专利名称：一种彩色马蹄莲种质资源离体保存方法
技术领域：
本发明涉及植物种质资源保存及组织培养技术领域，尤其涉及一种彩色马 蹄莲种质资源离体保存的方法。
背景技术：
彩色马蹄莲(Z朋^o^c力^ A^Wofe)系天南星科(Isceae)马蹄莲属 (Za/7"&sc力j^)多年生单子叶草本球根花卉，其形态高雅、色彩艳丽，在欧洲 国家一直是切花中的佼佼者，盆花栽培也是一大消费渠道。近几年来也逐渐受 到我国消费者的喜爱，种植面积正不断扩大。生产上彩色马蹄莲多为一年生栽 培，通过球茎进行无性繁殖。彩色马蹄莲种质资源的繁殖和保存也主要依靠球 茎为繁殖材料每年进行田间种植，这需要消耗人量的人力、物力和财力，而且 彩色马蹄莲球茎本身很容易感染细菌性软腐病，通过多年的无性繁殖后很容易 造成细菌、病毒等病虫害蔓延，造成资源损失，给种质资源的利用和保存带来 难题。
当前，植物种质资源的保存方法主要有田间生长保存，离体低温保存、超 低温保存，组织培养保存等方法。其中，常规田间种植保存中，存在因季节变 换、病虫害等自然灾害的侵袭而造成工作量大和种质资源容易丢失；而超低温 保存需要严格的保存条件，风险较大。植物离体保存因不受外界环境条件的影 响，具有田间生长保存无法比拟的优点。对植物进行离体保存技术已多有报导， 如专利申请号为CN200710019345和CN200710019346分别报导了通过减少培养基 中大量元素和添加脱落酸进行菊花离体保存的方法，发明名称为"茅苍术组培 繁殖的种质保存方法"，发明名称为"一种营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方
法"，等分别通过常温抑制生长，普通组织培养方式或超低温方式对植物进行 了离体保存。但简单的运用以上保存方法并不适用于彩色马蹄莲，首先，彩色 马蹄莲球茎本身很容易携带欧文氏菌(可导致细菌性软腐病)，尤其通常以带 芽眼的切块为外植体，在快繁过程中随着培养代数的增加，此内生菌也大量繁 殖蔓延，导致组培快繁无法继续；其次，该欧文氏菌系内生菌，若以常规的升 汞表面消毒则达不到理想的防治效果，这对彩色马蹄莲的长期离体保存也是一 个瓶茎问题；再次，在常规组培保存中必需对彩色马蹄莲种质资源进行频繁的 继代培养(约每月继代一次)才能较好地保持其种性；此外，彩色马蹄莲球茎 除携带欧文氏菌外，也往往携带有大量病毒，这在组培与离体保存中也是必须 考虑的问题。
发明内容
本发明目的是，针对以往彩色马蹄莲常规组培离体保存中， 一方面以种球 带芽眼切块为外植体和常规的表面消毒，对球茎本身所携带的内生菌种一欧文 氏菌，难以达到好的灭菌、脱菌的效果，另一方面在常规保存培养条件下需频 繁继代培养所带来的大工作量等缺陷；提出一种成本低廉，操作简便，灭菌效 果较好，保存期长达一年以上不需要频繁继代培养而仍能保持优良种性的彩色 马蹄莲种质资源离体保存方法。
本发明目的通过以下技术方案来实现
一种彩色马蹄莲种质资源离体保存方法，按如下步骤进行
(1)培养基的配制各阶段培养基组分和各组分在每升培养基内所含重量为 A)基本培养基其中，诱导、增殖培养基以蔗糖30g/L ，琼脂7g/L的MS 为基本培养基；生根培养基以蔗糖30g/L ，琼脂7g/L的1/2MS为基本培养基； 试管球茎膨大培养基以蔗糖40 50g/L ，琼脂6g/L的MS为基本培养基；种质
保存培养基以蔗糖20g/L ，琼脂8g/L的1/2MS为基本培养基；pH均为5. 6
5.8;
B) 诱导培养基Ml: MS+6-BA1. 0-2. Omg/L+IBAO. 3-0. 5mg/L+青霉素50mg/L;
C) 增殖培养基M2: MS+6-BAO, 5-1. Omg/L+IBAO. 1-0. 5mg/L+青霉素100mg/L;
D) 生根培养基M3: 1/2MS+6-BAO. 2-0. 4mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L;
E) 球茎膨大培养基M4: MS+6-BA1. 0-3. Omg/L+NAAO. 5mg/L+Aclg/L;
F) 种质保存培养基M5: 1/2MS+6-BA0. 1-0. 3mg/L+NAA0. 1-0. 4mg/L +甘露醇 15. 0-20. Og/L+青霉素100mg/L;
(2) 外植体消毒、接种及诱导培养选取彩色马蹄莲健康、饱满母球，用自 来水刷洗掉母球上泥土及最外层褐色表皮，冲洗约20分钟后，用解剖刀切取母 球上lcm3的块茎芽眼，经自来水冲洗干净后，于超净操作台上用75%酒精浸泡 0.5分钟，无菌水冲洗3次，0. P/oHgCl2水溶液常规灭菌12min，无菌水冲洗3 5次，剥取0. 5mm以下茎尖分生组织，接种于诱导培养基M1中，于22_26QC，光 强2000-3000Lx，光照12h/d条件下培养一个月；或选取彩色马蹄莲组培生产过 程中无内生菌污染且生长健康的植株，剥取0.5mm以下茎尖分生组织为诱导、 增殖对象；
(3) 增殖培养将步骤(2)已成活且无污染的丛生芽转接到增殖培养基M2 中，于22-26°C，光强2000-3000Lx，光照12h/d条件下培养一个月；继代周期为 一个月，将块状芽丛剪成小块进行扩繁；
(4) 生根培养挑选步骤(3)中健壮丛状小植株剪成单株转接到生根培养 基M3中，于22-26。C，光强2000-3000Lx，光照12h/d条件下培养一个月，长成 4-6条白色长根的小苗；
(5) 球茎膨大培养挑选步骤(4)中根与茎叶皆健壮植株转接到球茎膨大
培养基M4中进行试管养球，在22-25°C，光照12-16h/d，光强2000-3000Lx下 培养约一个月时间；
(6) 种质保存培养挑选歩骤(5)小子球饱满的植株转接到种质保存培养 基M5中，在10-15"，光照10h/d，光强IOOO Lx环境下保存，保存期长达15 个月以上；
(7) 恢复培养将步骤(6)保存培养一年以上已进入半休眠状态的小子球 植株，先转移到同步骤(2)培养条件下恢复培养一个月，再转接到新鲜的诱导 培养基M1中进行二代或二代以上的组培繁殖；
(8) 遗传稳定性检测与利用观察并挑选步骤(7)组培繁殖的小子球生长、 增殖状况正常，长势旺盛，增殖率为3. 8-4. 2，经可溶性蛋白和过氧化物酶(POD) 检测未发生遗传变异的植株；该植株或按步骤(3)至(6)进行种质资源离体 再保存；或按步骤(3)至(5)用于种苗扩繁生产。
所述的1/2MS基本培养基为大量元素减半的Murashige-Skoog (MS)培养基。
本发明的有益效果是
一、 本发明采用0.5mm以下彩色马蹄莲茎尖分生组织为外植体，并在诱导、 增殖及保存培养基中分别添加了 50mg/L与100mg/L的青霉素以获得培养材料， 有效地克服了内生菌造成的污染问题，同时，通过茎尖脱毒种球内的病毒也得 到了较好的控制；而通常以带芽眼切块为外植体且在培养基中不添加青霉素的 培养方式中，经过4-5代增殖培养后会开始出现内生菌的污染现象，以此种材料 为保存对象，很可能造成保存的失败。
二、 本发明通过在保存培养基中添加了 10.0 20.0g/L甘露醇，将大量无 机盐成分减半，并辅以较低温度、低光照的生长环境(10-15°C，光照10h/d，
光强1000 Lx)，抑制了保存材料的生长，达到长期保存目的，比在普通MS培 养基中保存期延长6-8个月，不需频繁继代，可在有限的空间内保存更多的种质 资源，并减轻了工作量。
三、本发明保存的小球茎苗经恢复培养与繁殖后，既可用于再保存，也可 直接用于组培快速繁殖，后代生长正常，增殖第2代的增殖系数平均为3. 8-4. 2， 与正常球茎苗相当，亦无遗传变异发生；这种保存方法相对于超低温保存安全、 设备简单、易操作，成本可降低50%以上。
具体实施例方式
通过以下实施例对本发明做进一步的详细说明，但本发明的内容并不仅限 于此。
青霉素与甘露醇均为上海化学试剂厂生产化学纯； 实施例l:(彩色马蹄莲种质资源离体保存方法l) (1)培养基的配制 基本培养基
1) 诱导、增殖培养基以庶糖30g/L ，琼脂7g/L的MS为基本培养基；
2) 生根培养基以蔗糖30g/L ，琼脂7g/L的1/2MS为基本培养基；
3) 试管球茎膨大培养基以蔗糖40 50g/L ，琼脂6g/L的MS为基本培养基;
4) 种质保存培养基以蔗糖20g/L ，琼脂8g/L的1/2MS; 以上基本培养基pH均为5. 6 5. 8;
其中，1/2MS基本培养基为大量元素减半的Murashige-Skoog (MS)培养基； (2)外植体消毒、接种及诱导培养选取健康、饱满彩色马蹄莲母球，用自 来水刷洗掉母球上泥土及最外层褐色表皮，经流水下冲洗约20分钟后，用解剖刀切取母球上lcm3的块茎芽眼，经自来水冲洗干净后，于超净操作台上用75% 酒精浸泡0.5分钟，无菌水冲洗3次，0. 1。/。的HgCl2水溶液常规灭菌12min，无 菌水冲洗3 5次，剥取0. 5mm以下茎尖分生组织，接种于茎尖诱导培养基Ml: MS+6-BA2. Omg/L+IBAO. 4mg/L+青霉素50mg/L中，于26°C，光强2500Lx，光照12h/d 条件下培养；
(3) 增殖培养 一个月后将步骤(2)中已成活且无污染的丛生芽转移到增 殖培养基M2: MS+6-BA1. Omg/L+IBAO. 45mg/L+青霉素100mg/L中，于22QC，光强 3000Lx，光照12h/d条件下培养一个月进行扩繁；继代周期为一个月，将块状 芽丛剪成小块进行扩繁；
(4) 生根培养挑选歩骤(3)中健壮小植株剪成单株转接到M3: 1/2MS+6-BA0.2mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L培养基中，于22°C,光强2000Lx，光照 12h/d条件下培养一个月，可长成4-6条白色壮而长根的小苗；
(5) 球茎膨大培养挑选步骤(4)中根与茎叶皆健壮植株转接到球茎膨大 培养基M4: MS+6-BA3.0mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L中进行试管养球，光照期间培 养温度为25'C，黑暗期间为15i:，光照时间为12h/d，光强3000Lx，约一个月 时间即可；
(6) 种质保存培养挑选步骤(5)中小子球饱满的植株保存于培养基M5: 1/2MS+6-BA0. lmg/L+NAA0. lmg/L +甘露醇20. Og/L+青霉素100mg/L中，培养温 度为15°C，光照为10h/d，光强1000 Lx环境下保存可达15个月以上。
(7) 恢复培养对步骤(6)中保存一年以上己进入半休眠状态的小子球转 移到，同步骤(2)相同培养条件下进行恢复培养一个月后，转移到新鲜的Ml 培养基中进行二代或二代以上的组培繁殖；
(8) 遗传稳定性检测与利用可观察到步骤(7)中恢复培养的小子球生长
增殖状况正常，长势旺盛，到第2代增殖率与正常组培条件下已形成相应大小
试管球茎的组培苗相当，为3.8-4.2，通过可溶性蛋白和过氧化物酶(P0D)检测 未发生遗传变异。该植株或按步骤(3)至(6)进行种质资源离体再保存；或 按步骤(3)至(5)用于种苗扩繁生产。
实施例2:(彩色马蹄莲种质资源离体保存方法2)
本例诱导培养基为M1: MS+6-BA1. 5mg/L+IBA0. 3mg/L+青霉素50mg/L，培养条 件为24。C，光强3000Lx，光照12h/d;
增殖培养基为M2: MS+6-BAO. 8mg/L+IBA0. 3mg/L+青霉素100mg/L，培养条件 为25QC，光强2500Lx，光照12h/d条件下培养一个月；
生根培养基为M3: 1/2MS+6-BA0. 4mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L，培养条件为23°C， 光强3000Lx，光照12h/d条件下培养一个月；
球茎膨大培养为M4: MS+6-BA2. Omg/L+NAAO. 5mg/L+Aclg/L，培养条件为光照 期间22。C，黑暗时间温度为13'C，光照时间为14h/d，光强2500Lx;
种质保存培养基为M5: 1/2MS+6-BAO. 2mg/L+NAA0. 3mg/L +甘露醇15. Og/L+青 霉素100mg/L，培养条件为1(TC，光照为10h/d，光强IOOO Lx;
其余步骤，工艺均同于实施例l。
实施例3:(彩色马蹄莲种质资源离体保存方法3)
本例诱导培养基为M1: MS+6-BA1.0mg/L+IBA0. 5mg/L+青霉素50mg/L上；培养 条件为22。C，光强2000Lx，光照12h/d;
增殖培养基为M2: MS+6-BA0. 5mg/L+IBA0. 15mg/L+青霉素100mg/L，培养条件 为23°C，光强2000Lx，光照12h/d条件下培养一个月；
生根培养基为M3: 1/2MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L，培养条件为26°C， 光强2500Lx，光照12h/d条件下培养一个月；
球茎膨大培养为M4: MS+6-BA1. 5mg/L+NAA0. 5mg/L+Aclg/L，培养条件为光照 期间培养温度为24°C，黑暗期间培养温度为13°C，光照时间为16h/d，光强 2000Lx;
种质保存培养基为M5: 1/2MS+6-BAO. 3mg/L+NAA0. 4mg/L +甘露醇18. Og/L+青 霉素100mg/L，培养条件为13。C,光照为10h/d,光强1000Lx; 其余步骤，工艺均同于实施例l。 试验例(遗传稳定性检测)
(1) 植物材料
a) 对照材料以常规正常繁殖生产的茎尖组培苗为材料；
b) 处理材料以恢复培养的保存材料二代繁殖苗为检测对象；
(2) 将对照与处理材料经过增殖、生根后种植田间，观察生长、开花情况均 趋一致，叶片与花均无变异发生；
(3) 对照与处理材料蛋白质和同工酶样品溶液的制备分别准确称取2.0g试 管苗叶片，剪碎后加入适量的石英砂于冰浴下匀浆，匀浆过程加入4ml稀释4 倍的浓縮胶缓冲(pH值6. 7)， 5000r/min离心20min，取上清液2ml加入lml 蔗糖溶液(40%)和1滴溴酚蓝溶液(O. 1%)混匀，于-2(TC冰箱内贮存备用；
(4) 电泳操作采用垂直PAGE不连续凝胶系统。每个样品槽上样30ul，电泳 开始时控制电流为15mA，待样品进入分离胶后，调整电流为25mA。待溴酚蓝 迁移至琼脂层lcm时停止电泳,整个过程约3h;为防止温度对酶活的影响， 电泳均在4'C冰箱内进行；
(5) 染色电泳结束后，打开胶板取出凝胶，标记溴酚蓝泳动前沿；可溶性蛋
白采用考马斯亮R2250法染色；P0D采用抗坏血酸-醋酸联苯胺法染色；
(6) 谱带结果与对照无明显多态性，表明保存过程中无遗传变异发生。
权利要求
1、一种彩色马蹄莲种质资源离体保存方法，其特征在于该方法按如下步骤进行(1)培养基的配制各阶段培养基组分和各组分在每升培养基内所含重量为A)基本培养基其中，诱导、增殖培养基以蔗糖30g/L，琼脂7g/L的MS为基本培养基；生根培养基以蔗糖30g/L，琼脂7g/L的1/2MS为基本培养基；试管球茎膨大培养基以蔗糖40～50g/L，琼脂6g/L的MS为基本培养基；种质保存培养基以蔗糖20g/L，琼脂8g/L的1/2MS为基本培养基；pH均为5.6～5.8；B)诱导培养基M1MS+6-BA1.0-2.0mg/L+IBA0.3-0.5mg/L+青霉素50mg/L；C)增殖培养基M2MS+6-BA0.5-1.0mg/L+IBA0.1-0.5mg/L+青霉素100mg/L；D)生根培养基M31/2MS+6-BA0.2-0.4mg/L+NAA0.5mg/L+Ac1g/L；E)球茎膨大培养基M4MS+6-BA1.0-3.0mg/L+NAA0.5mg/L+Ac 1 g/L；F)种质保存培养基M51/2MS+6-BA0.1-0.3mg/L+NAA0.1-0.4mg/L+甘露醇15.0-20.0g/L+青霉素100mg/L；(2)外植体消毒、接种及诱导培养选取彩色马蹄莲健康、饱满母球，用自来水刷洗泥土及最外层褐色表皮，冲洗约20分钟后，切取母球上1cm3的块茎芽眼，经自来水冲洗后，于超净操作台上用75％酒精浸泡0.5分钟，无菌水冲洗3次，0.1％HgCl2水溶液常规灭菌12min，无菌水冲洗3～5次，剥取0.5mm以下茎尖分生组织，接种于诱导培养基M1中，于22-26℃，光强2000-3000Lx，光照12h/d条件下培养一个月；或选取彩色马蹄莲组培生产过程中无内生菌污染且生长健康的植株，剥取0.5mm以下茎尖分生组织为诱导、增殖对象；(3)增殖培养将步骤(2)已成活且无污染的丛生芽转接到增殖培养基M2中，于22-26℃，光强2000-3000Lx，光照12h/d条件下培养一个月；继代周期为一个月，将块状芽丛剪成小块进行扩繁；(4)生根培养挑选步骤(3)中健壮丛状小植株剪成单株转接到生根培养基M3中，于22-26℃，光强2000-3000Lx，光照12h/d条件下培养一个月，长成4-6条白色长根的小苗；(5)球茎膨大培养挑选步骤(4)根与茎叶皆健壮植株转接到球茎膨大培养基M4中进行试管养球，在22-25℃，光照12-16h/d，光强2000-3000Lx下培养约一个月时间；(6)种质保存培养挑选步骤(5)小子球饱满的植株转接到种质保存培养基M5中，在10-15℃，光照10h/d，光强1000Lx环境下保存，保存期长达15个月以上；(7)恢复培养将步骤(6)保存培养一年以上已进入半休眠状态的小子球植株，先转移到同步骤(2)培养条件下恢复培养一个月，再转接到新鲜的诱导培养基M1中进行二代或二代以上的组培繁殖；(8)遗传稳定性检测与利用观察并挑选步骤(7)组培繁殖的小子球生长、增殖状况正常，长势旺盛，增殖率为3.8-4.2，经可溶性蛋白和过氧化物酶(POD)检测未发生遗传变异的植株；该植株或按步骤(3)至(6)进行种质资源离体再保存；或按步骤(3)至(5)用于种苗扩繁生产。
2、按权利要求1所述的方法，其特征在于所述的1/2MS基本培养基为大量 元素减半的Murashige-Skoog (MS)培养基。
全文摘要
本发明公开了一种彩色马蹄莲种质资源离体保存方法，属于植物种质资源保存及组织培养技术领域。该方法包括培养基的配制；外植体消毒、接种及诱导培养；增殖培养；生根培养；球茎膨大培养；种质保存培养；恢复培养及遗传稳定性检测与利用等步骤。该方法取彩色马蹄莲0.5mm茎尖分生组织为外植体，减少了培养基中大量元素并添加了甘露醇和青霉素，在10-15℃，光照10h/d，光强1000Lx环境下保存球茎苗，15个月后无欧文氏菌污染，存活率达100％，恢复培养后生长、增殖仍正常，无可遗传变异发生。该方法具成本低廉，操作简便等特点，可在彩色马蹄莲种质保存领域中推广应用。
文档编号A01N3/00GK101185433SQ20071016473
公开日2008年5月28日 申请日期2007年12月10日 优先权日2007年12月10日
发明者玫 刘, 吴延军, 孙崇波, 张慧琴, 蒋桂华, 鸣 谢, 郭方其, 黄普乐 申请人:浙江省农业科学院