸化用缓冲液和lpL(10单位)的多核苷酸激酶，在37'C下进行1小时磷酸化反应。使利用乙醇沉淀而回收的10pL的DNA溶液，在使用//g加'o"始v^2(Takara)、16"C的条件下，进行18小时连接反应，自封闭成环后，再利用乙醇沉淀回收DNA混合液。实施例2转化法使用实施例1所得DNA混合液5nL，导入枯草杆菌ISW1214菌株，得到转化体(ChangandCohen,Mo/.Ge".Ge"[，168,111，1979)。将由该方法得到的原生质体涂沫在含四环素(15pg/mL，Sigma)的DM3再生琼脂培养基(0.8%(w/v)，琼脂，和光纯药；0.3M琥珀酸二钠六水合物，0.5%酪蛋白氨基酸，Difco;0.5%酵母提取物；0.35%KH2PO4;0.15%K2HPO4;0.5%葡萄糖；0.4%MgCl2.6H2O;0.01%牛血清蛋白，Sigma;0.5%CMC，关东化学；0.005%台盼蓝，Merck;及氨基酸混合液，亮氨酸、蛋氨酸10pg/mL)上，在30'C下培养72小时，得到转化体。在DM3再生琼脂平板培养基上，在3(TC下，将形成菌鞘层(halo)的转化体用含四环素(15pg/mL)的胨培养基(3%胨S;3%麦芽糖；0.5%鱼肉提取物，和光纯药；0.1%酵母提取物；0.1%KH2PO4;0.02%MgS(V7H2O)摇动培养15小时，收集菌体后，用"MicroPrepPlasmidPurificationkit"(Amersham-Pharmacia)回收质体并精制。使用377DNA序列仪(AppliedBiosystems)确认插入所取得的质体中的纤维素酶遗传基因的变异序列。为能破译变异导入附近区域，选用适当的序列仪用引物，进行碱基序列破译，甄选导入的目标变异质体。实施例3纤维素酶变异体的生产在30'C下经72小时，使用含3。/。胨S(日本制药制)、0.5%鱼肉提取物、0.05%酵母提取物、0.1%KH2PO4、0.02%MgS(V7H2O、四环素(15吗/mL)及5%麦芽糖的培养基，培养及ISW1214宿主菌株。培养各种变异体的结果是环状区域变异体丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸的纤维素酶活性量为36800U/L，丙氨酸-组氨酸-丙氨酸纤维素酶活性量为34700U/L，丙氨酸-精氨酸-丙氨酸的纤维素酶活性量为32400U/L。纤维素酶活性用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定。即，将O.lmL适当稀释的酶液加入含0.2mL的0.5M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0)、0.4mL的2.5。/0(w/v)羧甲基纤维素(A01MC，日本制纸)、0.3mL的去离子水的反应液中，在40。C下反应20分钟，然后添加lmL的二硝基水杨酸试剂(0.5%二硝基水杨酸、30%罗谢尔盐、1.6%氢氧化钠水溶液)，在沸水中进行5分钟的还原糖显色。在冰水中急冷，添加4mL的去离子水，测定535nm的吸光度，求得还原糖的生成量。将二硝基水杨酸试剂加入未加酶液处理的反应液中，然后添加酶液，同样进行显色反应，得到空白样品。以在上述反应条件下l分钟内相当于生成l]imol葡萄糖的还原糖量，为1单位(1U)酶。实施例4重组纤维素酶环状修饰体的精制用去离子将重组纤维素酶环状修饰体的培养上清液稀释到10倍，然后点涂至用lOmM三氨基甲烷盐酸缓冲液(pH8.0)预平衡的DEAEToyopearl柱(Tosoh，2.5cmX5cm)中。用该缓冲液洗净柱后，利用该缓冲液中00.4M氯化钠400mL的直线浓度梯度，使蛋白质溶离。目标重组纤维素酶环状修饰体在氯化钠浓度0.25M附近，以近乎单组份地电泳溶离。脱盐浓縮时，使用超级过滤膜(PMIO，Millipore)。实施例5重组纤维素酶修饰体的最优反应pH值使用实施例4所得重组纤维素酶修饰体的精制样品，研究pH值对酶反应的影响。使用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH8.210.9)研究最优反应pH值后，结果判定重组野生型纤维素酶的最优反应pH值为9.0，而丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸变异体的纤维素酶的最优反应pH值为10，向高碱性侧移动了lpH单位(图2)。另外，丙氨酸-组氨酸-丙氨酸变异体及丙氨酸-精氨酸-丙氨酸变异体的最优反应pH值在9.6附近，且以最优pH值9.6的活性为100%时，pH8.8pH9.9的相对活性值为95%以上，与母本纤维素酶或丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸变异体相比，得到提高。产业实用性本发明的变异碱性纤维素酶具有接近洗涤液中的pH值(pH10.5附近)的最优pH值，适于用作洗涤用酶。序列表<110>花王株式会社<120>变异碱性纤维素酶<130>P〈150〉JPP2002-124474<151〉2002-04-25<160〉6<170>PatentlnVer.2.1<210>1<211>824<212>PRT<213>芽孢杆菌sp.KSM-S237(Sac』77us印.KSM-S237)〈400>1MetMetLeuArgLysLysThrLysGinLeulieSerSerlieLeulie151015LeuValLeuLeuLeuSerLeuPheProAlaAlaLeuAlaAlaGluGly202530AsnThrArgGluAspAsnPheLysHisLeuLeuGlyAsnAspAsnVal354045LysArgProSerGluAlaGlyAlaUuGinLeuGinGluValAspGly5055GinMetThrLeuValAspGin6570MetSerThrHisGlyLeuGin85AlaTyrLysAlaLeuSerAsn100AlaMetTyrValGlyGluAsn115LysGinArgVallieAspGly130135TyrVallieValAspTrpHis145150ProValTyrAlaGlyAlaLys165TyrProAsnAsnProHislielieTyrGluLeu180185SerAsnAsnAsnGlyGlyAlaGlylieProAsn195200LysAlaValLysGluTyrAlaAspProlieVal210215SerGlyAsnAlaAspAspAsnlielielieVal225230235SerGinArgProAspLeuAlaAlaAspAsnPro24525060GlyGluLyslieGinLeuArgGly7580PheProGlulieLeuAsnAspAsn9095TrpAspSerAsnMetlieArgLeu105110TyrAlaThrAsnProGluLeulie125GluLeuAlalieGluAsnAspMet140GlyAspProArgAsp160GlulieAlaAlaLeu175AlaAsnGluProSer190AsnGluGluGlyTrp205GluMetLeuArgLys220GlySerProAsnTrp240lieAspAspHisHis255HisTrpAspGly120lieValHisAlaPro155AspPhePheArg170ThrMetTyrThrValHisPheTyrThrGlySerHisAlaAlaSerThr260265270GluSerTyrProSerGluThrProAsnSerGluArgGlyAsnValMet275280285SerAsnThrArgTyrAlaLeuGluAsnGlyValAlaValPheAlaThr290295300GluTrpGlyThrSerGinAlaSerGlyAspGlyGlyProTyrPheAsp305310315320GluAlaAspValTrplieGluPheLeuAsnGluAsnAsnlieSerTrp325330335AlaAsnTrpSerLeuThrAsnLysAsnGluValSerGlyAlaPheThr340345350ProPheGluLeuGlyLysSerAsnAlaThrAsnLeuAspProGlyPro355360365AspHisValTrpAlaProGluGluLeuSerLeuSerGlyGluTyrVal370375380ArgAlaArglieLysGlyValAsnTyrGluProlieAspArgThrLys385390395柳TyrThrLysValLeuTrpAspPheAsnAspGlyThrLysGinGlyPhe405410415GlyValAsnSerAspSerProAsntysGluLeulieAlaValAspAsn420425430GluAsnAsnThrLeuLysValSerGlyLeuAspValSerAsnAspVal435440445SerAspGlyAsnPheTrpAlaAsnAlaArgLeuSerAlaAsnGlyTrp450455柳GlyLysSerValAsplieLeuGlyAlaGluLysLeuThrMetAspVal465470475480lieValAspGluProThrThrValAlalieAlaAlalieProGinSerSerLysSerGly500GluAspPheVal515lieThrGlyGlu530GluAspAsnAsn545AlaAspVallieGlulieProVal580ValPheGluAsp595GlyValLysThr610LeuSerTrpGlu625AlaThrAlaProGluAsnAspTyr660ThrGluGlyAla675GlyTyrTrpVal690485490TrpAlaAsnProGluArg505GinGinThrAspGlyLys520AspAlaProAsnLeuLys535MetAsnAsnlielieLeu550TyrLeuAspAsnlieLys565570ValHisAspProLysGly585GlyThrArgGinGlyTrp600AlaLeuThrlieGluGlu615PheGlyTyrProGluVal630ArgLeuAspPheTrpLys645650ValAlaPheAspPheTyr665MetAsnlieAsnLeuVal680GinAlaProLysThrTyr695495AlaValArgValAsnAla510TyrLysAlaGlyLeuThr525AsnlieAlaPheHisGlu540PheValGlyThrAspAla555560VallieGlyThrGluVal575GluAlaValLeuProSer590AspTrpAlaGlyGluSer605AlaAsnGlySerAsnAla620LysProSerAspAsnTrp635640SerAspLeuValArgGly655LeuAspProValArgAla670PheGinProProThrAsn685ThrlieAsnPheAspGlu700LeuGluGluAlaAsnGinValAsnGlyLeuTyrHisTyrGluValLys705710715720lieAsnValArgAsplieThrAsnlieGinAspAspThrLeuLeuArg725730735AsnMetMetlieliePheAlaAspValGluSerAspPheAlaGlyArg740745750ValPheValAspAsnValArgPheGluGly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