专利名称：一种花药特异表达启动子及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于植物遗传工程技术领域，具体涉及一种植物花药特异表达的启动子序列，含有该启动子的重组核酸序列、构建体和表达系统，及其驱动功能基因在植物花药内特异性表达的用途。
背景技术：
杂种优势的利用是提高作物产量和改良作物品质的重要途径之一。近年来在利用基因工程手段培育植物雄性不育系方面已有不少成功的报道。而花药特异表达启动子是构建雄性不育的重要元件，目前已报告的用于雄性不育表达载体构建的雄性器官特异表达启动子多为来自烟草或拟南芥等双子叶的启动子，这些启动子大都难以在单子叶农作物中表达。
RA8基因启动子是目前分离的少数几个水稻花药特异表达启动子之一，它不仅在花药绒毡层表达，而且在内层和连接处都有表达，除此外RA8在绒毡层降解后，在花粉囊仍然有表达，RA8基因可以归为花药晚期表达基因。目前报道的RA8基因启动子较少，加强RA8基因启动子的克隆和应用对利用基因工程创制水稻、小麦等单子叶未本科作物新型雄性不育系材料将有重要作用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种花药特异表达的启动子，该启动子的序列如下本发明的另一个方面，提供了一种含有上述启动子的重组核酸序列。本发明的另一个方面，提供了一种含有上述重组核酸序列的构建体。本发明的另一个方面，提供了一种含有上述构建体的表达系统。
本发明的另一个方面，提供了上述启动子、含有该启动子的重组核酸序列、构建体或表达系统在驱动功能基因在植物花药中特异表达的用途。
在本申请的说明书和权利要求书中使用的以下术语具有如下的含义
"变体"是指对一个目的DNA序列进行一个或者多个碱基的任何取代、变异、修饰、
替换、缺失或者添加所产生的序列，该序列仍然表现出类似于所述目的DNA序列的活性。"片段"是指基本DNA序列的一个或多个区域，其仍然具有类似于基本DNA序列的活性。
本发明人根据水稻花药特异表达iL48基因序列设计引物，从水稻(Oo^^W/^L.)品种日本晴中克隆得到水稻花药特异表达基因启动子序列7*2，该序列为基因翻译起始位点上游828 bp的片段，具有启动子特征序列TATA盒TATAAATA和真核生物启动子特征序列CAAT框。利用该启动子与报告基因GFP构建植物表达载体pl304-mp，采用基因枪法转化烟草花药、叶片和柱头。荧光显微镜下观察结果表明，T^2启动子在花药中有明显的表达，而在花药以外的其他组织和器官，如在转化的叶片和柱头中没有表达。因此，T^2是一个花药特异表达启动子，并且可以在烟草花药中有效表达，花药特异表达启动子可用于植物基因工程领域。
图1为花药特异启动子Tsp2扩增结果，其中M为DL2000marker， 1为以水稻日本晴为模板的PCR产物，2为空白模板对照；图2为Tsp2-GFP表达载体构建；
图3为含有Tsp2启动子载体转化烟草花药GFP瞬时表达结果；图4为未转化的烟草花药对照；
图5为含有Tsp2启动子载体转化烟草叶片GFP瞬时表达结果；图6为含有Tsp2启动子载体转化烟草柱头GFP瞬时表达结果。
具体实施方式
实施例l:rsp2启动子的克隆
1. 基因组DNA的提取采用CTAB法提取水稻品种日本晴基因组DNA。
2. 利用聚合酶链式反应(PCR)扩增7^2启动子
取约100ng基因组DNA作为模板，以引物raup (5 ' -AGCAATGGCGTGCAGGGAGTTTGATA-3')禾卩radn (5 ' -GGGAGGAGCTGGAAGGAGAAGATGGA-3 ')为引物，进行常规聚合酶链式反应(PCR)。具体体系和反应条件如下
iox反应缓冲液5uL
25mM MgCl24"
10mM脱氧核苷酸混合物(dNTP)1"
raup OOu M)2uL
radn (10uM)2uL
模板
Taq DNA聚合酶0.5 UL
总体积50 PL
PCR反应条件为94'C预变性5分钟，然后进入下列循环94'C变性1分钟，50'C复性l分钟，72'C延伸1分钟，共30个循环，最后72'C终延伸8分钟。
3. 片段的克隆取1 " LPCR纯化产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按TaKaRa公司产品pMD18-T vector试剂盒说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌JM109菌株，在含有氨苄青霉素U00ug/PL)的LB培养基平板上生长过夜，挑取抗性菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
4. 质粒DNA的提取碱法提取质粒DNA，并进行PCR鉴定和酶切分析。
5. 序列测定由重庆医科大学感染病重点实验室进行。PCR扩增得到800bp左右的特异性片段(见图l)，序列分析结果表明，该序列具有SEQ IDN0:1的特征。该片段长828bp，在726 bp处有启动子的特征序列TATA盒TATAAATA，在828 bp后为起始密码子ATG，与已知W8基因一致。此外，该序列还具有真核生物启动子的特征序列CAAT框。实施例2:表达载体的构建
1.根据上述序列，设计构建植物表达载体的引物
正向引物ragup: 5'-GCCGGTACCGCTACTAGGCGTTCG-3'
反向引物ragdn: 5'-GCCAGATCTGGGAGGAGCTGGAA-3'其中上游有《;wl酶切位点，下游有Sg/II酶切位点(下划线部分)。
以含有Z^2启动子的质粒DNA为模板，进行聚合酶链式反应。反应体系和程序同实 施例1 。
2. 取1 y L PCR纯化产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按TaKaRa公司产品 pMD18-T vector试剂盒说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌JM109菌株，在含有氨苄 青霉素(100ug/uL)的LB培养基平板上生长过夜，挑取抗性菌落，在LB液体培养基中 培养过夜。碱法提取质粒DNA，并进行PCR鉴定和酶切分析。
3. 用AT/wI和两个限制性内切酶将启动子从pMD18-T载体上切下，与相同酶酶 切下CaMV35S启动子的pCAMBIA1304连接。连接产物转化JM109细胞，然后在卡那青 霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析，将重组阳性 克隆命名为pl304-rap (见图2)。
实施例3:含有T印2启动子的表达载体基因枪法转化烟草
1. 采集烟草叶片和花蕾，剥离花药，用70%的乙醇将受体表面消毒，将叶片切成小 块，将花药切成2 3段，在无菌条件下，将样品置于不含激素MS固体培养基上，样品集 中在3cn^面积内。
2. 微弹载体的制备、质粒包被以及基因枪具体操作按BioRad公司Biolistic Partical Delivery System (PDS-1000/He)的说明书进行，可裂膜压力为1100Pa，耙材料至可裂膜距离 为9cm，按每枪8uL(质粒和金粉)混合液转化样品，每皿轰击2次。
实施例4: 7ip2启动子的活性检测
1. 基因枪轰击后的烟草花药、叶片和柱头继续培养48小时。
2. 于荧光体式镜下，选取488nm的蓝光激发，观察转化后组织和对照组织中GFP的 表达。结果发现绒毡层有绿色荧光的表达，而花药其它部位及叶片未见绿色荧光表达(见 图3、 4、 5、 6)。SEQUENCE LISTING
〈110〉中国科学院成都生物研究所
〈120〉 一种花药特异表达启动子及其用途
<130〉说明书
〈160〉 5
〈170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 828
〈212〉 腿
〈213〉 0ryza sativa
〈400〉 1
agc犯tggcgtgcagggagtttgatactttgatgcactag ctagctactaggcgttcgtt60
ccatgtcgctctcactgccgtgcg犯atgtgccatgattcctgcatgcatcatcgccaag120
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aaagtcctcaaggcg謀ggcctccatcttctccttccagctcctccc828
〈210〉 2
〈211〉 26
〈212〉 ■
<213〉 Oryza sativa
〈400〉 2
agc組ggcgtgcagggagtttgata26
〈210〉 3
<211〉 26
<212> DNA
〈213〉 Oryza sativa
〈400〉 3
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〈210〉 4
<211> 24
〈212〉 廳
〈213〉 Oryza sativa
〈400〉 4
gccggtaccgctactaggcgttcg24
〈210〉 5
〈211〉 23
<212〉 DNA
〈213〉 Oryza sativa
〈400〉 5
gccagatctgg犯2权利要求
1.一种花药特异性表达启动子及其功能等价物、变体或者片段，具有如下所示DNA序列的一部分AGCAATGGCGTGCAGGGAGTTTGATACTTTGATGCACTAGCTAGCTACTAGGCGTTCGTTCCATGTCGCTCTCACTGCCGTGCGAAATGTGCCATGATTCCTGCATGCATCATCGCCAAGATTATATTCCTCACCTTTTTTTTTCCTATTGGTCCTAGTTGTCTGGTTTGGGAGGTTAAAATTATGAAAAGCAGGTGCTGAGAAGCTAGCTGGTGAGAATTTTGAAGAATTTGAGTTTTAGTTCATTTTTCCAGATTCTACAAATTACAGATTTTTATAATTTAGGTAAAAAGCTGGACTGTTTGGGAGCTTCTGTCAGCCGGAGATTCTGTGAGAAGCTGCAGCTGCTAGAAGCTTCCCCAAACAGACCCCTAGTTGTACTCCAGCTGATCGATTCACTCTATTTTATATGCACCTTGCTCTCTAGCTTATCAAACGTAGCCAAGACTTGAATTTTAAAGCTTAAATTGATTTTGATGTTCTTTTCATCGTAATTCACTTACCGACCTTAGTCGGCATTTGAATTTTTAAAAATAATTTTTAGAGCTGATTTTGATTTTTTTTTCAGCGGAATTTATTTTCACGTATGTAAAAGTTTTACCTATAAATTATTAATTTTCAGCGGAGTAAGCATTAGTGTTATGGGTTATAATCATCTGGTATGCTTAAAATCTCTTTACTTGGACTTAGTTGGGACAATTGCTAATGCATTCTCGTGCCCATCTCTATAAATACGGCCTGCTAGCTTTGCTCTTGKATCTGCACACAAGAACTAGCTGCAAAGTCCTCAAGGCGAACGGCCTCCATCTTCTCCTTCCAGCTCCTCCC。
2.权^!J要求1所述的花药特异性表达启动子及其功能等价物、变体或者片段，具有如下 所示DNA序列CCC。
3. —种重组核酸序列，其含有权利要求1或2所述的启动子或其功能等价物、变体或者 片段。
4. 权利要求3所述的重组核酸序列，含有至少一种功能基因。
5. 权利要求4所述的重组核酸序列，其中的功能基因为抗病虫基因、抗逆性基因、核酸 结合蛋白基因、抗除草剂基因。
6. —种表达系统，其含有权利要求3或4或5中任一项重组核酸序列。
7. 权利要求1或2所述的花药特异性表达启动子及其功能等价物、变体或者片段在驱动 功能基因在植物花药内特异表达的用途。
8. 权利要求7所述的花药特异性表达启动子的用途，其特征是所述的功能基因为抗病虫 基因或抗逆性基因或核酸结合蛋白基因或抗除草剂基因。
全文摘要
本发明属于植物遗传工程技术领域。提供了一种植物花药特异表达的启动子序列，含有该启动子的重组核酸序列、构建体和表达系统，所述启动子能够驱动功能基因在植物花药内特异性表达。
文档编号A01H5/00GK101591661SQ200810044450
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月27日 优先权日2008年5月27日
发明者余懋群, 张金辉, 潘志芬, 邓光兵, 海 龙 申请人:中国科学院成都生物研究所