专利名称：一种用于马鹿冷冻精液保藏的稀释液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鹿人工授精技术改良中精液的稀释液，特别涉及一种用于鹿精液冷冻保藏的稀释液。
背景技术：
茸鹿是我国重要的特种经济动物，其主要产品鹿茸有着极高的药用价值。长期人工驯养的茸鹿养殖管理方法致使近亲繁殖，鹿群质量下降，而人工授精技术可以极大的提高了优秀种公鹿配种效能，打破公鹿使用的时间性和地域性，有效地解决了种公鹿不足地区的母畜配种问题，应用人工授精与特别是冷冻精液进行鹿的品种培育和改良，可有效遏制这种退化趋势。自1961年赵世臻等人首次用假阴道采得梅花鹿精液，输给马鹿，受胎率33％，贝什奥等人(1968)由鹿科动物采得精液，1976年广东动物园和广东省科技试验工场取得鹿电刺激采精成功，1988年黑龙江特产研究所对马鹿的人工授精获得60％以上的受胎率。常规牛冻精生产稀释液不能获得达标的鹿冷冻精液，目前国内也还没完全自主成功的研制出用于鹿冷冻精液保藏的专用稀释液，所以国内现在多使用法国卡苏公司和德国米尼图公司的冷冻稀释液，其价格高而且冷冻效果一般，制约了我国鹿产业的发展。
发明内容
针对现有技术中存在的问题与不足，本发明的目的在于提供一种冷冻效果好、生产成体低、方法简单的用于鹿冷冻精液保藏的稀释液。
实现上述发明目的的技术方案是一种用于鹿冷冻精液保藏的稀释液，它主要是由下列物质按比例制成双蒸水 100ml果糖0.5-3g三羟基氨基甲烷(Tris)2-7g柠檬酸 1-5g谷胱甘肽(GSH) 5-100mg牛血清白蛋白(BSA) 50-300mg三磷酸腺苷(ATP) 5-100mg维生素C(VC) 100-1000mg青霉素 10-100万链霉素 5-50万卵黄15-30ml甘油3-30ml为了使本发明的稀释液用于精液冷冻保存达到最佳效果，还可以加入甘油3-30ml。
本发明用于马鹿冷冻精液保藏的稀释液的制备方法很简单，将所述的原料直接搅拌混合均匀即可。
本发明用于马鹿冷冻精液保藏的稀释液有两个用途，一是用于精液低温保存，另一用途是用于精液冷冻保存。
本发明以TRIS为基础液，偏碱性且有较强的缓冲能力，有利于提高精子活力卵黄和甘油作为冻精稀释液的通用成分主要为精子降温和冷冻过程中提供保护，提高精子的稳定性和复苏后的活力，添加了ATP、BSA、VC、CP成分后作为鹿冻精生产稀释液可以获得理想且稳定的结果，而且价格便宜，受胎效果稳定。
具体实施例方式
以下结合发明给出的具体制备实施例、细管冻精的制作实施例及产品效果试验例来进一步说明本发明的有益效果。
实施例1本发明鹿冷冻精液保藏的稀释液制备将双蒸水100ml和果糖0.5g、Tris5g、柠檬酸3g、GSH 100mg、BSA 200mg、ATP 20mg、VC500mg、青霉素40万、链霉素40万、卵黄25ml混合均匀即得。
实施例2本发明鹿12％甘油稀释液制备将双蒸水100ml和果糖2g、Tris7g、柠檬酸2g、GSH30mg、BSA150mg、ATP50mg、Vc200mg青霉素60万、链霉素60万、卵黄25ml混合均匀，取混合稀释液88ml加12ml甘油制备12％甘油冷冻稀释液。
实施例3精液的低温保存将采集好的精液送往实验室，观察并测定活率、密度，以0.7和0.6为标准统计不同环境温度下达优、良标准的精子活力的精液份数占的百分数。挑选活率≥0.8的精液，确定稀释倍数，用20％卵黄稀释液将精液稀释到预定稀释倍数冰箱水浴1.5h降温到0℃，0℃环境保存7-10d，35℃的水浴锅中解冻20s，镜检，活率0.5以上的精液用于输精。
实施例4细管冻精的制作将采集好的精液送往实验室，观察并测定活率、密度，以0.7和0.6为标准统计不同环境温度下达优、良标准的精子活力的精液份数占的百分数。挑选活率≥0.8的精液，确定稀释倍数，用20％卵黄稀释液将精液稀释到预定稀释倍数的一倍，将与稀释精液等量、等温的12％甘油稀释液平衡前1次沿试管壁缓缓加入，混匀，使甘油终浓度达到6％。冰箱水浴1.5h降温到0℃。在0℃冰箱中水浴降温平衡3h。在冰箱中将平衡好的精液吸入0.25ml细管，聚乙烯醇粉封口，置于液氮面2cm的冷冻架上，盖好容器盖，冷冻5min，投入液氮中。抽样并在35℃的水浴锅中解冻20s，镜检，活率0.35以上的精液标记装入纱布袋液氮保存。
试验例1不同冷冻稀释液对冻精活力的影响表1不同冷冻稀释液对冻精活力的影响
表1结果显示，对天山马鹿应用牛的常规冻精生产稀释液，不能获得达标的冷冻精液，应用TRIS基础液(5％甘油)作为马鹿冻精生产稀释液可以获得较好的结果，以TRIS为基础液改良的本发明的稀释液(5％甘油)作为马鹿冻精生产稀释液可以获得理想且稳定的结果。
试验例2本发明的稀释液甘油浓度的筛选表2本发明的稀释液甘油浓度的筛选
甘油是应用最广泛的渗透性抗冻保护剂，甘油的浓度和稀释降温过程中的添加时机直接决定冷冻效果。它可以渗入细胞减轻冷冻和复温过程中细胞渗透性肿胀，减缓细胞皱缩速度，减轻皱缩程度，减少冰晶的形成，但是，甘油较高的渗透性又易造成精细胞的损伤，甘油浓度越高，细胞越易被伤害，各种动物精细胞冷冻时对甘油浓度的要求是不一样的，马鹿精液冷冻的甘油最佳浓度需要大量的试验进行筛选确定。试验结果显示，6种甘油浓度中5％和6％组的冻精达到0.45，较其他各浓度组有更高的活率，6％组的所有冻精活率均在0.3以上，其冷冻效果最好，5％组冻精活率也基本达标，但变异较大，其他各浓度组不能获得活率达标的冻精。6％甘油终浓度的稀释液可以获得最理想的活率。
试验例3本发明的稀释液(6％甘油)稀释液加入时间的筛选表3含6％甘油稀释液加入时间的筛选
甘油在0℃扩散入细胞较为困难，甘油液的加入最好在降温完成前加入使甘油在细胞内外平衡。表3结果显示，降温前一次组加入与降温前和平衡前分两次加入组的冻精活率均达标，两组的冷冻效果理想且差异不显著，平衡前一次加入组的冷冻效果不如前两组。这个结果提示，马鹿精子对较高浓度的甘油有较强耐受，甘油渗透达到平衡需要的时间较长，甘油在降温前一次加入达到6％终浓度既简化了操作步骤又可以获得最佳的冷冻效果。
权利要求
1.一种用于马鹿冷冻精液保藏的稀释液，其特征在于它主要是由下列物质按比例制成双蒸水100ml果糖 0.5-3g三羟基氨基甲烷2-7g柠檬酸1-5g谷胱甘肽 5-100mg牛血清白蛋白 50-300mg三磷酸腺苷5-100mg维生素C 100-1000mg青霉素10-100万链霉素 5-50万卵黄15-30ml
2.根据权利要求1所述的一种用于马鹿冷冻精液保藏的稀释液，其特征在于还可以加入甘油3-30ml。
全文摘要
本发明公开一种用于马鹿冷冻精液保藏的稀释液，它是由双蒸水80－150ml、果糖0.5－3g、Tris2－7g、柠檬酸1－5g、GSH5－100mg、BSA50－300mg、ATP5－100mg、V
文档编号A01N1/02GK101084926SQ20071001816
公开日2007年12月12日 申请日期2007年7月2日 优先权日2007年7月2日
发明者高庆华 申请人:高庆华