专利名称：一种新型草坪草种质的创制方法及产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型草坪草种质的创制方法及产品，属于生物技术领域。
背景技术：
叶片衰老不是叶片细胞的简单死亡，而是一种动态的细胞程序性死亡过程(programmed cell death, PCD)。叶片衰老外观上表现为叶色由绿变黄、最后枯死；在生理水平上表现为 蛋白含量及叶绿素含量下降、叶片光合能力降低、膜脂过氧化加剧、游离氨基酸积累、腐胺 含量上升而精胺含量下降、细胞分裂素(CTK)含量下降、脱落酸(ABA)含量上升、膜系统保护 酶活性降低等。
目前，采用基因工程技术抑制植物叶片衰老主要有两条途径 一是抑制乙烯合成，二是 促进细胞分裂素合成。异戊烯基转移酶基因(ipt)是细胞分裂素合成步骤中的一个关键酶 ，它在胁迫条件下被激活而引起细胞分裂素(CTK)的大量合成，从而打破细胞中CTK与生长 素的平衡。付强等研究发现，在活体条件下，这种改变不仅能使寄生植物芽大量生长，而且 还会使植物产生对胁迫因子的抗性，推迟叶片衰老的时间。
抗除草剂bar基因不仅在遗传转化上作为标记基因，在草坪草育种上也可做功能基因使 用。多年生黑麦草作为草坪草种，在国外已经有许多通过常规育种方法育成的品种，在生态 环境改善、水土保持、城市绿化、运动场地建设等方面发挥了重要的作用。但现有技术中还 没有关于同时转有异戊烯基转移酶基因和抗除草剂基因的草坪草植株的报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种新型草坪草种质的创制方法及产品。本发明利用异戊烯基 转移酶基因(ipt)的抗逆特性，将其与抗除草剂基因(bar)构建融合基因，转入黑麦草植 株中，获得既抗衰老又抗除草剂的一种新型草坪草种质资源。
本发明的技术方案 一种新型草坪草种质的创制方法，包括下列步骤
A. 愈伤诱导黑麦草系列草坪草成熟种子切去部分胚乳，用75%酒精浸泡40-503，再用 0. P/。HgCl2浸泡2-5min，用无菌水清洗4-6次，吸干水分接于诱导培养基上，每18-23天继代 一次；
B. 浸染及筛选挑取含有表达载体pBinAipt-bar的农杆菌EHA105菌落，在含50mg/L卡那 霉素和20mg/L利福平的YEP培养基中26-3(TC震荡培养至菌液0D6(K)值为0. 5-0. 7时收集菌体，用MS重悬培养基重悬菌体；挑选鲜嫩的愈伤于菌体重悬液中浸泡12-18min，用无菌滤纸吸干 菌液接于共培养基上，48-72小时后转入含除草剂Basta 4. 5-5. 5mg/L的筛选培养基上，保持 选择压继代l-3次；
C.分化、生根、移栽将在筛选培养基上存活下来的愈伤组织接于分化培养基上，分化 的幼苗长至2-3cm时转移至生根培养基中培养，待苗长至5-10cm时打开瓶盖，炼苗3-5d后移 植到土壤中。
A步骤中所述愈伤组织诱导培养基中含有l. 8-2. 2mg/L 2， 4-二氯苯氧乙酸。 B步骤中所述的MS重悬培养基中含有95-105mg/L乙酰丁香酮和18-22g/L蔗糖。 B步骤中所述的共培养基中含有1.8-2.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、95-105mg/L乙酰丁香 酮及18-22g/L蔗糖。
B步骤中所述筛选培养基中含有1.8-2.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、除草剂Basta 4. 5-5. 5mg/L、 240-260mg/L T头孢霉素及28-32g/L蔗糖。
C步骤中所述分化培养基中含有1.8-2.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0. 08-0. 12mg/L 6-苄 氨基嘌呤、240-260mg/L T头孢霉素及28-32g/L蔗糖。
C步骤中所述生根培养基中含有240-260mg/L头孢霉素和18-22g/L蔗糖。 植物组织培养各个阶段的培养条件为诱导、继代、筛选均为暗培养；分化、芽增殖和 生根为光照培养，光强为3800-42001ux、 12-16h/d。
如上所述新型草坪草种质的创制方法制得的草坪草种质。 本发明所用生根培养基为1/2MS培养基，其余培养基均为MS常规培养基。 本发明以农杆菌介导法用双价表达载体pBinAipt-bar转化黑麦草，使其获得既抗衰老又 抗除草剂的能力。发明人利用黑麦草成熟胚为材料进行遗传转化并得到转基因植株，并对该 转基因植株和非转基因植株进行了对比1.与非转基因植株比较转基因植株表现出分蘖增加 ，叶绿素含量提高等特性；2.PCR检测结果如图2所示，转基因植株出现325bp目标条带，非 转基因植株没有目标带出现；3.抗除草剂鉴定转基因植株与非转基因植株比较表现出对除 草剂抗性增强；4.延缓衰老鉴定转基因植株离体叶片在光照培养8天后仍然保持绿色，非 转基因植株离体叶片在培养5天后开始出现黄化，8天后2/3以上叶片黄化。
与现有技术相比，本发明将异戊烯基转移酶基因(ipt)与抗除草剂基因(bar)构建融 合基因转入黑麦草中，获得了同时抗除草剂又延缓衰老的转基因植株，该植株表现出叶绿素 含量及分蘖数增加，提供了一种更优良的草坪草种质资源。
图l是黑麦草转基因植株与非转基因植株的对照图，其中A为转基因植株，B为非转基因 植株。
图2是黑麦草转基因植株和非转基因植株的PCR检测结果，其中M: 100bp DNA ladder P: pBinAipt-bar 质粒l、 9、 10、 15、 24:转基因植株 CK:非转基因植株
图3是黑麦草植株抗除草剂的鉴定结果，其中l、 2为转基因植株，CK为非转基因植株。 图4是黑麦草植株延缓衰老鉴定结果，其中l、 2为转基因植株，CK1、 CK2为非转基因植株。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式
培养基及培养条件共培养基中含有2. 0mg/ L 2，4-二氯苯氧乙酸、100mg/L乙酰丁香 酮及20g/L蔗糖，MS重悬培养基中含有100mg/L乙酰丁香酮及20g/L蔗糖，筛选培养基中含有 2. Omg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、5mg/L除草剂Basta、 250mg/L T头孢霉素及30g/L蔗糖，愈伤 组织诱导培养基中含有2. Omg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，生根培养基中含有250mg/L头孢霉素及 20g/L蔗糖，分化培养基中含有2. Omg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0. lmg/L 6-苄氨基嘌呤、 250mg/L T头孢霉素及30g/L蔗糖。实验中生根培养基为1/2MS培养基，其余培养基均为MS常 规培养基。植物组织培养各个阶段培养条件为诱导、继代、筛选均为暗培养；分化、芽增 殖和生根为光照培养，光强为40001ux、 14h/d。其中1L MS培养基中包含硝酸钾(KN03) 1900毫克，硝酸铵(NH4N03) 1650毫克，氯化钙(CaCl2 2H20) 440毫克，硫酸镁(MgS04. 7H20) 370毫克，磷酸二氢钾(腿2P04) 170毫克，硫酸锰(MnS04 4H20) 22. 3毫克，硫酸锌 (ZnS04*7H20) 8. 6毫克，硼酸(112803) 6. 2毫克，碘化钾(KI) 0. 83毫克，钼酸钠(Na2Mo04 2H20) 0.25毫克，乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA.2H20) 37. 25毫克，硫酸亚铁(FeS04 7H20) 27.8毫克，硫酸铜(CuS04 5H20) 0. 025毫克，氯化钴(C0C12 6H20) 0. 025毫克，肌醇100毫 克，烟酸0.5毫克，盐酸硫胺素(维B1) 0. l毫克，盐酸吡哆素(维B6)0.5毫克，甘氨酸2毫克 ，PH值5. 80。 1L YEP培养集中包含:5. Og蛋白胨，5. Og酵母提取物，2. 5gNaCl， PH值7. 20。
1、黑麦草遗传转化
将黑麦草卓越系列草坪草成熟种子切去部分胚乳，用75。/。酒精浸泡45s，再用O. l%HgCl2 浸泡3min，用无菌水清洗5次，吸干水分接于诱导培养基上，每20天继代一次。
黑麦草的遗传转化采用农杆菌介导法，将制备表达载体pBinAipt-bar的农杆菌EHA105在 含50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的YEP培养基中28。C震荡培养至菌液OD6oo值为0. 5-0. 7时集菌，用MS重悬培养基重悬菌体。挑选鲜嫩的愈伤于菌体重悬液(OD6oo为0.5-0.7)中浸泡，其间不断摇动，15min后取出用无菌滤纸吸干菌液接于铺有无菌滤纸的共培养基上培养3天。经共培养后的愈伤组织转入筛选培养基(含除草剂Basta 5.0mg/L)，约40天后大部分愈伤组织褐化死亡，但部分褐化的愈伤组织会长出部分颗粒状的新鲜愈伤。将在筛选培养基上存活下来的愈伤组织接于分化培养基(2. O)上，分化的幼苗长至2-3cm时转移至生根培养基中培养，待苗长至5-10cm时打开瓶盖，炼苗3-5d后移植到土壤中。
按上述方法得到的转基因植株即为本发明的新型草坪草种质。
2、转基因植株PCR检测
用ipt基因特异引物进行PC財广增，目的片段为325bp。引物序列为Foward: 5'-ATCGGGTCCAATGCTGTCCTC-3;Reverse: 5'-TGCTTAACTCTGGCCTTGGC-3'。
反应体系(20 y 1 volume)
10XPCR buffer (with Mg2+)2. 0 y 1
dNTPs (0. 2 mM each) 1. 6 y 1
Primerl (20 y M) 0.3 y 1
Primer2 (20 y M) 0.3 y 1
Template DNA 0.2 y 1
T叫酶 0. 1 y 1
ddH20至总体积 20 y 1
扩增反应程序为①94。C5min，②94。C30s， 55。C30s， 72。C30s进行35个循环，③72。C10min。
扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳上检测并拍照。
随机选取5株移栽成活的抗性植株提取总DNA进行PC財广增，发现第1和第24号植株出现325bp目标带，对照植株没有目标带，初步证明目的基因整合到早熟禾植物基因组中(见图l)c
3、 抗除草剂鉴定
剪取转基因植株与对照叶位相同完全展开新鲜叶片，插入含有200mg/L的除草剂Basta的培养瓶中培养，对照植株7d即黄化，10d时死亡，转基因植株叶片7d仍健康，转基因植株在培养15d后出现黄化。
4、 抗衰老鉴定
7分别取转基因植株和对照叶位相同，刚展开的完全叶，放在铺有湿滤纸的培养皿中，保湿离体培养，25'C下光照8h/d。观察离体叶片的滞绿效果。转基因植株离体叶片在光照培养8天后仍然保持绿色，非转基因植株离体叶片在培养5天后开始出现黄化，8天后叶片完全黄化。
权利要求
权利要求1一种新型草坪草种质的创制方法，其特征在于包括下列步骤
2.根据权利要求l所述的新型草坪草种质的创制方法，其特征在于 A步骤中所述诱导培养基中含有l. 8-2. 2mg/L 2， 4-二氯苯氧乙酸。
3.根据权利要求l所述的新型草坪草种质的创制方法，其特征在于 B步骤中所述的MS重悬培养基中含有95-105mg/L乙酰丁香酮和18-22g/L蔗糖。
4.根据权利要求l所述的新型草坪草种质的创制方法，其特征在于 B步骤中所述的共培养基中含有1.8-2.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、95-105mg/L乙酰丁香酮及 18-22g/L蔗糖。
5.根据权利要求l所述的新型草坪草种质的创制方法，其特征在于 B步骤中所述筛选培养基中含有1.8-2.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、除草剂4. 5-5. 5mg/L、 240-260mg/L T头孢霉素及28-32g/L蔗糖。
6.根据权利要求l所述的新型草坪草种质的创制方法，其特征在于 C步骤中所述分化培养基中含有1.8-2.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0. 08-0. 12mg/L 6-苄氨基嘌呤、240-260mg/L T头孢霉素及28-32g/L蔗糖。
7.根据权利要求l所述的新型草坪草种质的创制方法，其特征在于 C步骤中所述生根培养基中含有240-260mg/L头孢霉素和18-22g/L蔗糖。
8.根据权利要求l所述的新型草坪草种质的创制方法，其特征在于 植物组织培养各个阶段的培养条件为诱导、继代、筛选均为暗培养；分化、芽增殖和生根 为光照培养，光强为3800-42001ux、 12-16h/d。
9.如权利要求l-8中任一项所述新型草坪草种质的创制方法制得的草坪草种质。
全文摘要
本发明提供了一种新型草坪草种质的创制方法及产品。本发明采用农杆菌介导法，经过愈伤诱导、浸染及筛选、分化、生根、移栽等步骤，用双价表达载体pBinAipt-bar对黑麦草进行遗传转化，得到既抗衰老又抗除草剂的黑麦草转基因植株。与现有技术相比，本发明将异戊烯基转移酶基因(ipt)与抗除草剂基因(bar)构建融合基因转入黑麦草中，获得了同时抗除草剂又延缓衰老的转基因植株，该植株表现出叶绿素含量及分蘖数增加，提供了一种更优良的草坪草种质资源。
文档编号A01H4/00GK101461326SQ20071020317
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月18日 优先权日2007年12月18日
发明者曾晓芳, 赵德刚, 黄傲楠 申请人:贵州大学