专利名称：绿色木霉耐药性菌株及其与杀菌剂的协同应用技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及绿色木霉耐药性菌株及其与杀菌剂的协同应用的方法，具体涉及一种绿色木霉耐药性菌株的诱发及其筛选技术，及绿色木霉耐药性菌株与杀菌剂(速克灵、醚菌酯)的相协同的复合制剂及其施用技术。
背景技术：
木霉是自然界中普遍存在的一类真菌，在土壤、植物根围、叶围及种子、球茎表面经常可以分离到。近些年人们发现某些木霉是植物病原真菌的寄生菌或拮抗菌，如哈茨木霉(T.harzianum)、钩状木霉(T.hamatum)、绿色木霉(T.viride)可以防治真菌病害。迄今为止有关木霉在生防方面的研究已开展近70年，在国外已经出现了商品化的木霉制剂。如以防治李属果树银叶病(Chondrostereum purpureum)的木霉制剂在西欧已商品化生产；以色列的Makhteshim Agan公司开发的以哈茨木霉T39菌株为发酵液的生防制剂，商品名Trichodex，剂型为25％可湿粉，它可以用于防治灰霉病菌(Botrytis cinerea)、菌核病菌(Scleratina sclerotiorum)、叶霉病(Cladosporium fulvum)、霜霉病(Pseudoperonasplra cubensis)和白粉病(Sphaerotheca fuliginea)等叶部病害，在国内也有研究利用木霉菌控制植物病害。
从公开报道的文献中可以看到人们对生防木霉菌的研究，大多集中在菌株的筛选、鉴定、发酵培养及其利用等方面。其中，我们所筛选的绿色木霉(Trichoderma viride)是一种具有广谱抑病能力的真菌，可以通过拮抗、竞争、寄生、诱导抗性、促生等作用方式，对多种植物病害具有明显的防治作用。但是由于木霉菌制剂为活孢子制剂，单独使用控制作物病害会受到作用方式等的影响，造成施用效果欠佳，具一定迟效性，且存在活性不稳问题，因此阻碍了生物制剂的规模化生产应用。
目前，在农业生产中仍以使用化学药剂为主，且生物农药还不能解决生产中存在的所有问题，在使用过程中化学药剂会对生物制剂产生抑制作用，因此造成生物制剂与化学药剂两者之间成为一对矛盾体。因而为解决生防制剂应用中所面临的问题，同时减少化学农药的施用剂量，提出利用绿色木霉的耐药性菌株，将耐药性绿色木霉与化学药剂混合使用，通过施用对植物病原菌有特异性的杀菌剂并引进耐药性拮抗木霉菌株，实现控制植物病害的有益互作。对于提高生防制剂的防治效果，减少化学农药的使用剂量及农药残留将有一定的帮助。
发明内容
本发明旨在研究一种利用绿色木霉耐药性菌株及其与杀菌剂的协同应用的方法。
本发明是通过以下技术方案实现上述发明目的的。
主要包括将绿色木霉耐药性菌株与杀菌剂的混合施用的方法，包括由绿色木霉(Trichodermaviride)耐药性菌株的诱发及其筛选，杀菌剂(速克灵、醚菌酯等)与绿色木霉耐药性菌株的协同作用，及通过绿色木霉耐药性菌株发酵孢子、杀菌剂相协同的复合制剂及其施用技术，本发明的特征在于诱发具防治植物病害活性绿色木霉的耐药性，生物制剂中加入杀菌剂、孢子保护剂等的协同制剂配方和施用技术。
具体实施例方式
下面进一步详述本发明。
1、绿色木霉对速克灵、醚菌酯耐药性菌株的筛选及诱导绿色木霉菌株耐药性的研究经对具强拮抗灰葡萄孢霉活性的绿色木霉菌，采用射线照射(30W、直线距离30cm、照射30min)和药剂亚致死剂量(500μg/ml)方法，进行绿色木霉耐药性菌株的人工诱发，并进行耐药性菌株的筛选，获得高耐药性菌株3株、中等耐药性菌株28株、敏感性菌株3株。其中高耐药性菌株分别为Tr9701、Tr2008、Tr2009，具有较强的耐受速克灵、醚菌酯药剂活性。
对筛选的高耐药菌株孢子悬液于药剂选择压力高的条件下(500μg/ml)培养，3天内即可长出较为旺盛的菌落。
经亚致死剂量药剂驯化法对筛选的高耐药性绿色木霉菌株进行诱导绿色木霉菌对速克灵、醚菌酯耐药性试验，由试验结果可知速克灵、醚菌酯对绿色木霉耐药菌株不同培养世代的药剂敏感性影响较少，差异不显著，速克灵和醚菌酯对绿色木霉菌在药剂亚致死剂量的不同培养世代抑菌活性无显著差异。
2、速克灵、醚菌酯与绿色木霉对病菌协同作用的影响采用纸碟法进行速克灵与绿色木霉协同对灰葡萄孢霉抑菌率进行试验，速克灵和绿色木霉分别设有效含量不等的4种配比组合，速克灵有效成分与绿色木霉菌剂(孢子数为5×108个孢子/g)的配比分别为1％和98％、5％和90％、10％和80％、20％和60％，以50％速克灵WP与绿色木霉菌剂(活孢子数5×108个/g)处理为对照，分别配制成1000倍、2000倍液浓度进行试验。由结果可知(见表1)，速克灵和绿色木霉协同作用对黄瓜灰霉病菌的抑菌作用明显提高，速克灵与绿色木霉菌可湿性粉剂的四种配比1000倍液下，协同作用抑菌率为67.5～85.0％，较单独采用绿色木霉菌可湿性粉剂及50％速克灵可湿性粉剂为高，单独作用平均抑菌率分别为68.8％、45.0％。其中速克灵与绿色木霉(1∶8)1000倍液协同作用抑菌率为85.0％，2000倍液的协同作用抑菌率为54.4％，增效明显，皆较绿色木霉菌和速克灵可湿性粉剂单独使用的抑菌率明显增加。
表1、速克灵浓度与绿色木霉菌可湿性粉剂对黄瓜灰霉病菌的协同作用 附2％、10％等表示添加速克灵粉剂有效成分含量分别为2％、10％等。绿色木霉制成木霉孢子粉可湿性粉剂剂型，活孢子数为5×108个/克，98％、90％等表示添加的绿色木霉粉剂比例。
通过对高拮抗灰葡萄孢霉并天然抗耐速克灵的绿色木霉耐药性菌株进行协同作用研究，试验表明，绿色木霉菌剂与速克灵结合施用对黄瓜灰霉病具有明显的协同作用。菌和药处理下，病原菌菌丝伸长速度缓慢，致病率降低，表明被速克灵抑制的病原菌可能较易被绿色木霉菌侵染。
通过速克灵浓度对协同作用影响试验，获得药和菌之间的最佳配比(1∶8)，经药菌复合研制出其协同制剂木·速可湿性粉剂。
表2、醚菌酯浓度与绿色木霉菌对黄瓜白粉病菌的协同作用 附4％、6％等表示添加醚菌酯有效成分含量分别为4％、6％等。绿色木霉制成木霉孢子粉可湿性粉剂剂型，活孢子数为5×108个/克，92％、88％等表示添加的绿色木霉粉剂比例。
采用叶片漂浮法进行醚菌酯与绿色木霉协同对黄瓜白粉病菌抑菌试验，结果可知(见表2)，醚菌酯和绿色木霉协同作用对黄瓜白粉病菌的抑菌作用明显提高，醚菌酯与绿色木霉菌剂的四种配比1000倍液下，协同作用抑菌率为72.4～81.7％，绿色木霉菌可湿性粉剂及50％醚菌酯干悬浮剂单独作用平均抑菌率分别为72.3％、78.8％，协同作用后明显较单独施用抑制效果为高。其中醚菌酯干悬浮剂与绿色木霉菌可湿性粉剂(8∶84)1000倍液协同作用抑菌率为81.7％，增效明显，较绿色木霉菌和醚菌酯单独使用的抑菌效果有明显增加。
通过醚菌酯浓度对协同作用影响试验，获得药和菌之间的最佳配比(1∶10)，经药菌复合研制出其协同制剂木·醚可湿性粉剂。
3、速克灵、醚菌酯与绿色木霉对病菌协同制剂的配制绿色木霉活菌制剂对蔬菜灰霉、白粉病等均有良好的防治效果，但田间施用过程中，由于生物菌剂自身作用方式的差异以及环境、施用技术等因素，均会影响其防治效果。我们通过人工诱发绿色木霉耐药性菌株，利用其耐药活性，同时加入孢子保护剂，配制成速克灵、醚菌酯与绿色木霉的复配制剂。
45％木·速可湿性粉剂配方耐药绿色木霉孢子、速克灵原药、硅藻土、可溶性淀粉、黄原胶和SDS和几丁质分别按照40％、5％、46.7％、5％和3.3％的比例混合均匀，并进行细化细度95％以上可通过100目筛，制成品外观松散、流动性好。
45％木·速WP品质标准为有效成分含量≥45％，(孢子数＞2×108孢子/克，速克灵≥5％)；水分＜5％；细度(过100目筛，％)≥95％。
44％木·醚可湿性粉剂配方耐药绿色木霉孢子、醚菌酯原药、硅藻土、可溶性淀粉、黄原胶和SDS和几丁质分别按照40％、4％、47.7％、5％和3.3％的比例混合均匀，并进行细化细度95％以上可通过100目筛，制成品外观松散、流动性好。
44％木·醚WP品质标准为有效成分含量≥44％，(孢子数＞2×108孢子/克，醚菌酯≥4％)；水分＜5％；细度(过100目筛，％)≥95％。
4、45％木·速WP与44％木·醚WP防治蔬菜灰霉病、黄瓜白粉病的使用效果于室内采用瓜条进行协同制剂45％木·速WP防治黄瓜灰霉病试验，结果见表3。由试验结果可知，45％木·速WP、50％绿色木霉WP、50％速克灵WP1000倍液防治效果分别为67.6％、51.5％和62.5％，表明速克灵对绿色木霉防治黄瓜灰霉病具有增效作用，菌+药处理较单独用菌、药能进一步提高防效。
表3.45％木·速WP协同防治黄瓜灰霉病药效试验(室内)
于室内采用叶片漂浮法进行进行协同制剂44％木·醚WP防治试验，结果见表4。由试验结果可知，44％木·醚WP500倍、50％绿色木霉WP50倍、50％醚菌酯干悬浮剂3000倍的防治效果分别为82.7％、74.9％和78.4％，表明醚菌酯对绿色木霉防治黄瓜白粉病具有增效作用，菌+药处理较单独用菌、药能进一步提高防效。
表4.45％木·醚WP协同防治黄瓜白粉病药效试验(室内)
由田间药效试验结果可知(见表5、6)，45％木·速WP和44％木·醚WP对黄瓜灰霉病、白粉病均有较好的防治效果，3次药后调查其防治效果优于或与两对照药剂50％速克灵WP和50％醚菌酯干悬浮剂的防效无显著差异，同等施用剂量的防治效果明显优于50％绿色木霉WP的防效，因此认为45％木·速WP和44％木·醚WP可以在生产上推广应用，具有良好的开发前景。
建议使用45％木·速WP防治黄瓜灰霉病，施用剂量为500～1500倍液，44％木·醚WP防治黄瓜白粉病，施用剂量为500～1500倍液，于发病前或发病初期开始应用，喷药时要使植株茎杆、瓜条、枝叶、叶片正反两面各部位均匀着药。
表5.45％木·速WP协同防治黄瓜灰霉病药效试验(田间)
表6.44％木·醚WP协同防治黄瓜白粉病药效试验(田间)
在田间自然条件下，病菌与寄主植株、果实接触，绿色木霉、特异性化学药剂与病原菌孢子菌丝的接触都是随机的。某些特异性药剂与绿色木霉混合使用，特异性化学药剂对植物病原菌有针对性的抑制作用，较单独施用生防菌能更有利于生防菌定殖于植株表面，且对植物病原菌的控制机率较单独使用绿色木霉作用大。相信在植物病害的防治中，实现化学药剂与绿色木霉菌制剂混合使用，不但可以提高生防制剂的防治效果，且可部分解决绿色木霉在施用过程中容易出现的迟效性问题，提高绿色木霉活菌制剂的防治效果，同时减少化学农药的使用剂量及农药的残留，并可望取得稳定而持久的防治效果，将是当前植物病害防治的一条新途径。
权利要求
1.一种将绿色木霉耐药性菌株与杀菌剂的混合施用的方法，包括由绿色木霉耐药性菌株的诱发及其筛选，杀菌剂(速克灵、醚菌酯等)与绿色木霉耐药性菌株的协同作用，及通过绿色木霉耐药性菌株发酵孢子、杀菌剂相协同的复合制剂及其施用技术，本发明的特征在于诱发具生物防治植物病害活性绿色木霉(Trichoderma viride)的耐药性，生物制剂中加入杀菌剂、孢子保护剂等的协同制剂配方和施用技术。
全文摘要
本发明涉及一种利用绿色木霉耐药性菌株及其与杀菌剂的协同应用的方法。本发明以绿色木霉耐药性菌株(Trichoderma viride)进行人工发酵生产绿色木霉耐药性菌株孢子，将其与特异性杀菌剂相混合利用，提高绿色木霉的生防活性及田间化学药剂的施用剂量，主要包括由绿色木霉(Trichoderma viride)耐药性菌株的诱发及其筛选，杀菌剂(速克灵、醚菌酯等)与绿色木霉耐药性菌株的协同作用，及通过绿色木霉耐药性菌株发酵孢子、杀菌剂相协同的复合制剂及其施用技术，本发明的特征在于诱发具防治植物病害活性绿色木霉的耐药性，生物制剂中加入杀菌剂、孢子保护剂等的协同制剂配方和施用技术。此项技术可解决生防制剂应用中所面临的问题，同时减少化学农药的施用剂量，实现控制植物病害的有益互作，对提高生防制剂的防治效果，减少化学农药的使用剂量及农药残留有一定的帮助。
文档编号A01N43/34GK101061806SQ200710057188
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月24日 优先权日2007年4月24日
发明者王勇, 王万立, 刘春艳, 郝永娟, 杨秀荣, 刘晓琳 申请人:天津市植物保护研究所